何林蔓，柳宜池，陳莎，高夢祥，2，李利，2*

（1.長江大學 生命科學學院，湖北 荊州 434025；2.長江大學食品研究院，湖北 荊州 434025）

血耳（Tremella sanguinea Peng），又稱血銀耳，是一種生長于枯木上的藥食兼用大型膠質(zhì)真菌，子實體以耳片狀叢生，鮮時呈暗赤褐色，干后黑色，浸水后滲出琥珀紅色色素，故稱血耳[1]。血耳作為食藥兼用真菌，在湖北省西北部山區(qū)具有較長栽培歷史，具有益氣活血、平肝陽、祛熱毒的功效，常用于肝炎、痢疾以及婦科諸癥的治療[2]。

1990 年彭寅斌根據(jù)血耳的形態(tài)特征對其進行分類，將其歸屬于銀耳綱（Tremellomycetes）、銀耳目（Tremellales）、銀耳科（Tremellaceae）、銀耳屬（Tremella）[1]，與常見的食用菌銀耳（T.fuciformis）、金耳（T.aurantialba）同屬，親緣關(guān)系較近。銀耳屬真菌中普遍存在伴生現(xiàn)象[3]。血耳、金耳、腦狀銀耳（T.encephala）、T.spectabilis 和T.steidleri 的伴生菌被鑒定為韌革菌（Stereum sp.）[3-5]，銀耳的伴生菌為香灰菌（Hypoxylon sp．）[3]，T.mycophaga、T.obscura 和T.giraffa 的伴生菌為花耳屬真菌（Dacrymyces sp.）[4]。銀耳屬的這種伴生現(xiàn)象實質(zhì)為一種寄生關(guān)系，銀耳屬真菌為寄生菌，伴生菌為宿主菌。伴生菌具有較高的纖維素、半纖維素降解能力，能夠分解木材，為銀耳屬真菌的生長發(fā)育提供營養(yǎng)和水分[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)，許多銀耳屬的子實體是一種異質(zhì)復合體，含有大量的伴生菌菌絲[3-4]。

銀耳屬食用菌中多糖含量極其豐富，被認為是其主要的活性成分，其中關(guān)于銀耳多糖和金耳多糖的研究較多，被證實具有調(diào)節(jié)免疫力、抗腫瘤、抗氧化、抗炎癥、抗衰老、降血糖、減肥及益生等多種功效[6-7]，開發(fā)利用前景十分廣闊。近年來。血耳子實體多糖的抗氧化、抗炎癥和調(diào)節(jié)免疫功能的活性也已被報道[8-10]。

食用菌多糖不僅可以從子實體中提取和分離，還可以從培養(yǎng)的菌絲體、孢子或發(fā)酵液中獲取[11]。目前銀耳屬食用菌多糖的研究主要集中于子實體多糖和菌絲體、擔孢子發(fā)酵產(chǎn)生的多糖，對其伴生菌多糖的研究鮮有報道[12]。本研究利用血耳伴生菌菌株韌革菌XE02 進行液態(tài)發(fā)酵制備胞外多糖，對多糖的抗氧化活性及吸濕、保濕性能進行研究，以期為血耳伴生菌活性物質(zhì)的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

血耳伴生菌菌株[韌革菌（Stereum sp.）XE02]，通過耳木組織培養(yǎng)法從湖北省保康縣馬良鎮(zhèn)水田村采集的血耳子實體中分離而得[5]。

葡萄糖、濃硫酸、苯酚、水楊酸、鄰苯三酚、甘油、抗壞血酸（vitamin C，VC）、海藻酸鈉（均為分析純）、KBr（光譜純）：國藥集團化學試劑有限公司；DEAE-52 纖維素：上海源葉生物科技有限公司。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，定容至1 000 mL；馬鈴薯培養(yǎng)基[13]：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO43 g，MgSO41.5 g，定容至1 000 mL，pH6.0；大米培養(yǎng)基[14]：大米粉40 g，大豆粉10 g，KCl 0.15 g，KH2PO40.15 g，NaCl 0.15 g，定容至1 000 mL，pH6.0；葡萄糖培養(yǎng)基：葡萄糖50 g、蛋白胨5 g、KH2PO42.5 g，MgSO41.0 g，定容至1 000 mL，pH6.0；加富葡萄糖培養(yǎng)基：在葡萄糖培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加0.15%酵母浸出粉。培養(yǎng)基滅菌條件為121 ℃，20 min。

1.2 儀器與設備

Allegra X-30R 離心機：德國貝克曼公司；TU1900紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；HT7800 透射電子顯微鏡：日本日立科學儀器有限公司；IR-960 傅里葉紅外變換光譜儀：天津瑞岸科技有限公司；Waters 1515 高效液相色譜儀、Waters 2410示差折光檢測器：美國沃特世公司。

1.3 方法

1.3.1 血耳伴生菌的液態(tài)發(fā)酵

將韌革菌XE02 點接于PDA 培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)4 d進行活化。挑取5 塊4 mm2大小的菌餅接入50 mL 液體培養(yǎng)基，30 ℃，200 r/min 培養(yǎng)3 d 得到種子液，再按照10%接種量轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為30 ℃、200 r/min、7 d。

1.3.2 胞外粗多糖的提取

發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液經(jīng)真空抽濾除掉菌絲體，收集濾液，于55 ℃減壓濃縮至原體積的1/10，按100∶5的體積比加入30% H2O2，用1 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH值至9，在40 ℃下水浴1 h 進行脫色，得到澄清透明的粗多糖溶液。加入1/4 體積的Sevag 試劑（氯仿∶正丁醇=4∶1，體積比），磁力攪拌20 min 后，10 000 r/min 離心15 min，脫除蛋白質(zhì)，重復3 次，收集上清液，加入無水乙醇，使體系中乙醇體積濃度達到80%，4 ℃靜置過夜，10 000 r/min 離心15 min，獲得粗多糖沉淀。將粗多糖沉淀用無水乙醇洗滌2 次，加入蒸餾水溶解，冷凍干燥后得到粗多糖。粗多糖的得率（P，g/L）按公式（1）進行計算。

式中：M粗多糖為粗多糖的干燥后質(zhì)量，g；V 為用于提取多糖的發(fā)酵液體積，L。

1.3.3 多糖的分離純化

0.1 g 粗多糖溶解在10 mL 蒸餾水中，上樣至DEAE-52 纖維素層析柱（2.6 cm × 45 cm），依次用0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L NaCl 溶液進行洗脫，流速為1 mL/min，每7 mL 洗脫液收集一管。采用苯酚-硫酸法測量洗脫液的吸光值（A490nm），繪制洗脫曲線。根據(jù)洗脫曲線將主要峰對應的洗脫液合并，依次進行減壓濃縮、透析、冷凍干燥，得到韌革菌多糖組分（Stereum exopolysaccharides，SEPS）。

1.3.4 紫外可見吸收光譜測定

將多糖樣品配制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL 的水溶液，在200～600 nm 波長內(nèi)，以1 nm 間隔進行掃描。

1.3.5 高效凝膠滲透色譜測定

配制質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL 的右旋糖酐標準品（分子量1 000、5 000、12 000、25 000、50 000、80 000、670 000 Da）和SEPS 溶液，過0.22 μm 微孔濾膜后采用高效凝膠滲透色譜法進行測定。采用示差折光檢測器；色譜柱為Shodex OHpak SB-803 HQ、Ohpak SB-804 HQ、Ohpak SB-805 HQ（8 mm×300 mm）串聯(lián)柱；流動相為0.05 mol/L NaCl 水溶液；流速0.6 mL/min；柱溫40 ℃，進樣量30 μL。采用Waters Empower 軟件對結(jié)果進行分析，以標準品相對分子質(zhì)量（molecular weight，Mw）的對數(shù)值為縱坐標，以相應色譜峰的保留時間為橫坐標進行線性回歸，得校正曲線。根據(jù)多糖組分的保留時間由校正曲線計算得到其分子量。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜測定

多糖樣品1～2 mg 與KBr 固體充分研磨后壓片，在4 000～400 cm-1的波數(shù)范圍內(nèi)進行掃描。

1.3.7 透射電子顯微鏡觀察

參照王昭晶等[9]的方法，具體如下：1 mg/mL 的多糖水溶液，按質(zhì)量比1∶1 加入1 mg/mL 十二烷基硫酸鈉溶液，80 ℃恒溫水浴2 h，用蒸餾水稀釋至5 μg/mL，80 ℃繼續(xù)水浴2 h。取1 滴分散好的多糖溶液加到300目銅網(wǎng)碳膜上，室溫下自然干燥后在80 kV 電壓下進行觀察。

1.3.8 抗氧化能力測定

參照Zhang 等[15]的方法測定多糖樣品的羥自由基清除能力，以VC為陽性對照。將1.0 mL FeSO4（9 mmol/L）、1.0 mL 水楊酸-乙醇溶液（9 mmol/L）和1.0 mL多糖樣品（0～10 mg/mL）混合。加入1.0 mL H2O2（8.8 mmol/L）啟動反應，37 ℃的水浴孵育1 h，測定510 nm 處吸光值，按照公式（2）計算羥自由基清除率（Sh，%）。

式中：A1為樣品溶液的反應體系的吸光值；A2為用乙醇代替水楊酸-乙醇溶液的對照組吸光值；A0為用蒸餾水代替樣品溶液的對照組吸光值。

參照Feng 等[16]的方法測定多糖樣品的超氧陰離子自由基清除能力，以VC為陽性對照。將3.0 mL Tris-HCl 緩沖液（0.05 mol/L，pH8.2，含1 mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉）于試管中，25 ℃水浴孵育20 min，取出后立即加入2.0 mL 樣品溶液（0～10 mg/mL）和1.0 mL 鄰苯三酚（50 mmol/L），混勻，25 ℃水浴反應5 min，然后加入0.2 mL 濃鹽酸終止反應，于320 nm 處測吸光值，按照公式（3）計算超氧陰離子自由基清除率（Ss，%）。

式中：A1為樣品溶液的反應體系的吸光值；A2為用蒸餾水代替鄰苯三酚溶液的對照組吸光值；A0為用蒸餾水代替樣品溶液的對照組吸光值。

1.3.9 吸濕、保濕效果測定

按伍曉萍等[17]的方法，以常用的保濕劑甘油和海藻酸鈉為對照，考察多糖的吸濕、保濕能力。稱取多糖樣品、甘油和海藻酸鈉各0.5 g 于稱量瓶中，將其放入置有飽和碳酸鉀溶液（相對濕度43%）和飽和硫酸銨溶液（相對濕度81%）的干燥器內(nèi)，25 ℃放置2、4、6、8、10、12、24 h 后，分別稱量樣品質(zhì)量，按公式（4）計算吸濕能力（Ma，%）。

式中：W0為初始樣品質(zhì)量，g；W1為特定時間吸濕后的樣品質(zhì)量，g。

稱取多糖樣品、甘油和海藻酸鈉各0.5 g 于稱量瓶中，分別加入3 倍樣品質(zhì)量的去離子水，轉(zhuǎn)動稱量瓶直至樣品將水分完全吸收。將稱量瓶放入裝有變色硅膠的干燥器（相對濕度0%）內(nèi)，25 ℃放置2、4、6、8、10、12、24、36 h 后，分別稱量樣品質(zhì)量，按照公式（5）計算保濕率（Mr，%）。

式中：H0為初始樣品中的水分質(zhì)量，g；H1為特定時間后樣品中的水分質(zhì)量，g。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2007 處理數(shù)據(jù)和統(tǒng)計分析，Origin 2018 軟件進行繪圖。試驗數(shù)據(jù)均重復測定3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 血耳伴生菌胞外多糖的發(fā)酵制備

韌革菌XE02 在馬鈴薯培養(yǎng)基、大米培養(yǎng)基、葡萄糖培養(yǎng)基和加富葡萄糖培養(yǎng)基中進行液態(tài)發(fā)酵，其發(fā)酵液中多糖產(chǎn)量見圖1。

圖1 韌革菌XE02 在不同培養(yǎng)基中的胞外多糖產(chǎn)量Fig.1 Yield of exopolysaccharides by Stereum sp.XE02 in different media

由圖1 可知，培養(yǎng)基成分對韌革菌XE02 的胞外多糖產(chǎn)量影響較大，其中，大米培養(yǎng)基為最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基，胞外多糖產(chǎn)量為（1.62±0.05）g/L。在后續(xù)試驗中均采用大米培養(yǎng)基為韌革菌XE02 胞外多糖的發(fā)酵培養(yǎng)基。

收集韌革菌XE02 在大米培養(yǎng)基中的發(fā)酵液上清，經(jīng)H2O2脫色、Sevag 試劑脫蛋白、乙醇沉淀得到胞外粗多糖，得率為（1.1±0.2）g/L。采用DEAE-52 纖維素柱層析對粗多糖進行純化，結(jié)果見圖2 和圖3。

圖2 粗多糖的DEAE-52 纖維素柱層析洗脫曲線Fig.2 Elution curve of crude polysaccharides using DEAE-52 column chromatography

圖3 SEPS 的固體狀態(tài)和顯微形貌Fig.3 Solid state and microscopic morphology of polysaccharides SEPS

由圖2 可知，胞外粗多糖經(jīng)DEAE-52 纖維素柱層析后，在NaCl 濃度為0 mol/L 時有1 個洗脫峰，表明韌革菌XE02 的胞外多糖主要為中性多糖。該中性多糖洗脫液經(jīng)濃縮、透析除鹽、冷凍干燥后，得到蓬松的白色絮狀多糖組分SEPS，在透射電鏡下，SEPS 的分子形貌呈長絲狀（圖3）。

采用紫外可見吸收光譜和高效凝膠滲透色譜分別對多糖SEPS 的純度和分子量進行分析，結(jié)果見圖4和圖5。

圖4 SEPS 的紫外可見吸收光譜Fig.4 Ultraviolet-visible absorption spectra of SEPS

圖5 SEPS 的高效凝膠滲透色譜Fig.5 High performance gel permeation chromatogram of SEPS

由圖4 可知，SEPS 在260 nm 和280 nm 處無明顯的吸收峰，表明樣品中不含或含極少量的蛋白質(zhì)和核酸，純度較高。由圖5 可知，高效凝膠滲透色譜共檢測到3 個洗脫峰SEPS-1、SEPS-2 和SEPS-3，保留時間分別為27.01、40.77、46.91 min，表明SEPS 為含有3 種不同分子量多糖的復合多糖。根據(jù)右旋糖酐標準品的lgMw-RT 校正曲線方程y=-0.166x+11.06（R2=0.995），計算得到SEPS-1、SEPS-2 和SEPS-3 相對分子質(zhì)量分別為3.77×103、19.61、1.87 kDa。

2.2 胞外多糖SEPS 的傅里葉變換紅外光譜分析

在4 000～400 cm-1的波數(shù)范圍內(nèi)對SEPS 進行了傅里葉變換紅外光譜掃描，分析其特征官能團，結(jié)果見圖6。

圖6 SEPS 的傅里葉變換紅外光譜Fig.6 Fourier transform infrared spectra of SEPS

由圖6 可知，SEPS 在3 400、2 933、1 641、1 427、1 150、1 051、900、856、766 cm-1處均有吸收峰，具有多糖類物質(zhì)的一般結(jié)構(gòu)特征。其中，3 400 cm-1和2 933 cm-1附近的吸收峰分別為O-H 伸縮振動和C-H 伸縮振動[15]，二者是糖類的特征吸收峰；1 641 cm-1附近的吸收峰與多糖的結(jié)合水有關(guān)[10]，說明SEPS 對水有較強的親和力；1 427 cm-1附近的吸收峰是C-H 的彎曲振動峰[15]；1 051 cm-1附近的吸收峰為吡喃糖環(huán)中C-O-C和C-O-H 的C-O 伸縮振動，766 cm-1為吡喃環(huán)的對稱環(huán)伸縮振動[15]，表明SEPS 中單糖以吡喃糖苷的形式存在；900 cm-1和856 cm-1附近的吸收峰分別為α-糖苷鍵和β-糖苷鍵的吸收峰[15]，表明SEPS 同時存在α和β 兩種類型的糖苷鍵。綜上所述，SEPS 中的單糖組成為吡喃糖，含有β-構(gòu)型糖苷鍵和α-構(gòu)型糖苷鍵。

2.3 胞外多糖SEPS 的抗氧化活性

在正常情況下，人體中的自由基處在不斷產(chǎn)生和不斷消除的動態(tài)平衡中，一旦平衡被打破，就會對機體組織產(chǎn)生危害，進而引發(fā)腫瘤、衰老、心腦系統(tǒng)損傷等一系列相關(guān)疾病[17-18]。大量研究表明，真菌多糖是一類良好的天然抗氧化劑，可用于防止或減輕自由基造成的危害[18]。以羥自由基清除效果和超氧陰離子自由基清除效果為指標，評價了胞外多糖SEPS 的抗氧化活性，結(jié)果見圖7 和圖8。

圖7 SEPS 對羥自由基的清除效果Fig.7 Scavenging effect of SEPS on hydroxyl radical

圖8 SEPS 對超氧陰離子自由基的清除效果Fig.8 Scavenging effect of SEPS on superoxide anion radical

由圖7 和圖8 可知，隨著濃度的升高，SEPS 的羥自由基清除率和超氧陰離子自由基清除率不斷升高，表明SEPS 的質(zhì)量濃度與清除率呈量效關(guān)系。在10 mg/mL時，SEPS 的羥自由基和超氧陰離子自由基清除率分別約為68%和74%，說明胞外多糖SEPS 具有一定的抗氧化能力，在抗衰老、抗腫瘤、抗炎癥、抗糖尿病活性等方面具有潛在的應用前景[12]。

2.4 胞外多糖SEPS 的吸濕和保濕性能

多糖分子結(jié)構(gòu)中含有大量的羥基、羧基等極性基團，這些極性基團易與水分子形成氫鍵而結(jié)合大量的水分，從而具有良好的吸濕和保濕性。同時，多糖具有良好的成膜性，能夠在果蔬、皮膚等表面形成“鎖水膜”，防止水分流失，達到持久保鮮或保濕的效果。目前，越來越多的多糖被用于鮮切水果保鮮劑和化妝品保濕劑[19-20]。

2.4.1 吸濕性

分別在相對濕度43%和相對濕度81%環(huán)境下，研究了胞外多糖SEPS 的吸濕性，結(jié)果見圖9 和圖10。

圖9 SEPS 在相對濕度43%時的吸濕效果Fig.9 Moisture-absorption rates of SEPS at relative humidity of 43%

圖10 SEPS 在相對濕度81%時的吸濕效果Fig.10 Moisture-absorption rates of SEPS at relative humidity of 81%

由圖9 和圖10 可知，在相對濕度43%和相對濕度81%環(huán)境下，胞外多糖SEPS 及常用保濕劑甘油和海藻酸鈉的吸濕率在24 h 內(nèi)均不斷升高，且環(huán)境濕度越大，吸濕性越強；相對濕度81%環(huán)境下，甘油的吸濕性最強，24 h 吸濕率為95.5%，明顯高于海藻酸鈉（45.1%）和胞外多糖SEPS（63.3%）。劉恕[21]的研究也同樣顯示了甘油優(yōu)越的吸濕性能，其在不同濕度條件下的吸濕率優(yōu)于聚乙二醇、透明質(zhì)酸等其它常用保濕劑。然而，胞外多糖SEPS 在24 h 內(nèi)的吸濕率明顯高于海藻酸鈉，表明胞外多糖SEPS 具有良好的吸濕性能。

2.4.2 保濕性

在干燥硅膠環(huán)境（相對濕度0%）中，研究了胞外多糖SEPS 的保濕性，結(jié)果見圖11。

圖11 SEPS 在干燥硅膠環(huán)境中的保濕效果Fig.11 Moisture-retention rates of SEPS under dry silica gel condition

由圖11 可知，在干燥環(huán)境下，胞外多糖SEPS 與常見保濕劑甘油和海藻酸鈉的水分變化趨勢一致，在12 h 內(nèi)快速下降，之后隨著時間的延長，水分的散失開始變得緩慢；胞外多糖SEPS 保濕效果優(yōu)于甘油和海藻酸鈉，36 h 時胞外多糖SEPS、海藻酸鈉和甘油保濕率分別為31.6%、27.8%和20.0%。

3 結(jié)論

血耳伴生菌菌株韌革菌XE02 產(chǎn)生胞外多糖的最佳培養(yǎng)基為大米培養(yǎng)基，在30 ℃、200 r/min 條件下培養(yǎng)7 d，發(fā)酵液離心上清中胞外多糖含量為（1.62±0.05）g/L，經(jīng)H2O2脫色、Sevag 試劑脫蛋白和乙醇沉淀制備得到胞外粗多糖，得率為（1.1±0.2）g/L。采用DEAE-52 纖維素柱層析對粗多糖進行純化，得到1 個中性多糖組分SEPS，其冷凍干燥后為蓬松的白色絮狀物，在透射電鏡下的分子形貌呈長絲狀。高效凝膠滲透色譜分析表明，SEPS 為復合多糖，含有SEPS-1、SEPS-2 和SEPS-3 共3 種多糖組分，相對分子質(zhì)量分別為3.77×103、19.61、1.87 kDa。傅里葉變換紅外光譜分析表明，SEPS 具備多糖類物質(zhì)的一般結(jié)構(gòu)特征，其單糖組成為吡喃糖，含有β-構(gòu)型糖苷鍵和α-構(gòu)型糖苷鍵。

SEPS 具有良好的羥自由基和超氧陰離子自由基清除能力，且呈劑量依賴性。在10 mg/mL 時，SEPS 的羥基自由基和超氧陰離子自由基清除率分別約為68%和74%。SEPS 具有良好的吸濕、保濕性能。在相對濕度43%和81%環(huán)境下，SEPS 的吸濕效果不及甘油，但明顯高于海藻酸鈉，在相對濕度81%下，24 h 時SEPS、海藻酸鈉和甘油的吸濕率分別為63.3%、45.1%和95.5%；在相對濕度為0%的干燥環(huán)境下，SEPS 保濕效果優(yōu)于甘油和海藻酸鈉，36 h 時SEPS、海藻酸鈉和甘油保濕率分別為31.6%、27.8%和20.0%。該結(jié)果表明，SEPS在保健食品、果蔬保鮮、化妝品等領(lǐng)域具有較好的開發(fā)應用潛力。