葉宇恒，高思語，張珠明，王 華，趙晶晶，周欣悅，張 莉

（ 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021 ）

固原雞又稱靜原雞、朝那雞，原產(chǎn)自寧夏回族自治區(qū)固原市彭陽縣，是寧夏唯一的地方優(yōu)良肉蛋兼用雞種[1]。固原烏雞屬于固原雞的分支，不但肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美，還富含黑色素，具有很高的營養(yǎng)和保健價(jià)值。烏骨雞作為補(bǔ)品時(shí)的滋補(bǔ)效果由其體內(nèi)黑色素的含量決定，這是由于黑色素能夠在動物體內(nèi)發(fā)揮很多重要作用，如抗菌、抗病毒、清除自由基、提高皮膚抗輻射能力[2]等。烏骨雞體內(nèi)的黑色素被認(rèn)為是其發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，故提高烏骨雞體內(nèi)黑色素含量成為提高其藥用價(jià)值的重要措施[3]。

黑色素由酪氨酸在酪氨酸酶的催化作用下經(jīng)過一系列的生化反應(yīng)生成[4]。研究表明，日糧中添加適量酪氨酸可提高烏雞體內(nèi)黑色素含量，提高營養(yǎng)價(jià)值[5]。但有關(guān)酪氨酸在固原烏雞生產(chǎn)中的應(yīng)用報(bào)道較少，基于此，本試驗(yàn)采用不同酪氨酸水平的日糧飼喂固原烏雞，觀察日糧中不同酪氨酸水平對4～12周齡固原烏雞組織與血清中酪氨酸酶活性及組織中黑色素含量的影響，為利用營養(yǎng)調(diào)控手段提高固原烏雞營養(yǎng)價(jià)值提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)動物為固原烏雞，由寧夏固原市彭陽縣益斌園農(nóng)畜綜合開發(fā)有限公司提供。試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，選用體況良好、體重相近的4周齡固原烏雞150只（公、母各半），隨機(jī)分成5組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)10只雞。對照組試驗(yàn)雞飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組在基礎(chǔ)日糧中分別添加0.2%、0.4%、0.6%、0.8%的L-酪氨酸（河北華陽生物科技有限公司，純度為99.9%）。試驗(yàn)期8周?；A(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平Tab.1 Basic diet composition and nutrient level

試驗(yàn)固原烏雞均在同一雞舍內(nèi)，采用3 層階梯式雞籠飼養(yǎng)，獨(dú)立乳頭式飲水器，自由采食和飲水。試驗(yàn)開始前對籠舍進(jìn)行全面消毒，保持舍內(nèi)溫度為18～20 ℃，濕度為50%～60%，光照時(shí)間為20 h 減少至自然光照（每周減少2 h）。每日打掃雞舍衛(wèi)生并定期消毒，并依照常規(guī)免疫程序進(jìn)行免疫。

1.2 測定指標(biāo)及方法

1.2.1 樣品采集

試驗(yàn)雞12周齡末禁食12 h，處死后翅靜脈采血5 mL，3 000 r/min離心10 min，分離血清，分組標(biāo)記后放入-20 ℃冰箱冷凍保存。

取5組試驗(yàn)雞肝臟、腹部皮膚、氣管、肺臟與回腸的小塊組織，生理鹽水清洗后采用10%甲醛中性緩沖液4 ℃固定組織。同時(shí)取5組試驗(yàn)雞肝臟、腹部皮膚、回腸與胸肌組織樣品5 g 左右放入凍存管中，液氮保存，后續(xù)轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱中保存。

1.2.2 組織黑色素顆粒分布

采用蘇木精-伊紅（HE）染色法，用自來水沖洗固定后的組織小塊，上行梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，石蠟切片（5 μm）。切片二甲苯脫蠟，復(fù)水，鹽酸酒精分化，HE 染色，酒精脫水，透明，中性樹膠封片，使用BM2000光學(xué)顯微鏡觀察400倍視野中的黑色素顆粒分布情況，記錄單個視野中黑色素顆粒含量。

1.2.3 血清與組織中酪氨酸酶活性

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法，通過抗原抗體特異性結(jié)合、底物顯色，使用酶標(biāo)儀（BIO-Tek）測得450 nm波長下的吸光度值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品濃度。操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2.4 組織中黑色素含量

測定方法同1.2.3。

1.2.5 血清促黑素細(xì)胞激素（α-MSH）活性

測定方法同1.2.3。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 軟件進(jìn)行初步處理，SPSS Statistics 22 統(tǒng)計(jì)軟件中的ANOVA 過程進(jìn)行單因素方差分析，Duncan's 法進(jìn)行多重比較。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 日糧酪氨酸水平對固原烏雞組織黑色素顆粒分布與含量的影響

2.1.1 日糧酪氨酸水平對固原烏雞組織黑色素分布的影響（見圖1～圖5）

圖1 黑色素在固原烏雞肺臟中的分布情況Fig.1 Distribution of melanin in lung of Guyuan black-bone chickens

圖2 黑色素在固原烏雞氣管中的分布情況Fig.2 Distribution of melanin in trachea of Guyuan black-bone chickens

圖3 黑色素在固原烏雞腹部皮膚中的分布情況Fig.3 Distribution of melanin in abdominal skin of Guyuan black-bone chickens

圖4 黑色素在固原烏雞回腸中的分布情況Fig.4 Distribution of melanin in ileum of Guyuan black-bone chickens

組織切片觀察結(jié)果顯示，5 組烏雞組織的黑色素分布情況一致。

由圖1～圖5可知，對照組和0.8%酪氨酸組固原烏雞的肺臟內(nèi)黑色素分布廣泛，主要見于小葉間、各級支氣管管壁和支氣管管間結(jié)締組織。氣管內(nèi)黑色素分布連續(xù)且密集，呈鏈狀或線狀，主要存在于外膜或黏膜下層中。腹部皮膚中表皮基底層有大量黑色素細(xì)胞存在，黑色素主要存在于毛囊周圍和真皮中的膠原纖維與彈力纖維之間。回腸內(nèi)黑色素主要分布于肌層與漿膜之間、少量存在于肌層和漿膜中。肝臟中未發(fā)現(xiàn)黑色素顆粒。

2.1.2 日糧酪氨酸水平對固原烏雞組織中黑色素顆粒含量的影響（見表2）

表2 日糧酪氨酸水平對固原烏雞組織中黑色素顆粒含量的影響Tab.2 Effect of dietary tyrosine level on the content of melanin particles in tissues of Guyuan black-bone chickens

由表2 可知，與對照組相比，0.8%酪氨酸組固原烏雞的肺臟、氣管、腹部皮膚與回腸等組織中黑色素顆粒含量均有不同程度的增加。各組固原烏雞肝臟中均未觀察到黑色素顆粒。

2.2 日糧酪氨酸水平對固原烏雞血清與組織中酪氨酸酶活性的影響（見表3）

表3 日糧酪氨酸水平對固原烏雞血清與組織中酪氨酸酶活性的影響Tab.3 Effect of dietary tyrosine level on tyrosinase activity in serum and tissue of Guyuan black-bone chickens

由表3 可知，與對照組相比，日糧酪氨酸添加水平為0.4%時(shí)，固原烏雞腹部皮膚、胸肌、回腸中酪氨酸酶的活性顯著提高（P＜0.05）；日糧酪氨酸添加水平為0.6%、0.8%時(shí)，固原烏雞腹部皮膚、胸肌、回腸、肝臟與血清中酪氨酸酶的活性均顯著提高（P＜0.05）。

當(dāng)日糧酪氨酸添加水平為0.2%時(shí)，固原烏雞腹部皮膚、胸肌、回腸、肝臟與血清中酪氨酸酶的活性與對照組相比差異均不顯著（P＞0.05）。

2.3 日糧酪氨酸水平對固原烏雞組織中黑色素含量的影響（見表4）

表4 日糧酪氨酸水平對固原烏雞組織中黑色素含量的影響Tab.4 Effect of dietary tyrosine level on content of melanin in tissues of Guyuan black-bone chickens單位：ng/g

由表4 可知，與對照組相比，日糧酪氨酸添加水平為0.2% 時(shí)，固原烏雞胸肌中黑色素的含量顯著提高（P＜0.05）；日糧酪氨酸添加水平為0.4%～0.8%時(shí)，固原烏雞腹部皮膚、肝臟、胸肌、回腸中黑色素的含量均顯著提高（P＜0.05）。0.8%酪氨酸組固原烏雞腹部皮膚、肝臟及胸肌中黑色素含量均顯著高于0.4%酪氨酸組、0.6%酪氨酸組（P＜0.05）。

2.4 日糧酪氨酸水平對固原烏雞血清α-MSH 活性的影響（見表5）

表5 日糧酪氨酸水平對固原烏雞血清α-MSH活性的影響Tab.5 Effect of dietary tyrosine level on activity of serum α-MSH in Guyuan black-bone chickens單位：μg/L

由表5 可知，與對照組相比，日糧酪氨酸添加水平為0.4%～0.8%時(shí)，固原烏雞血清α-MSH 活性均顯著提高（P＜0.05），且0.8% 酪氨酸組高于0.4% 酪氨酸組和0.6%酪氨酸組（P＜0.05）。0.2%酪氨酸組固原烏雞血清α-MSH活性與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論

3.1 日糧酪氨酸水平對固原烏雞組織中黑色素顆粒分布及含量的影響

黑色素（melanin）一詞最早是在1840年由Berzelius 提出，當(dāng)時(shí)泛指黑色動物的色素[6]。根據(jù)黑色素的功能與來源可將其分為真黑素（eumelanin）、褐黑素（pheomelanin）、神經(jīng)黑色素（neuromelanin）、膿黑色素（pyomelanin）[6-7]。禽類的羽毛以及皮膚顏色均由黑色素決定，過多的黑色素沉積會導(dǎo)致皮膚、肌肉甚至內(nèi)臟均呈現(xiàn)黑色性狀，便形成了烏雞這一品種[8]。Nganvongpanit等[9]對泰國烏骨雞的33個器官黑色素沉著分布進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，肝臟是唯一沒有黑色素沉著的器官。大多數(shù)器官的所有組織層中均存在黑色素，但一些器官只有特定層中存在。郭慧[10]在對泰和烏骨雞的研究中也證明了這一點(diǎn)，肝臟中內(nèi)僅有漿膜表面附著一些黑色素，烏雞黑色素沉積分布機(jī)制有待進(jìn)一步研究論證。曹艷芳等[11]研究發(fā)現(xiàn)，日糧酪氨酸水平在0.2%～0.8%時(shí)，淅川烏骨雞皮膚的烏度隨酪氨酸水平的提高而變深。固原烏雞組織中黑色素分布情況與其他烏雞類似，除肝臟外均有黑色素顆粒存在，而日糧中添加酪氨酸能夠不同程度地增加黑色素顆粒含量。

3.2 日糧酪氨酸水平對血清與組織中酪氨酸酶活性的影響

酪氨酸是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的含銅離子氧化還原酶[12]，在黑色素合成過程中，酪氨酸基因家族級聯(lián)調(diào)控決定了黑色素的生成[13]。酪氨酸是黑色素生化合成過程中的限速酶，當(dāng)酪氨酸活性升高時(shí)有助于機(jī)體合成黑色素。Solminski等[14]對黑色素細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)試驗(yàn)，結(jié)果表明，酪氨酸不僅是黑色素的前體，同時(shí)還可提高酪氨酸酶的活性。趙艷平等[15]在對3 個生長階段的泰和烏雞研究中發(fā)現(xiàn)，在日糧中分別添加1.18%、0.88%和1.25%水平的酪氨酸均能夠有效提高烏骨雞血清中酪氨酸酶的活性。楊杰等[16]研究發(fā)現(xiàn)，隨著飼料中酪氨酸含量增加，紅羅非魚皮膚與血清中酪氨酸酶的活性也會增加。張倩雲(yún)等[17]研究發(fā)現(xiàn)，添加酪氨酸能夠顯著提高13～20周齡凌云烏雞血清與皮膚中酪氨酸的活性。王鑫磊[18]研究表明，日糧中添加的酪氨酸越多，豫粉1號蛋雞血清中的酪氨酸酶活性越高。本試驗(yàn)結(jié)果與前人研究結(jié)論相似，表明日糧中添加0.4%～0.8%的酪氨酸能夠有效提高固原烏雞血清與組織中酪氨酸酶的活性。

3.3 日糧酪氨酸水平對固原烏雞組織中黑色素含量的影響

烏雞黑色素具有抗氧化應(yīng)激、預(yù)防癌變、排鉛解毒、提高機(jī)體免疫力和保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)等多種生物學(xué)功能[19]。與普通肉雞相比，烏骨雞各組織中存在大量的黑色素，其作為補(bǔ)品的滋補(bǔ)效果與黑色素含量呈正相關(guān)，即黑色素含量越高，藥用效果越佳[20]。黑色素生成的原料是酪氨酸，因此在生長過程中，日糧酪氨酸的含量應(yīng)滿足烏骨雞的需求。王杰[21]對淅川烏骨雞的研究表明，日糧中添加0.4%～1.0%的酪氨酸能夠顯著提高胸肌中黑色素含量。黎觀紅等[22]研究發(fā)現(xiàn)，日糧中酪氨酸添加量為0.4%～0.7%時(shí)可以提高泰和烏骨雞胸肌、腿肌、皮膚組織中黑色素的含量。據(jù)Wang等[23]報(bào)道，提高飼料中酪氨酸含量，羅非魚皮膚中的黑色素含量會相應(yīng)提高。本研究中雖然未在肝臟中觀察到真黑素，但試驗(yàn)結(jié)果表明在固原烏雞肝臟中也存在一定量的黑色素，或是其他種類的黑色素。本試驗(yàn)結(jié)果表明，日糧添加0.4%～0.8%酪氨酸能夠顯著提高固原烏雞組織中黑色素的含量，且以添加水平為0.8%時(shí)效果最好。

3.4 日糧酪氨酸水平對血清中α-MSH活性的影響

α-MSH是一種神經(jīng)內(nèi)分泌激素，由13個氨基酸構(gòu)成，源自其前體激素阿黑皮素原[24]。研究發(fā)現(xiàn)，α-MSH 在黑色素生成過程中起到重要的調(diào)節(jié)作用，可以維持和調(diào)節(jié)黑色素細(xì)胞增殖和樹突形成[25]；而且α-MSH 與黑素皮質(zhì)素受體1結(jié)合后可激活腺苷酸環(huán)化酶，從而提高細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷水平及酪氨酸酶的合成及表達(dá)，促進(jìn)黑色素合成[26]。熊渺等[27]研究表明，α-MSH 能夠促進(jìn)黑色素細(xì)胞增殖并增加細(xì)胞內(nèi)黑色素含量。許冬梅等[28]研究表明，α-MSH 可促進(jìn)黑色素相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)。郝曉娟等[29]報(bào)道指出，不同濃度α-MSH 可通過調(diào)控黑色素形成中的環(huán)磷酸腺苷通路相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，從而影響黑色素生成，且以添加10 nmol/L α-MSH時(shí)效果最顯著。本試驗(yàn)結(jié)果表明，外源性添加酪氨酸可增加固原烏雞血清中α-MSH的活性，提高黑色素含量。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，日糧中添加一定量的酪氨酸可提高固原烏雞除肝臟外組織中黑色素顆粒的含量，提高血清中α-MSH 以及血清與組織中酪氨酸酶的活性，并增加組織黑色素含量。綜合上述指標(biāo)分析，當(dāng)日糧添加酪氨酸水平為0.8%時(shí)效果最好，能夠有效提高組織及血清中黑色素含量與相關(guān)激素活性。