謝 飛，劉 瀅，郭致君，范祥偉，魏 博，張 樂，劉雪連*

（ 1. 北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司，北京 100192 ；2. 北京市飼料安全生物調(diào)控工程技術(shù)研究中心，北京 100192 ）

隨著我國經(jīng)濟(jì)以及食品行業(yè)發(fā)展，豬肉等各類肉類食品的需求與日俱增，而在豬養(yǎng)殖、屠宰和零售過程中極易受到沙門氏菌（Salmonella）的污染。沙門氏菌是主要的人畜共患病的病原之一，目前國際上已發(fā)現(xiàn)約2 500 個(gè)血清型，中國有200多種，是許多國家發(fā)生食源性細(xì)菌腸炎的主要原因之一[1]。其中鼠傷寒沙門氏菌于免疫功能正常的人體內(nèi)可引起自限性胃腸炎，在免疫功能低下的人體內(nèi)引發(fā)敗血癥，而傷寒沙門氏菌則可引起傷寒[2-3]。

為維護(hù)我國動(dòng)物源性食品安全和公共衛(wèi)生安全，本研究在京津冀地區(qū)豬飼料廠、豬養(yǎng)殖場、豬屠宰場、超市、農(nóng)貿(mào)市場等采集飼料、豬肛拭子、水、豬肉等樣品5 024份，采用國標(biāo)GB 4789.4—2016[4]的方法分離篩選得到沙門氏菌菌株484株，通過抗菌藥物濃度梯度法測定了沙門氏菌對12類22種抗菌藥物的敏感性，得到對7類以上藥物的多重耐藥菌株50株；通過分子生物學(xué)、全基因組測序技術(shù)等對50株多重耐藥菌株的耐藥基因進(jìn)行了分析和預(yù)測，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，建立了包含50株具有多重耐藥特點(diǎn)的沙門氏菌全基因組數(shù)據(jù)庫，以期為沙門氏菌引起的疾病控制和指導(dǎo)用藥提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

本試驗(yàn)采集京津冀地區(qū)豬飼料、豬養(yǎng)殖場、豬屠宰場和豬肉零售等4個(gè)環(huán)節(jié)的樣本，合計(jì)5 024份。其中飼料環(huán)節(jié)分別采集蛋白原料和配合飼料樣本（521 份）；養(yǎng)殖環(huán)節(jié)采集豬的肛拭子（2 703 份，1 頭豬1 份），水樣分別采集水井、儲水箱和飲水頭樣本（25 份）；屠宰環(huán)節(jié)采集預(yù)冷后分割前的豬胴體樣本（322份，1頭豬1份，頸部）；零售環(huán)節(jié)則以超市和農(nóng)貿(mào)市場的生鮮肉和豬肉餡作為樣本（1 453份）。樣品放入無菌PBS 緩沖液中保存，以裝有冰袋泡沫箱封閉，24 h內(nèi)低溫送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行預(yù)增菌處理。

1.2 試驗(yàn)菌株

大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922、腸炎沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株CVCC3377 和鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC700408均來自飼用微生物工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.3 儀器與試劑

主要儀器：SPX-250B培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)醫(yī)療設(shè)備廠）、CF16RXⅡ低溫冷凍離心機(jī)（日立公司）。

主要試劑：緩沖蛋白胨水（buffered peptone water，BPW）、四硫磺酸鈉煌綠（tetrathionate broth base，TTB）、亞硒酸鹽胱氨酸（selenite cystine，SC）、亞硫酸鉍（bismuth sulphite，BS）、木糖賴氨酸脫氧膽鹽（xylose lysine desoxycholate，XLD）均購自北京奧博星生物科技有限公司；基因組抽提試劑盒購自寶生物工程公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 樣品沙門氏菌分離

采用國標(biāo)GB 4789.4—2016 的方法分離沙門氏菌：將采集的樣品在超凈工作臺加入含無菌BPW培養(yǎng)基的試管中，37 ℃ 180 r/min 振蕩培養(yǎng)8～18 h，次日分別吸取1 mL BPW 增菌液至10 mL 的TTB 和10 mL 的SC 增菌液中，分別置于42 ℃培養(yǎng)18～24 h和37 ℃培養(yǎng)18～24 h。培養(yǎng)后的TTB增菌液分別劃線接種于BS瓊脂平板，SC增菌液劃線接種于XLD瓊脂平板，于37 ℃分別培養(yǎng)40～48 h（BS瓊脂平板）或18～24 h（XLD瓊脂平板）。

1.4.2 耐藥性分析

根據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）[5]標(biāo)準(zhǔn)，選取頭孢曲松（CRO）、頭孢噻呋（CEF）、頭孢喹肟（CEQ）、氨曲南（ATM）、慶大霉素（GEN）、阿米卡星（AMK）、阿莫西林（AMX）、碳青霉烯（IMP）、亞胺培南（IPM）、四環(huán)素（TET）、多西環(huán)素（DOX）、環(huán)丙沙星（CIP）、恩諾沙星（ENO）、左氧氟沙星（LEV）、萘啶酸（NAL）、氯霉素（CHL）、氟苯尼考（FFC）、磷霉素（FOS）、多黏菌素（BPB）、阿奇霉素（AZM）、喹乙醇（OLA）、乙酰甲喹（MEQ）等22種常用抗菌藥物，以大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25922作為質(zhì)控菌株?？咕幬锿ㄟ^微量肉湯稀釋法進(jìn)行稀釋，將篩出的沙門氏菌液態(tài)培養(yǎng)和接種，采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行抗菌藥物敏感性試驗(yàn)，37 ℃孵育18～24 h，記錄菌落生長情況。

1.4.3 基因組提取與檢測

按照基因組抽提試劑盒試驗(yàn)步驟，將耐7 種以上抗菌藥物的50株樣品提取好的基因組放在冰上融化，吹打混勻離心待檢測。采用瓊脂糖凝膠電泳（膠濃度1%，電壓150 V）檢測樣品的完整性，用于構(gòu)建DNA文庫[6-7]。

1.4.4 全基因組測序、組裝及預(yù)測

測序：樣本按照全基因組測序要求，送至深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行全基因組測序；細(xì)菌基因組用PacBio Sequel Ⅱ平臺進(jìn)行de novo 測序，測序得到的原始數(shù)據(jù)（raw data），對illumina測序平臺的數(shù)據(jù)進(jìn)行污染和低質(zhì)量過濾，過濾掉500 bp以下的片段，得到50株沙門氏菌的有效數(shù)據(jù)（clean data）。

組裝：基于測序平臺獲得有效數(shù)據(jù)組裝使用SPAdes軟件，經(jīng)過多次調(diào)整獲得最優(yōu)組裝結(jié)果。

基因組分析組裝完成后，分析樣品基因組的成分，針對編碼基因序列進(jìn)行CARD 數(shù)據(jù)庫的功能注釋。將測到的50 株豬源沙門氏菌全基因組數(shù)據(jù)上傳至NCBI，編號為PRJNA673054。

1.4.5 耐藥基因分析

基于耐7 種以上抗菌藥物的50 株沙門氏菌的全基因組測序結(jié)果，耐藥基因分析使用抗性基因數(shù)據(jù)庫（comprehensive antibiotic research database，CARD），共檢測到43 種耐藥相關(guān)基因，包括β-內(nèi)酰胺類：blaTEM-1、blaCTX、blaOXA-1、blaOXA-10、pbp1A、blaIMP、blaDHA-1；氨基糖苷類：aac(3)-Iva、aac(6')-Iaa、aadA1、aadA8b、aph(3')-Ia、aph(3'')-Ib、aph(3')-Iia、aac(3)-Iid；大環(huán)內(nèi)酯類：erm(B)、erm(T)；多黏菌素類：mcr-1、mcr-3、mcr-5；環(huán)素類：tet(A)、tet(B)；磺胺類：sul1、sul2、sul3；喹諾酮類：oqxB、oqxA、gyrA(S83F)、parC(S80R)、qnrD1、qnrS1、gyrA(D87Y)；磷霉素類：Fos3、FosA；氯霉素類：catA1、catB4、catB8、cmlA1、floR；三甲氧芐二氨嘧啶類：dfrA12；利福平類：arr-3；氨基糖苷類和喹諾酮類：aac(6')-Ib-cr。

1.4.6 進(jìn)化樹分析

基于全基因組序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。系統(tǒng)進(jìn)化樹（phylogenetic tree）是表明被認(rèn)為具有共同祖先的各物種相互間演化關(guān)系的樹。wgMLST 稱為全基因組多位點(diǎn)序列分型（whole genome multilocus sequence typing），是多位點(diǎn)序列分型（MLST）的一個(gè)拓展方法。由于wgMLST包含更多的基因位點(diǎn)（1 500～4 000），因此與傳統(tǒng)的基于7個(gè)基因位點(diǎn)的MLST分型手段相比具有更高的精度及分辨率。菌株高精度分型wgMLST以其高精度、高可靠性的分型結(jié)果，成為流行病學(xué)菌株分型的新標(biāo)準(zhǔn)。本試驗(yàn)依據(jù)wgMLST對沙門氏菌進(jìn)行了親緣關(guān)系分析和分型。

2 結(jié)果與分析

2.1 京津冀地區(qū)不同來源樣本沙門氏菌檢出率（見表1）

表1 京津冀地區(qū)不同來源樣本沙門氏菌檢出率Tab.1 Detection rate of Salmonella in samples from different sources in Beijing-Tianjin-Hebei

由表1 可知，按照國標(biāo)GB 4789.4—2016 對采集自飼料廠、養(yǎng)殖場、屠宰場、超市、農(nóng)貿(mào)市場等來源的飼料、豬肛拭子、水樣、豬肉、豬肉餡等5 024份樣品進(jìn)行檢測，經(jīng)過分離鑒定，共檢出陽性樣品484份，平均檢出率為9.63%。在養(yǎng)殖環(huán)節(jié)，母豬肛拭子中沙門氏菌檢出率為22.18%，高于斷奶仔豬（菌株數(shù)/樣本數(shù)=109/923，11.81%）和育肥豬（菌株數(shù)/樣本數(shù)=115/1 505，7.64%）。在零售環(huán)節(jié)，農(nóng)貿(mào)市場豬肉的沙門氏菌檢出率（菌株數(shù)/樣本數(shù)=49/362，13.54%）高于超市的豬肉（菌株數(shù)/樣本數(shù)=17/364，4.67%）。

在檢出484 株沙門氏菌中，鼠傷寒沙門氏菌占25.41%、伊魯木沙門氏菌占15.91%、豬傷寒沙門氏菌占11.78%、德爾卑沙門氏菌占10.33%、湯卜遜沙門氏菌占5.99%、塔克松尼沙門氏菌占5.79%、山夫登堡沙門氏菌占4.96%、豬霍亂沙門氏菌占2.48%、紐蘭沙門氏菌占1.45%。

2.2 484 株沙門氏菌對22 種抗菌藥物的耐藥率分析（見表2、圖1）

圖1 484株沙門氏菌對22種抗菌藥物的多重耐藥性Fig.1 Salmonella 484 strains with multiple resistance to 22 antimicrobial agents

表2 484株沙門氏菌對22種抗菌藥物的耐藥性分析Tab.2 Resistance analysis of 484 Salmonella strains to 22 antibiotics

控制菌株孔內(nèi)菌落數(shù)為1×105CFU/mL 左右，生長表現(xiàn)為渾濁或微孔底部沉淀，記錄肉眼可見抑制細(xì)菌生長藥物的最小濃度。

由表2 可知，對484 株沙門氏菌的耐藥率大于30%的抗菌藥物有GEN 30.8%、AMX 31.6%、環(huán)素類（TET 36.8%、DOX 33.5%）、NAL 31.8%。對沙門氏菌耐藥率小于30%大于10%的抗菌藥物有氟喹諾酮類（CIP 19.2%、ENO 26.7%、LEV 16.9%）、氯霉素類（CHL 21.5%、FFC 20.7%）、FOS 13.0%、BPB 13.0%、AZM 11.4%、喹惡啉類（OLA 26.4%、MEQ 25.2%）。

484 株沙門氏菌對22 種抗菌藥物耐藥性具體分析結(jié)果見圖1。由圖1 可知，對22 種抗菌藥物敏感的菌株數(shù)占總檢測出沙門氏菌總數(shù)的比例是13.84%，對1種抗菌藥物耐受菌株數(shù)比例最高為24.38%；隨著檢測的抗菌藥物越多，沙門氏菌耐藥菌株數(shù)逐漸減少，耐7種以上抗菌藥物的沙門氏菌比例為11.98%，對12 種抗菌藥物耐受菌株數(shù)僅占沙門氏菌總數(shù)的比例0.41%。

2.3 耐7 種以上抗菌藥物的50 株沙門氏菌耐藥基因分析（見圖2、圖3）

圖2 耐7種以上抗菌藥物的50株沙門氏菌耐藥基因檢出率Fig.2 Detection rate of drug resistance genes in 50 Salmonella strains resistant to more than seven antibiotics

圖3 耐7種以上抗菌藥物的50株沙門氏菌耐藥表型與耐藥基因檢測符合性Fig.3 Antibiotic resistance phenotypes of 50 Salmonella strains resistant to more than seven antibiotics were consistent with drug resistance gene detection results

由圖2可知，利用CARD數(shù)據(jù)庫對50株沙門氏菌的耐藥基因進(jìn)行比對分析，共得到43種耐藥基因檢出率，包括β-內(nèi)酰胺類：blaTEM-1（35%）、blaCTX（4%）、blaOXA-1（20%）、blaOXA-10（2%）、pbp1A（6%）、blaIMP（10%）、blaDHA-1（22%）；氨基糖苷類：aac(3)-Iva（34%）、aac(6')-Iaa（74%）、aadA1（60%）、aadA8b（16%）、aph(3')-Ia（72%）、aph(3'')-Ib（64%）、aph(3')-Iia（68%）、aac(3)-Iid（56%）；大環(huán)內(nèi)酯類：erm(B)（8%）、erm(T)（2%）；多黏菌素類：mcr-1（82%）、mcr-3（10%）、mcr-5（8%）；環(huán)素類：tet(A)（16%）、tet(B)（80%）；磺胺類：sul1（46%）、sul2（88%）、sul3（38%）；喹諾酮類：dfrA12（96%）、oqxB（28%）、oqxA（26%）、gyrA（S83F）（6%）、parC（S80R）（4%）、qnrD1（22%）、qnrS1（2%）、gyrA（D87Y）（64%）；磷霉素類：Fos3（2%）、FosA（36%）；氯霉素類：catA1（24%）、catB4（30%）、catB8（16%）、cmlA1（26%）、floR（50%）；利福平類：arr-3（20%）；氨基糖苷類和氟喹諾酮類：aac(6')-Ib-cr（88%）。

由圖3 可知，對比耐藥表型和通過全基因組數(shù)據(jù)預(yù)測耐藥結(jié)果，CIP和NAL的對應(yīng)率達(dá)到100%，44株沙門氏菌對氟喹諾酮類CIP 有耐藥性，測序具有aac(6')-Ib-cr耐藥基因；48 株沙門氏菌對喹諾酮類NAL 有耐藥性，測序有dfrA12 耐藥基因?？咕幬锲骄鶎?yīng)率＞90%，說明全基因組測序結(jié)果可較好地預(yù)測菌株的耐藥性；IPM對應(yīng)率僅為77.78%，可能與本試驗(yàn)分離得到的耐受該抗菌藥物的菌株較少有關(guān)，也可能仍有未知的耐藥機(jī)制在發(fā)揮作用。

2.4 基于全基因組測序結(jié)果的親緣關(guān)系分析

對全基因組測序得到的50 株沙門氏菌菌株進(jìn)行wgMLST的分型和聚類，結(jié)果見圖4。

圖4 耐7種以上抗菌藥物的50株沙門氏菌wgMLST聚類分析Fig.4 WgMLST cluster analysis of 50 strains of Salmonella resistant to more than seven antibiotics

由圖4 可知，除7 株為未知型外，分離的沙門氏菌有27株為ST19，10株為ST34，4株為ST40，2株為ST64。

3 討論

本文調(diào)查了京津冀地區(qū)的飼料、養(yǎng)殖、屠宰和零售等4 個(gè)環(huán)節(jié)的豬源沙門氏菌污染分布情況，平均污染率達(dá)9.63%。在養(yǎng)殖環(huán)節(jié)，母豬肛拭子的沙門氏菌檢出率為22.18%，高于斷奶仔豬（11.81%）和育肥豬（7.64%），原因可能是母豬經(jīng)歷多次繁殖周期和產(chǎn)仔應(yīng)激，腸道內(nèi)沙門氏菌侵入和增殖概率更高，母豬抗菌藥物治療次數(shù)比仔豬和育肥豬多，導(dǎo)致沙門氏菌耐藥概率也隨之增加。

農(nóng)貿(mào)市場豬肉的沙門氏菌檢出率（13.54%）比超市的豬肉（4.67%）高，原因可能是超市的冷藏環(huán)境比農(nóng)貿(mào)市場的環(huán)境好，管理更規(guī)范。豬場水樣的沙門氏菌檢出率是12.00%，沙門氏菌污染率比較高。因此，檢測豬場的水源安全是比較重要的工作。

近年來，國內(nèi)外由沙門氏菌感染人體和豬群并暴發(fā)疫情數(shù)逐年上升，進(jìn)一步加強(qiáng)監(jiān)控飼料和肉類食品尤為重要。本研究檢出的484株沙門氏菌中，不同來源的沙門氏菌中優(yōu)勢菌株為鼠傷寒沙門氏菌、伊魯木沙門氏菌、豬傷寒沙門氏菌和德爾卑沙門氏菌等。484 株沙門氏菌對22種抗菌藥物均出現(xiàn)了不同程度的耐受性，耐藥菌株所占比例86.5%。根據(jù)藥敏試驗(yàn)分析，對TET的耐受性最強(qiáng)，耐藥率高達(dá)36.8%；其他抗菌藥物如DOX 耐藥率為33.5%，GEN 為30.8%，AMX 為31.6%，NAL 為31.8%，提示應(yīng)降低或避免耐藥率較高的上述幾種藥物如TET、DOX、GEN、NAL、阿莫西林、恩諾沙星、喹乙醇、乙酰甲喹等在畜禽臨床中的使用情況。

對耐受7 種以上抗菌藥物的50 株沙門氏菌全基因組進(jìn)行測序發(fā)現(xiàn)，有5 種常見耐藥基因的檢出率在80%以上，分別為三甲氧芐二氨嘧啶類dfrA12、磺胺類sul2、氟喹諾酮類aac(6')-Ib-cr、多黏菌素類mcr-1 和環(huán)素類tet(B)；有3種耐藥基因的檢出率在50%以上，分別為氨基糖苷類aac(6')-Iaa、喹諾酮類gyrA和氯霉素類floR；有3種耐藥基因的檢出率在20%以上，分別為磷霉素類FosA、β-內(nèi)酰胺類BlaTEM-1和利福平類arr-3；沙門氏菌的耐藥基因的攜帶率與該菌株對藥物的耐藥性情況對應(yīng)。

本研究中，沙門氏菌對BPB 的耐藥率為13.0%，屬于較低水平，可能與我國2017 年禁止BPB 作為飼料添加劑使用等措施相關(guān)[8]。BPB 長期應(yīng)用于感染性疾病治療[9]，如大腸桿菌、肺炎桿菌、綠膿桿菌等所致的泌尿系統(tǒng)感染、腦膜炎、肺部感染、敗血癥等。目前國內(nèi)外已有許多報(bào)道耐BPB的沙門氏菌的研究[10-11]，如豬傷寒沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌等攜帶耐藥基因mcr-1、mcr-3和mcr-5[12]。因此，生豬養(yǎng)殖過程中使用BPB 應(yīng)引起足夠重視，防止有害菌如沙門氏菌對BPB的耐藥性增強(qiáng)[13]。

研究表明，動(dòng)物體分離的沙門氏菌中，最常見的β-內(nèi)酰胺酶基因是BlaTEM-1和BlaPSE-1編碼對氨芐青霉素的抗性[14-15]。本研究表明，沙門氏菌的耐藥表型、致病性與毒力基因相關(guān)。全基因組測序已鑒定出多個(gè)毒力基因，包括菌毛黏附類因子、調(diào)節(jié)因子、毒力島、質(zhì)粒上的毒性基因、毒素等[16-17]。多重耐藥菌株的產(chǎn)生機(jī)制復(fù)雜，控制難度大，且極易通過食物鏈水平傳播給人類，對人體健康造成巨大威脅[18]。

我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第194 號公告提出，自2020 年7 月1 日起，飼料生產(chǎn)企業(yè)停止生產(chǎn)含有促生長類藥物飼料添加劑（中藥類除外）的商品飼料[19]。307 號公告提出，養(yǎng)殖者日常生產(chǎn)自配料時(shí)不得添加允許在商品飼料中使用的抗球蟲和中藥類藥物以外的獸藥。上述兩個(gè)公告將極大減少耐藥性沙門氏菌污染。

4 結(jié)論

本研究通過調(diào)查京津冀地區(qū)飼料、養(yǎng)殖、屠宰和零售等環(huán)節(jié)的豬源沙門氏菌污染分布，檢測分離的豬源沙門氏菌對抗菌藥物耐藥率，并進(jìn)行耐7種以上抗菌藥物的沙門氏菌全基因組測序分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，京津冀地區(qū)沙門氏菌檢出率、耐藥率均較高，且得到的菌株具有多重耐藥性，耐藥基因分析結(jié)果與耐藥表型相關(guān)性較高，沙門氏菌的耐藥基因可決定耐藥表型。

本研究結(jié)果為京津冀地區(qū)沙門氏菌耐藥基因的監(jiān)控提供一定參考，提示豬場臨床中應(yīng)限制某些抗菌藥物使用，以降低沙門氏菌的耐藥性。