張晨晨，張東旭，張玉鳳，張愛(ài)杰，董世奇，韓 峰，邢界紅，樊慧蓉，劉昌孝

基于“化學(xué)物質(zhì)組-血中移行成分-藥動(dòng)學(xué)”的蒙藥暖宮七味丸質(zhì)量標(biāo)志物研究

張晨晨1, 2，張東旭1, 2，張玉鳳1, 2，張愛(ài)杰2，董世奇2，韓 峰3，邢界紅4，樊慧蓉2*，劉昌孝5

1. 天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617 2. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，天津 300192 3. 內(nèi)蒙古自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020 4. 內(nèi)蒙古蒙藥股份有限公司，內(nèi)蒙古 通遼 028000 5. 天津藥物研究院，天津 300462

研究蒙藥暖宮七味丸的化學(xué)物質(zhì)組、血中移行成分及藥動(dòng)學(xué)，篩選出暖宮七味丸潛在的質(zhì)量標(biāo)志物。綜合運(yùn)用UPLC-Triple-TOF-MS/MS、GC-MS技術(shù)結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)及對(duì)照品對(duì)比，鑒別暖宮七味丸的化學(xué)物質(zhì)組、血中移行成分；使用UPLC-Q-TRAP-MS/MS研究其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)特征。采用UPLC-Q-TOF-MS/MS鑒別出暖宮七味丸中的76個(gè)化學(xué)成分，采用GC-MS鑒別出35個(gè)化合物。經(jīng)大鼠ig給藥后鑒別出19個(gè)吸收進(jìn)入血中的原型成分，其中，沉香四醇、綠原酸、科羅索酸表現(xiàn)出良好的可測(cè)性，且具有明顯的藥動(dòng)學(xué)特征。沉香四醇、綠原酸、科羅索酸在暖宮七味丸的化學(xué)物質(zhì)組-血中移行成分-藥動(dòng)學(xué)研究中具有良好的可測(cè)性和可追溯性，可作為暖宮七味丸潛在的質(zhì)量標(biāo)志物。

暖宮七味丸；質(zhì)量標(biāo)志物；化學(xué)物質(zhì)組；血中移行成分；藥動(dòng)學(xué)；沉香四醇；綠原酸；科羅索酸

暖宮七味丸（蘇格木勒-7）出自蒙醫(yī)學(xué)經(jīng)典著作《觀者之喜》，由天門(mén)冬、手掌參、沉香、豆蔻、肉豆蔻、黃精和丁香組成，是治療婦科疾病的蒙醫(yī)傳統(tǒng)方劑[1]。其中，豆蔻、肉豆蔻、丁香和沉香均具有抑赫依作用；手掌參生精壯陽(yáng)、主治腎寒；黃精強(qiáng)腎固陽(yáng)；天門(mén)冬固精、鎮(zhèn)赫依[2]。全方中7味藥配伍合理，調(diào)赫依、具有溫暖子宮和驅(qū)寒止痛的功效[3]。臨床上常用于治療氣滯腰痛、小腹冷痛等疾病[2]。暖宮七味丸作為臨床治療痛經(jīng)的復(fù)方藥，現(xiàn)有研究多集中在藥效學(xué)和臨床方面的宏觀治療作用評(píng)價(jià)，其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚未明確，很大程度上限制了產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高及深入開(kāi)發(fā)。

中藥質(zhì)量標(biāo)志物（quality marker，Q-Marker）是劉昌孝院士[4]及其團(tuán)隊(duì)提出的作為反映中藥安全性和有效性的標(biāo)示性物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量控制的新概念。在其有效、特有、傳遞與溯源、可測(cè)和處方配伍的“五原則”基礎(chǔ)上，張鐵軍等[5]提出了復(fù)方中藥Q-Marker研究路徑和方法。蒙藥和中藥一樣大多為天然藥物，同樣有復(fù)雜的化學(xué)成分，甚至很多蒙藥和中藥的來(lái)源也相同。目前蒙藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系并不完善，中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究經(jīng)驗(yàn)對(duì)蒙藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化有著寶貴的借鑒意義。本研究利用LC-MS/MS、GC-MS技術(shù)對(duì)暖宮七味丸的化學(xué)物質(zhì)組、血中移行成分及其藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行研究，結(jié)合Q-Marker“五原則”探尋蒙藥暖宮七味丸潛在的質(zhì)量標(biāo)志物，以期為其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的提升提供依據(jù)和思路。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀（Exion AD UPLC）、Triple TOF 4600質(zhì)譜儀、QTRAP 5500質(zhì)譜儀均購(gòu)自美國(guó)AB SCIEX公司；KQ5200DE型超聲波清洗器（上海右一儀器有限公司）；LAB DANCER S000型渦旋振蕩器（美國(guó)IKA公司）；Legend Micro 17R高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo scientific公司）；7890A/5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)Aglient公司）；FD-2型冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥品

暖宮七味丸藥粉（內(nèi)蒙古蒙藥集團(tuán)）；色譜純甲醇（美國(guó)Fisher Scientific公司）；色譜純乙腈（美國(guó)Sigma公司）；色譜純甲酸（天津大茂化學(xué)試劑有限公司）；純化水（屈臣氏公司）；對(duì)照品去氫木香烴內(nèi)酯（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)L8AT-ABV5，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、綠原酸（甄準(zhǔn)生物科技有限公司，批號(hào)ZZS-20-114-A8，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、科羅索酸（甄準(zhǔn)生物科技有限公司，批號(hào)ZZS19110708，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、木香烴內(nèi)酯對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)TJTD-CTHA，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、沉香四醇（甄準(zhǔn)生物科技有限公司，批號(hào)ZZS-20-112-A4，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、丁香酚（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號(hào)D-064-161216，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、槲皮素（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110759-201105，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）；異欖香脂素（甄準(zhǔn)生物科技有限公司，批號(hào)ZZS-20-114-A2，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）；去氫二異丁香酚（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)L8AT-ABV5，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）；氯仿（天津大茂化學(xué)試劑有限公司）；石油醚（天津大茂化學(xué)試劑有限公司）；醋酸乙酯（天津大茂化學(xué)試劑有限公司）；羧甲基纖維素鈉（德國(guó)默克公司）。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)雌性SD大鼠，體質(zhì)量（200～220）g，6～7周齡，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào) SCXK（京）2021-0011。經(jīng)檢疫后安置在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所SPF動(dòng)物室，飼養(yǎng)于溫度（25±2）℃、相對(duì)濕度50%～60%、12 h/12 h晝夜交替光照的環(huán)境中，自由進(jìn)食飲水。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵循中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)的規(guī)定，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理號(hào)：IRM-DWLL-2021128。

2 方法

2.1 暖宮七味丸化學(xué)物質(zhì)組的UPLC-Q-TOF-MS/MS分析

2.1.1 液相條件 色譜柱為Diamonsil C18（2），200 mm×4.6 mm，5 μm；柱溫40 ℃；流動(dòng)相為甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫：0～2 min，65% B；2～5 min，65%～25% B；5～45 min，25%～5% B；45～50 min，5% B；50～51 min，5%～65% B；51～60 min，65% B；體積流量為0.4 mL/min；進(jìn)樣體積7.5 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 采用Triple TOF進(jìn)行分析，電噴霧離子源溫度：500 ℃；質(zhì)譜電壓：5500 V；去簇電壓DP：60 V；碰撞電壓EP：10 V；離子源氣體I和氣體II均為397.21 kPa；氣簾氣：241.32 kPa；采用多反應(yīng)檢測(cè)模式；設(shè)置全掃描范圍為/50～1000。

2.1.3 供試品藥液的制備 取暖宮七味丸藥粉，稱(chēng)取1.00 g置入燒杯，加入20 mL 75%甲醇水溶液，超聲1 h，靜置至室溫，以溶劑補(bǔ)足減失質(zhì)量，再以0.22 μm有機(jī)濾膜進(jìn)行濾過(guò)，得到質(zhì)量濃度為50 mg/mL暖宮七味丸提取液，再以50%甲醇溶液將其提取液稀釋10倍，稀釋后質(zhì)量濃度為5 mg/mL，吸取適量稀釋后提取液進(jìn)行LC-MS分析。

2.1.4 對(duì)照品溶液的制備 取對(duì)照品去氫木香烴內(nèi)酯、科羅索酸、槲皮素、木香烴內(nèi)酯、去氫二異丁香酚和沉香四醇粉末，各精密稱(chēng)取適量加甲醇溶液制成1.0 mg/mL的儲(chǔ)備液。精密吸取液體對(duì)照品100 μL丁香酚、100 μL異欖香脂素置入不同的量瓶中，加入甲醇溶液稀釋定容。分別取適量各稀釋后的對(duì)照品溶液，以0.22 μm有機(jī)濾膜濾過(guò)，濾液即為混合對(duì)照品溶液，待進(jìn)樣分析。

2.1.5 數(shù)據(jù)處理與分析 前期整理大量文獻(xiàn)，收集匯總暖宮七味丸中藥材所含成分的質(zhì)譜信息。取“2.1.3”項(xiàng)下暖宮七味丸供試品溶液進(jìn)UPLC-Triple-TOF-MS/MS測(cè)定，采集所有樣品的二級(jí)質(zhì)譜圖，將采集到的暖宮七味丸二級(jí)質(zhì)譜圖輸入Peakview2.2軟件中與中藥化合物數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息進(jìn)行比對(duì)，結(jié)合前期收集到的質(zhì)譜信息和對(duì)照品比對(duì)確定化合物的結(jié)構(gòu)。

2.2 暖宮七味丸化學(xué)物質(zhì)組的GC-MS分析

2.2.1 檢測(cè)方法

（1）色譜條件：色譜柱為HP-5MS（30 m×250 μm，0.25 μm）；氣化室溫度250 ℃；傳輸線(xiàn)溫度300 ℃；色譜柱溫度設(shè)置為程序升溫：起始溫度為50 ℃（保持3 min），以5 ℃/min升溫至120 ℃（保持1 min），再以10 ℃/min升溫至300 ℃（保持10 min）；載氣He；載氣體積流量為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為1 μL。

（2）質(zhì)譜條件：EI源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；掃描模式為Scan；掃描質(zhì)量范圍為/30～500，溶劑延遲3 min。

2.2.2 提取液的制備 稱(chēng)取暖宮七味丸粉末2.00 g，加入氯仿20 mL，密閉浸泡30 min后稱(chēng)定質(zhì)量，超聲40 min，待恢復(fù)至室溫后用氯仿補(bǔ)足減失質(zhì)量，得到100 mg/mL暖宮七味丸提取母液，將暖宮七味丸提取母液稀釋至5 mg/mL，濾過(guò)后進(jìn)GC-MS檢測(cè)。

2.2.3 定性定量方法

（1）定性分析：對(duì)檢測(cè)出的成分采用MS數(shù)據(jù)庫(kù)NIST11和保留時(shí)間進(jìn)行定性分析。數(shù)據(jù)庫(kù)篩選結(jié)果中要扣除掉柱流失峰等，最終將相似度≥90的化合物確認(rèn)為暖宮七味丸揮發(fā)性成分。

（2）定量分析：面積歸一化法對(duì)揮發(fā)油中各種化學(xué)組分的相對(duì)百分含量進(jìn)行定量分析，即以鑒定成分峰面積占所有鑒定成分面積之和的百分比作為定量結(jié)果。

2.3 暖宮七味丸血中移行成分的UPLC-Q-TOF-MS/MS分析

2.3.1 色譜方法 液相條件與質(zhì)譜條件同“2.1.1”和“2.1.2”項(xiàng)。

2.3.2 ig藥液的制備 精密稱(chēng)取30.00 g暖宮七味丸粉末，使用300 mL純甲醇超聲處理60 min得到藥液。將藥液抽濾后取濾液旋蒸濃縮，將旋蒸濃縮液用40 ℃氮?dú)膺M(jìn)一步濃縮，將濃縮物加入到10 mL 0.5% CMC-Na攪拌均勻得到含藥量為3 g/mL的浸膏，渦旋并存放于4 ℃冰箱，備用（給藥量為10 mL/kg，相當(dāng)于30 g/kg）。

2.3.3 分組、給藥及樣本采集 取SD雌性大鼠4只，給藥前12 h禁食不禁水。取空白血后以10 μL/g的容積ig給藥。在給藥后0.5、1、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)行目?jī)?nèi)眥取全血500 μL左右于抗凝處理過(guò)的離心管內(nèi)，離心取上清，冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.4 生物樣本處理方法 取“2.3.3”項(xiàng)中的凍存血漿，置于冰水中待其恢復(fù)為液體狀態(tài)，取250 μL血漿置于2 mL EP管中，加入1000 μL 70%乙腈甲醇溶液，離心，取上清液，氮吹，待濃縮至干燥后，加入125 μL復(fù)溶液，振搖混勻，離心，取上清進(jìn)行測(cè)定。

2.4 暖宮七味丸在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究

2.4.1 正離子模式檢測(cè)方法

（1）液相條件：色譜柱為Agilent C18（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）；柱溫40℃；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～0.5 min，40% B；0.5～3.0 min，40%～90% B；3.0～4.5 min，90% B；4.5～4.6 min，90%～40% B；4.6～6.5 min，40% B）；體積流量為0.2 mL/min；進(jìn)樣體積2.0 μL。

（2）質(zhì)譜條件：采用QTRAP 5500 質(zhì)譜進(jìn)行分析，電噴霧離子源溫度：550℃；質(zhì)譜電壓：5000 V；去簇電壓DP：80 V；碰撞電壓EP：10 V；離子源氣體I和氣體II均為413.69 kPa；氣簾氣：241.32 kPa；在正離子、MRM模式下檢測(cè)，用于定量的離子對(duì)為沉香四醇/319.3→300.9，維拉帕米（內(nèi)標(biāo)物）/455.2→165.1。

2.4.2 負(fù)離子模式檢測(cè)方法

（1）液相條件：色譜柱為Agilent C18（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）；柱溫40℃；流動(dòng)相A為10 mmol/L乙酸銨-水，流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫（0～3 min，40% B；3～4 min，40%～95% B；4～6.5 min，95% B；6.5～6.6 min，95%～40% B；6.6～8.0 min，40% B）；體積流量為0.2 mL/min；進(jìn)樣體積2.0 μL。

（2）質(zhì)譜條件：采用Triple TOF進(jìn)行分析，電噴霧離子源溫度：550℃；質(zhì)譜電壓：4500 V；去簇電壓DP：?170 V；碰撞電壓EP：?10 V；離子源氣體I和氣體II分別為310.26、379.21 kPa；氣簾氣：241.32 kPa；在負(fù)離子、MRM模式下檢測(cè)，用于定量的離子對(duì)為科羅索酸/471.3、綠原酸/353.1→191.0、甘草次酸（內(nèi)標(biāo)物）/469.3→355.1。

2.4.3 供試品藥液的制備 稱(chēng)取54 g暖宮七味丸粉末，使用540 mL甲醇超聲處理60 min得到藥液。將藥液抽濾過(guò)濾，取濾液旋蒸濃縮，將旋蒸濃縮液凍干得到凍干粉，在凍干粉中加入18 mL 0.5% CMC-NA攪拌均勻得到含藥量為3 g/mL的浸膏（30 mg/kg），渦旋并存放于4℃冰箱，備用。

2.4.4 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)取對(duì)照品沉香四醇、科羅索酸、綠原酸和內(nèi)標(biāo)維拉帕米、甘草次酸粉末適量，加甲醇溶液制成1 mg/mL的儲(chǔ)備液。精密吸取各對(duì)照品溶液適量，加50%甲醇溶液稀釋制成混合對(duì)照品溶液備用。沉香四醇質(zhì)量濃度為0.5、1、10、50、100、300、500 ng/mL，科羅索酸和綠原酸質(zhì)量濃度為1、5、10、30、60、100 ng/mL，內(nèi)標(biāo)維拉帕米、甘草次酸質(zhì)量濃度為100 ng/mL。

2.4.5 生物樣本采集 雌性SD大鼠6只，以1 mL/100 g的容積ig給藥。實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水，在給藥后0.083、0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、12、24、36、48 h進(jìn)行眼眶取血300 μL左右于抗凝處理過(guò)的離心管內(nèi)，離心取上清，冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.6 生物樣本處理方法 取“2.4.5”項(xiàng)下的凍存血漿，置于冰水中待其恢復(fù)為液體狀態(tài)，取50 μL血漿置于2 mL EP管中，加入50 μL內(nèi)標(biāo)溶液和100 μL 70%乙腈甲醇溶液，離心，取上清液，置于內(nèi)插管中，再次離心后進(jìn)行測(cè)定。

3 結(jié)果

3.1 暖宮七味丸化學(xué)物質(zhì)組分析

采用HPLC-Triple-TOF-MS技術(shù)對(duì)暖宮七味丸中主要化學(xué)成分進(jìn)行表征，通過(guò)Peakview 2.2軟件數(shù)據(jù)庫(kù)匹配，再結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品和相關(guān)文獻(xiàn)確定結(jié)構(gòu)式，從暖宮七味丸中鑒別出暖宮七味丸提取液，其結(jié)果見(jiàn)表1，暖宮七味丸藥液的基峰色譜圖見(jiàn)圖1。共鑒別出76個(gè)化合物。

3.1.1 氨基酸類(lèi)化合物 本實(shí)驗(yàn)共從暖宮七味丸中鑒別出氨基酸12種，主要來(lái)自于黃精和天冬，該類(lèi)分子易失去小分子碎片，如-COOH、-NH3。在正離子模式下，以瓜氨酸舉例進(jìn)行裂解規(guī)律分析（圖2-A和圖3-A），在MS2鏡像圖中瓜氨酸的碎片離子峰有/159.076 7 [M＋H－NH3]+和/113.070 5 [M＋H－NH3－COOH]+即為瓜氨酸分子脫去-NH3和脫去-COOH及-NH3的碎片離子。依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[6]以及數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)可以判定該化合物為瓜氨酸。

3.1.2 揮發(fā)油類(lèi)化合物 本實(shí)驗(yàn)共從暖宮七味丸中鑒別出揮發(fā)油類(lèi)20個(gè)，主要來(lái)自于沉香、丁香、白豆蔻和肉豆蔻。在正離子模式下（＋ESI），以沉香四醇舉例進(jìn)行裂解規(guī)律分析（圖2-B、3-B），該化合物準(zhǔn)分子離子峰/319.110 0 [M＋H]+，在MS2鏡像圖中，其主要碎片離子峰有/301.105 8 [M＋H－H2O]+和/283.095 7 [M＋H－H2O－H2O]+。經(jīng)與對(duì)照品比對(duì)以及數(shù)據(jù)庫(kù)匹配，初步鑒定該化合物為沉香四醇。

3.1.3 萜類(lèi)化合物 本實(shí)驗(yàn)共從暖宮七味丸中鑒別出萜類(lèi)化合物10種，主要來(lái)自于丁香，該類(lèi)化合物易發(fā)生開(kāi)環(huán)裂解，如果環(huán)內(nèi)存在雙鍵則易發(fā)生RDA裂解。在正離子模式下，以去氫木香烴內(nèi)酯舉例進(jìn)行裂解規(guī)律分析，該化合物準(zhǔn)分子離子峰為/231.138 2 [M＋H]+，在MS2鏡像圖圖中，其特征碎片離子峰有/213.127 1 [M＋H－H2O]+、/185.131 9 [M＋H－H2O－CO]+、/157.100 6 [M＋H－C3H6O2]+、/142.078 0 [M＋H－C4H9O2]+、/128.061 2 [M＋H－C5H11O2]+、/195.116 3 [M＋H－H4O2]+、/143.085 3 [M＋H－C4H8O4]+、/180.092 6 [M＋H－C4H3]+、/175.075 0 [M＋H－C4H8]+、/165.069 7 [M＋H－C5H6]+。經(jīng)與對(duì)照品比對(duì)和數(shù)據(jù)庫(kù)匹配，可以鑒定該化合物為去氫木香烴內(nèi)酯。

表1 UPLC-Q-TOF-MS法分析暖宮七味丸化學(xué)成分及入血成分

Table 1 UPLC-Q-TOF-MS identification results of chemical constituents absorbed into blood of Nuangong Qiwei Pills

編號(hào)tR/min理論值(m/z)實(shí)測(cè)值(m/z)分子式離子模式誤差(×10?6)MS/MS碎片離子鑒定成分來(lái)源 14.38176.103 5176.102 9C6H13N3O3[M＋H]+?0.59159.076 7, 113.070 5瓜氨酸[6]T 24.86182.081 7182.081 2C9H11NO3[M＋H]+0.09147.043 1, 136.075 8, 119.048 5酪氨酸[7]T 34.44106.050 4106.049 4C3H7NO3[M＋H]+?4.7660.043 3L-絲氨酸[6]T 44.48120.066 1120.065 3C4H9NO3[M＋H]+?1.8856.047 6D-蘇氨酸[6]T 54.65116.071 2116.070 4C5H9NO2[M＋H]+?1.12116.072 6, 70.064 3脯氨酸[8]T 66.72166.086 8166.086 3C9H11NO2[M＋H]+?0.09120.080 6, 118.065 1苯丙氨酸[7]T 74.96132.102 5132.101 8C6H13NO2[M＋H]+?0.8186.096 5, 69.069 3 異亮氨酸[8]T 83.69147.113 3147.112 7C6H14N2O2[M＋H]+?0.4084.080 0, 68.980 7, 56.048 7賴(lài)氨酸[8]T 94.49148.061 0148.060 4C5H9NO4[M＋H]+?0.3784.044 3, 56.049 2谷氨酸[8]T 103.71175.118 9175.119 0C6H14N4O2[M＋H]+0.3070.063 9, 60.054 8精氨酸[7]T 117.40205.097 7205.097 0C11H12N2O2[M＋H]+?0.74159.092 4, 146.057 1色氨酸[8]T 124.59134.045 2134.044 2C4H7NO4[M＋H]+?4.57118.085 7, 88.040 4, 74.023 3天冬氨酸[6]T 1311.23287.113 1287.126 8C13H18O7[M＋H]+4.97212.077 3天麻素S 1418.77251.107 2251.106 6C17H14O2[M＋H]+?0.08160.051 0, 91.053 82-(2-苯乙基)色酮*[9]C 15a36.62473.347 9473.362 4C30H48O4[M＋H]+?0.24437.339 9, 409.344 6, 249.185 0, 203.179 6, 189.163 9科羅索酸*[10]DX 1613.15237.185 5237.184 8C15H24O2[M＋H]+?0.37189.124 6, 135.117 5, 117.067 5, 107.086 7莪術(shù)醇S 13.11235.186 5235.185 5C15H24O2[M－H]??0.47117.067 5, 107.086 7 17a19.93233.153 6233.153 5C15H20O2[M＋H]+?0.02145.101 0, 131.084 9, 119.083 5土木香內(nèi)酯*[11]DX 19.88231.153 9231.154 6C15H22O2[M－H]??0.11128.064 1, 119.082 1, 105.071 2 18a9.97319.118 2319.117 3C17H18O6[M＋H]+?0.94301.105 8, 283.095 7沉香四醇*[12]C 1920.85281.117 2281.117 3C18H16O3[M＋H]+0.45190.062 5, 175.039 0, 151.039 2, 124.052 16-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮*[9]C 2016.75311.128 3311.127 7C19H18O4[M＋H]+?0.18220.072 1, 205.049 1, 181.049 5, 177.055 0, 154.062 86-甲氧基-2-(3-甲氧基-2-苯乙基)色酮*[9]C 2113.21313.107 6313.106 8C18H16O5[M＋H]+?0.80273.143 9, 233.152 7, 187.148 0, 163.074 1, 147.116 9, 121.064 36,8-二羥基-2-(2(3'-甲氧基-4'-羥基苯乙基))色酮*[9]C 22a10.24303.108 0303.108 0C15H10O7[M＋H]+5.10229.060 8, 153.019 0, 137.024 1槲皮素[13]D 2327.46595.166 3595.164 7C27H30O15[M＋H]+?1.81271.060 3木蝴蝶苷BS 2411.22287.128 3287.127 5C15H10O6[M＋H]+?0.83269.116 6木犀草素[14]D 2512.31249.148 5249.148 4C15H20O3[M＋H]+?0.34183.077 9, 178.078 4, 165.068 6, 155.084 4, 141.069 0, 128.062 6, 115.053 8, 105.069 5丁香內(nèi)酯D 2613.52195.101 6195.101 7C10H10O4[M＋H]+0.87177.054 0, 89.035 8異阿魏酸[15]DX 274.68361.165 1361.152 7C20H24O6[M＋H]+?3.40327.119 4, 311.086 4, 221.079 6, 153.017 6落葉松脂素[15]N 2822.86359.149 5359.149 5C20H22O6[M＋H]+?3.27359.231 6, 343, 3 060, 326.280 0, 227.176 0, 210.148 5松脂酚N 29a23.95327.159 6327.159 1C20H22O4[M＋H]+0.07286.119 4, 271.095 5, 257.081 5, 239.070 1去氫二異丁香酚[16]R, D 3016.10209.117 8209.117 2C12H16O3[M＋H]+0.03153.054 2, 138.029 2, 110.035 2欖香脂素[15]R, D 3114.42345.169 7345.169 9C20H24O5[M＋H]+0.70203.107 5, 188.080 2, 171.083 7, 151.074 9, 137.059 6, 133.065 9, 122.034 9fragransinA2*[17]R 3216.33357.180 8357.169 3C21H24O5[M＋H]+?0.90193.084 6, 165.090 1, 161.057 8, 150.066 2,fragnasol C[17]R

續(xù)表1

續(xù)表1

編號(hào)tR/min理論值(m/z)實(shí)測(cè)值(m/z)分子式離子模式誤差(×10?6)MS/MS碎片離子鑒定來(lái)源 654.94193.071 2193.070 5C7H12O6[M＋H]+?0.60111.042 0, 83.048 9, 69.032 3奎寧酸[7]DX 6613.85376.188 5376.183 9C21H27O6[M＋H]+?4.52357.166 3, 314.118 5, 222.122 2, 203.089 3, 181.087 3, 167.069 9, 151.075 9, 137.058 8肉豆蔻異木脂素[18]R, D 67a14.14165.091 5165.090 9C10H12O2[M＋H]+?0.27137.063 1, 105, 692丁香酚*[26]DX 6830.27279.232 5279.231 2C18H30O2[M－H]??3.34173.136 8, 95.085 8, 67.053 5亞油酸[13]DX 6936.62495.345 6495.344 7C30H48O4[M＋Na]+0.42451.356 5常春藤皂苷元C 7021.32231.138 5231.137 9C15H18O2[M＋H]+?0.40213.128 1, 203.143 4白術(shù)內(nèi)酯DX 718.16355.102 9355.102 4C16H18O9[M＋H]+0.13181.052 0, 145.028 7綠原酸*[27]DX 7233.55325.141 0325.143 1C18H22O4[M＋Na]+?0.53203.108 1, 188.083 1, 171.060 4, 149.059 0去甲二氫愈創(chuàng)木脂酸[25]R 7310.29285.279 3285.288 4C16H12O5[M＋H]+0.96256.063 0, 240.231 5金合歡素*C 7416.10209.117 7209.117 2C12H16O3[M＋H]+0.04179.094 1, 151.066 3α-細(xì)辛腦*N 757.24220.118 4220.118 0C9H17NO5[M＋H]+0.30184.094 3, 170.058 2, 142.085 5, 118.064 2, 90.054 2泛酸[28]N 7610.13303.012 9303.013 7C14H6O8[M＋H]+0.75242.988 1, 182.963 8鞣花酸[29]C

R-肉豆蔻 D-豆蔻 DX-丁香 S-手掌參 C-沉香 H-黃精 T-天門(mén)冬 N-未知來(lái)源 a-經(jīng)過(guò)對(duì)照品比對(duì) *-入血成分

R-D-DX-S-(L.) R. Br. C-H-T-(Lour.) Merr. N-unknown source a-standard comparison *-ingredients absorbed into blood

圖1 正、負(fù)離子模式下暖宮七味丸提取液基峰色譜圖(BPC圖)

3.1.4 有機(jī)酸類(lèi)化合物 本實(shí)驗(yàn)共從暖宮七味丸中鑒別出有機(jī)酸類(lèi)化合物10種，如科羅索酸、熊果酸、異阿魏酸和綠原酸等。在正離子模式下，以科羅索酸舉例進(jìn)行裂解規(guī)律分析（圖2-C、3-C），化合物準(zhǔn)分子離子峰為/473.355 3 [M＋H]+，在MS2鏡像圖中，其主要碎片離子有/455.348 0 [M＋H－H2O]+、/437.339 9 [M＋H－2H2O]+、/249.185 0 [M＋H－C14H24O2]+、/409.344 6 [M＋H－H2O－HCOOH]+、/391.335 3 [M＋H－2H2O－HCOOH]+、/235.169 5 [M＋H－C14H24O2－CH4]+、/203.176 9 [M＋H－C14H24O2－HCOOH]+、/189.163 7 [M＋H－C14H24O2－CH2－HCOOH]+。經(jīng)與對(duì)照品比對(duì)和數(shù)據(jù)庫(kù)匹配，可以鑒定該化合物為科羅索酸。

3.1.5 色酮類(lèi)化合物 本實(shí)驗(yàn)共從暖宮七味丸中鑒別出5種色酮，分別為2-(2-苯乙基)色酮、6-甲氧基-2-(3-甲氧基-2-苯乙基)色酮、6,8-二羥基-2-(2(3-甲氧基-4-羥基苯乙基))色酮、6-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮、6-羥基-2-(2-苯乙基)色酮。該類(lèi)化合物主要來(lái)自于沉香，易失去苯環(huán)、H2O等分子。在正離子模式下，以6-羥基-(2-苯乙基)色酮舉例進(jìn)行裂解規(guī)律分析，該化合物準(zhǔn)分子離子峰為/267.066 7 [M＋H]+，主要碎片離子峰有/176.046 5 [M＋H－C7H6]+、137.022 9 [M＋H－C10H10]+和/110.035 8 [M＋H－C10H10－CO]+。經(jīng)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)[9]可以判定該化合物為6-羥基-2-(2-苯乙基)色酮。

3.2 GC-MS檢測(cè)結(jié)果

取“2.2.2”項(xiàng)中的暖宮七味丸氯仿提取液進(jìn)行GC-MS檢測(cè)，得到暖宮七味丸氯仿提取液的總離子流圖（圖4）。將得到化合物質(zhì)譜信息導(dǎo)入NIST11數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行鑒別，并按“2.2.3”項(xiàng)所述的方法進(jìn)行定量。結(jié)果共確定了35個(gè)化合物，占總峰面積的85%，包括有肉豆蔻酸、角鯊烯、鄰苯二甲酸二甲酯、-檸檬烯等，結(jié)果見(jiàn)表2。

圖3 瓜氨酸(A)、沉香四醇 (B)、科羅索酸 (C) 的二級(jí)質(zhì)譜圖及其對(duì)照品比對(duì)鏡像圖

3.3 暖宮七味丸血中移行成分研究

通過(guò)分析大鼠空白血漿、給予大鼠暖宮七味丸后的血漿以及暖宮七味丸提取液的總離子流圖，比較藥液（圖1）和空白對(duì)照血漿、給藥組血漿的保留時(shí)間以及二級(jí)碎片，從中鑒別出19個(gè)血中移行成分，結(jié)果見(jiàn)圖5和表1。

3.4 暖宮七味丸的藥動(dòng)學(xué)研究

沉香四醇是沉香中的主要成分，綠原酸和科羅索酸均來(lái)源于丁香，為研究其在體內(nèi)的代謝行為，建立了暖宮七味丸中沉香四醇、綠原酸、科羅索酸的HPLC-MS/MS檢測(cè)定量方法，并以此方法評(píng)價(jià)大鼠血漿中3種成分的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)行為，為后續(xù)暖宮七味丸的體內(nèi)研究提供參考。

圖4 暖宮七味丸揮發(fā)性成分的總離子流色譜圖

表2 暖宮七味丸揮發(fā)油GC-MS鑒定結(jié)果

Table 2 GC-MS identification results of volatile oil in Nuangong Qiwei Pill

峰號(hào)tR/minCAS分子式化合物相對(duì)分子質(zhì)量匹配值相對(duì)含量/% 126.27544-63-8C14H28O2肉豆蔻酸228.219930.67 235.24111-02-4C30H50角鯊烯410.39994.66 331.13629-78-7C17H36正十七烷240.28971.26 431.96646-31-1C24H50正二十四烷338.39971.06 521.68131-11-3C10H10O4鄰苯二甲酸二甲酯194.06964.65 63.58108-88-3C7H8甲苯92.069523.38 710.105989-27-5C10H16D-檸檬烯136.12950.96 828.1857-10-3C16H32O2棕櫚酸256.24952.59 929.85112-80-1C18H34O2油酸282.26952.69 1033.52629-92-5C19H40癸烷268.31950.32 1137.5757-88-5C27H46O膽固醇386.36950.12 1219.7097-53-0C10H12O2丁香酚164.08930.33 1339.5655103-80-5C22H35BrO21-溴-20-甲基孕烷-5-烯-3β-醇395.19930.27 148.6662-53-3C6H7N苯胺93.06912.41 1514.0717865-32-6C9H20O2Si環(huán)己基二甲氧基甲基硅烷188.12910.71 1622.7496-76-4C14H22O2,4-二叔丁基苯酚206.17911.43 1729.35629-94-7C21H44二十烷296.34910.38 1832.26119-47-1C23H32O22,2'-亞甲基二(4-甲基-6-叔丁基苯酚)340.24910.47 1933.20117-81-7C24H38O4鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯390.28911.00 2022.2017312-82-2C13H284,6-二甲基十一烷184.22900.06 2124.006627-88-9C11H14O34-烯丙基-2,6-二甲氧基苯酚194.09900.07 2230.267225-66-3C19H407-己基十三烷268.50870.68 2322.304292-19-7C12H25I1-碘十二烷296.23860.98 2434.676422-86-2C24H38O4對(duì)苯二甲酸二(2-乙基己基)酯390.28830.13 2535.9720797-80-2C19H14O7曲霉毒素354.07810.20 265.65106-42-3C8H10對(duì)二甲苯106.08800.79 2710.987045-71-8C12H262-甲基十一烷170.20800.47 2817.441000309-14-1C6H14O3S亞硫酸己基戊酯236.15800.75 2925.1513909-73-4C11H14O42',3',4'-三甲氧基苯乙酮210.09800.23 3023.0062238-11-3C13H282,3,5-三甲基癸烷184.22780.14 3135.506627-88-9C11H14O34-烯丙基-2,6-二甲氧基苯酚194.09760.39 3216.981000309-32-8C??H??O?草酸異己基戊酯244.17720.16 3327.916386-38-5C18H28O33-(3,5-二叔丁基-4-羥基苯基)丙酸甲酯292.20720.08 3428.091000309-17-9C19H14O7十二烷基磺酸丁酯306.22720.27 3529.73544-76-3C16H34十六烷226.27720.28

圖5 正離子模式下暖宮七味丸入血成分色譜圖

Fig. 5 Chromatogram of blood components of Nuangong Qiwei Pill under positive ion mode

3種成分的血藥濃度-時(shí)間曲線(xiàn)如圖6所示。科羅索酸在給藥后出現(xiàn)雙峰，可能與肝腸循環(huán)或者在胃腸道有不同的吸收部位有關(guān)。

4 討論

本研究首次采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)從暖宮七味丸中快速分析鑒定出76個(gè)化學(xué)成分，采用GC-MS技術(shù)對(duì)蒙藥暖宮七味丸中的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析鑒定，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)比較共鑒定出35個(gè)化合物。經(jīng)大鼠ig給藥后檢測(cè)其入血成分，以文獻(xiàn)、標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)、質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)相結(jié)合的方式，共分析鑒定出19個(gè)吸收進(jìn)入血中的原型成分，包括沉香四醇、6-甲氧基-2-(3′-甲氧基-2-苯乙基)色酮、2-(2-苯乙基)色酮、科羅索酸、肉豆蔻醚、肉豆蔻木脂素、6-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮、6-羥基-(2-苯乙基)色酮、鄰苯二甲酸二丁酯、綠原酸、土木香內(nèi)酯、丁香酚等。在進(jìn)行了暖宮七味丸的化學(xué)物質(zhì)組的辨識(shí)、入血成分的分析后，又進(jìn)一步利用UPLC-QTRAP-MS技術(shù)研究其藥動(dòng)學(xué)，發(fā)現(xiàn)沉香四醇、科羅索酸和綠原酸3種成分具有較明顯的藥動(dòng)學(xué)特征。

物質(zhì)基礎(chǔ)和藥效是研究Q-Marker的重要節(jié)點(diǎn)，而藥物成分的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)行為是鏈接物質(zhì)基礎(chǔ)和藥效的“橋梁”，對(duì)成分體內(nèi)暴露情況及其藥代動(dòng)力學(xué)的研究能夠加強(qiáng)物質(zhì)基礎(chǔ)和藥效之間的關(guān)聯(lián)性[5,30]。通過(guò)研究暖宮七味丸的化學(xué)物質(zhì)組、血中移行成分、藥動(dòng)學(xué)，發(fā)現(xiàn)沉香四醇、科羅索酸和綠原酸具有很好的可測(cè)性和可追溯性。其中，沉香四醇來(lái)源于沉香，現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)表明沉香中的2(-2-苯乙基)色酮類(lèi)物質(zhì)對(duì)乙酰膽堿酯酶呈不同程度的抑制作用，且沉香提取物具有鎮(zhèn)靜催眠、麻醉的作用[31]；研究表明沉香四醇是沉香中特有且有效的活性物質(zhì)[32]?？屏_索酸、綠原酸來(lái)源于丁香，丁香在中醫(yī)上屬于溫里藥，具有溫中、暖腎、降逆的功效，在蒙醫(yī)中是鎮(zhèn)“赫依”藥物，稱(chēng)為命脈良藥[33-34]?，F(xiàn)代研究認(rèn)為丁香具有抗菌、消炎、鎮(zhèn)痛以及對(duì)消化系統(tǒng)的保護(hù)作用[35]。以上這3種化學(xué)成分均表現(xiàn)出良好的可測(cè)性和藥動(dòng)學(xué)特征，可能是暖宮七味丸潛在的Q-Marker。

本研究借鑒中藥Q-Marker的研究經(jīng)驗(yàn)，經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)研后采用LC-MS/MS及GC-MS技術(shù)對(duì)蒙藥暖宮七味丸的化學(xué)物質(zhì)組、血中移行成分、藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行研究，從可測(cè)性的角度尋找暖宮七味丸的Q-Marker，結(jié)果顯示，沉香四醇、綠原酸和科羅索酸可能是暖宮七味丸潛在的Q-Marker。本研究明確了暖宮七味丸的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)及入血的原型成分，篩選出3種可能的質(zhì)量標(biāo)志物，為暖宮七味丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制的指標(biāo)成分選擇提供了參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Quality markers of Mongolian medicine Nuangong Qiwei Pill based on “chemical composition-blood migration component-pharmacokinetics”

ZHANG Chen-chen1, 2, ZHANG Dong-xu1, 2, ZHANG Yu-feng1, 2, ZHANG Ai-jie2, DONG Shi-qi2, HAN Feng3, XING Jie-hong4, FAN Hui-rong2, LIU Xiao-chang5

1. Tianjin university of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China 2. Institute of Radiation Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin 300192, China 3. Inner Mongolia Institute for Drug Control, Hohhot 010020, China 4. Inner Mongolia Mongolian Medicine Co., Ltd., Tongliao 028000, China 5. Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300462, China

To study the chemical composition, blood migration components and pharmacokinetics and screen the potential quality markers of Nuangong Qiwei Pill (暖宮七味丸), a Mongolian medicine.The UPLC-Triple-TOF-MS/MS and GC-MS technologies were used in combination with the database and the comparison of standard products to identify the chemical composition and blood migration components of Nuangong Qiwei Pill; UPLC-Q-TRAP-MS/MS was used to study its pharmacokinetics.A total of 76 chemical components were identified by UPLC-Q-TOF-MS/MS and 35 compounds were identified by GC-MS. After intragastric administration in rats, 19 prototype components that were absorbed into the blood were identified. Among them, agarotetrol, chlorogenic acid and corosolic acid showed good testability and obvious pharmacokinetic characteristics.Agarotetrol, chlorogenic acid and corosolic acid may be potential quality markers of Nuangong Qiwei Pill due to its good measurability and traceability in chemical composition-blood migration component-pharmacokinetics analysis.

Nuangong Qiwei Pill; quality markers; chemical components; blood migration components; pharmacokinetics; agarotetrol; chlorogenic acid; corosolic acid

R284.1

A

0253 - 2670(2023)18 - 5855 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.18.004

2023-04-12

內(nèi)蒙古自治區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目（2020GG0199）；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2018YFC1708203）

張晨晨，女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩巹?dòng)學(xué)。E-mail: z18340077587@163.com

樊慧蓉，女，研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樗巹?dòng)學(xué)。E-mail: fanhr99@163.com

[責(zé)任編輯 王文倩]