張志慧，李雨凝，張光耀，周大勇，2，宋亮，2*，邵振文

（1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學(xué) 國家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116034；3.青島海智源生命科技有限公司，山東 青島 266200）

火麻仁分離蛋白（hemp seed protein isolate，HPI）具有豐富的必需氨基酸，是公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)植物蛋白質(zhì)資源。雖然我國工業(yè)火麻種植量以及火麻仁產(chǎn)量巨大，但缺乏對火麻仁的精深研究與開發(fā)利用，市場上火麻仁的高附加值產(chǎn)品也相對匱乏，造成火麻仁資源極大浪費(fèi)[1]。HPI 中含量較高的二硫鍵易形成分子間二硫鍵，能使蛋白質(zhì)分子在中性條件下聚集沉淀，從而導(dǎo)致其溶解性、持水性、起泡性等功能性較差，限制其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[2]。因此，通過對HPI 進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾以提高其功能性質(zhì)，有益于HPI 資源在食品工業(yè)中的應(yīng)用。

乳液凝膠體系作為一種典型的食品體系，在食品領(lǐng)域的應(yīng)用前景廣闊。許多常見食品，例如蛋黃醬、冰淇淋、酸奶等均屬于乳液凝膠體系[3]。已有文獻(xiàn)報(bào)道，基于大分子復(fù)合物穩(wěn)定的乳液凝膠，其復(fù)合物分子間的靜電相互作用有助于形成致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[4]。丁儉等[5]研究發(fā)現(xiàn)，天然的大豆蛋白與大豆可溶性多糖結(jié)合后乳化性較差，但通過超聲預(yù)處理可以提高乳化性，同時(shí)增強(qiáng)乳液的凍融穩(wěn)定性。耿肖倩[6]研究發(fā)現(xiàn)，天然米渣蛋白溶解性較差，需要先通過酶解的方法得到改性蛋白，再與黃原膠進(jìn)行復(fù)合，所得到的復(fù)合物具有較好的穩(wěn)定乳濁液得能力。Cabezas 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，加熱預(yù)處理（90 ℃，15 min）后得到的乳清蛋白與可溶性大豆多糖復(fù)合形成的乳液具有更高的凍融穩(wěn)定性和耐酸穩(wěn)定性。

動(dòng)態(tài)高壓微射流（dynamic high pressure microflu idization，DHPM）是一種新興的高壓物理技術(shù)，具有處理時(shí)間短、處理溫度低、營養(yǎng)損失少、外源物質(zhì)添加少的優(yōu)點(diǎn)[8]，近年來常被應(yīng)用于改善蛋白質(zhì)等生物大分子的理化性質(zhì)和功能特性。Ge 等[9]研究發(fā)現(xiàn)DHPM 可顯著提高杜仲籽粕蛋白的溶解度和乳化特性；敬思群等[10]利用DHPM 對大豆分離蛋白/多糖復(fù)合溶液進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)DHPM 產(chǎn)生的超高壓有利于蛋白質(zhì)與多糖有效結(jié)合，形成復(fù)合物。目前，基于DHPM 技術(shù)修飾改性蛋白質(zhì)以構(gòu)建乳液凝膠體系的研究鮮見報(bào)道。

本研究采用DHPM 技術(shù)對HPI 進(jìn)行改性，將改性后的蛋白與黃原膠（xanthan gum，XG）進(jìn)行復(fù)配得到HPI/XG 復(fù)合物，并將復(fù)合物作為乳化劑，以亞麻籽油為油相構(gòu)建Pickering 乳液凝膠。通過質(zhì)地、微觀結(jié)構(gòu)、流變特性等指標(biāo)考察HPI/XG 不同復(fù)配質(zhì)量比對所得乳液凝膠理化性質(zhì)的影響，并進(jìn)一步揭示乳液凝膠的凍融穩(wěn)定性與貯藏穩(wěn)定性的變化規(guī)律，為植物蛋白基乳液凝膠的構(gòu)建及其在食品體系的應(yīng)用提供新策略。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂火麻蛋白粉（純度≥75%）：遼寧俏牌生物科技有限公司；亞麻籽油（α-亞麻酸含量約53%）：青島海智源生命科技有限公司；黃原膠（生物試劑）：上海源葉生物科技有限公司；硫酸亞鐵（分析級(jí)）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；硫氰酸銨、硫代巴比妥酸（均為分析級(jí)）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；正丁醇、異丙醇、異辛烷、甲醇、三氯甲烷（均為分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

納米對撞機(jī)（NCJJ7/200）：廊坊通用機(jī)械制造有限公司；均質(zhì)分散機(jī)（T25）：德國IKA 公司；高速冷凍離心機(jī)（CR22N）：日本HITACHI 公司；多功能酶標(biāo)儀（M200）：瑞士TECAN 公司；熒光倒置顯微鏡（Ti-s）：日本Nikon 公司；流變儀（Discovery HR-2）：美國TA公司；紫外可見分光光度計(jì)（UV-2100B）：美國安捷倫公司；電熱恒溫干燥箱（PH-05A）：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 HPI 的制備

HPI 的制備參照Feng 等[11]的方法。脫脂火麻蛋白粉以1∶20（g/mL）的料液比分散于蒸餾水中，用1 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)懸浮液的pH 值至10.0，40 ℃水浴攪拌2 h，室溫下8 000×g 離心15 min 收集上清液。用1 mol/L HCl 將收集的上清液調(diào)至pH5.0，于4 ℃、8 000×g離心15 min，分離沉淀蛋白。最后將所得樣品收集并凍干，待用。

1.3.2 DHPM 處理

將HPI 凍干粉分散于去離子水中（50 mg/mL），室溫?cái)嚢柽^夜，使蛋白質(zhì)充分水化。利用均質(zhì)分散機(jī)以10 000 r/min 對蛋白溶液進(jìn)行5 min 預(yù)處理，將得到的HPI 懸浮液通過動(dòng)態(tài)高壓微射流60 MPa 處理3 個(gè)循環(huán)。將DHPM 處理后的HPI 樣品存放于4 ℃，備用。

1.3.3 HPI/XG 復(fù)合物的制備

HPI/XG 復(fù)合物的制備參照沈可潔等[12]的方法。DHPM 處理后的HPI 樣品配制成5%的懸浮液，將pH值調(diào)為3，充分?jǐn)嚢? h，保證蛋白質(zhì)充分水合。用pH值為3 的蒸餾水，配制1%的XG 溶液，室溫下攪拌2 h。將充分水合的HPI（60 MPa，5%）溶液與XG（1%）分別按質(zhì)量比5∶1、2∶1、1∶1、1∶2 混合，于25 ℃、500 r/min攪拌2 h。

1.3.4 Pickering 乳液凝膠的制備

HPI（經(jīng)DHPM 處理）與XG 質(zhì)量比分別為5∶1、2∶1、1∶1、1∶2，純XG 為乳化劑，添加26%的油相，采用均質(zhì)分散機(jī)（10 000 r/min，2 min）制備乳液凝膠[12]。

1.3.5 乳液凝膠微觀結(jié)構(gòu)的觀察

采用熒光倒置顯微鏡觀察乳液凝膠的微觀結(jié)構(gòu)。取少量乳液樣品滴至載玻片，放置好蓋玻片，倒置于載物臺(tái)，用20 倍物鏡觀察乳液液滴的形態(tài)。

1.3.6 乳液凝膠流變特性的測定

參照Zhang 等[13]的方法對乳液凝膠流變特性進(jìn)行測定。

1.3.7 乳液凝膠凍融穩(wěn)定性的測定

凍融穩(wěn)定性的測定參考黃子璇等[14]的方法進(jìn)行。將制得的乳液樣品均放置于密閉玻璃管中，進(jìn)行3 次同樣的冷凍-融化循環(huán)，并對每次復(fù)溫樣品的微觀形態(tài)（同1.3.5）及流變特性（同1.3.6）進(jìn)行測定。

1.3.8 乳液凝膠貯藏穩(wěn)定性的測定

參照Zeng 等[15]的方法對乳液凝膠的貯藏穩(wěn)定性進(jìn)行測定。取10 mL 乳液凝膠置于玻璃管中，60 ℃烘箱中貯藏7 d，取樣測定貯藏0、3、5、7 d 的脂肪的過氧化值（peroxide value，POV）、硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARS）含量、共軛二烯烴（conjugated diolefine，CD）含量、共軛三烯烴（conjugated triene，CT）含量來確定乳液凝膠貯藏穩(wěn)定性。

1.3.8.1 過氧化值（POV）的測定

參照Zeng 等[15]的方法，測定貯藏過程中POV。

1.3.8.2 硫代巴比妥酸值（TBARS）含量的測定

參照Wang 等[16]的方法測定貯藏期間TBARS 的含量。

1.3.8.3 共軛二烯烴與共軛三烯烴含量的測定

參照Koh 等[17]的方法測定貯藏期間共軛二烯烴（CD）、共軛三烯烴（CT）的含量。0.15 g 乳液樣品于5 mL異丙醇中稀釋，12 000 ×g 離心5 min，取1 mL 上清液加入到2 mL 異丙醇中，使用紫外可見分光光度計(jì)測定233（CD）、268 nm（CT）處的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有指標(biāo)的測定均重復(fù)進(jìn)行3 次，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用ANOVA 分析和Tukey's 檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。不同英文字母表示存在顯著性差異（p<0.05）。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳液凝膠的形貌

圖1 為DHPM 處理后的HPI（60 MPa）、HPI/XG 復(fù)合物和純XG 制備的油相含量為26%的乳液凝膠的直觀圖。

圖1 乳液凝膠外觀Fig.1 Appearance of emulsion gel

由圖1 可知，HPI 與5∶1 試驗(yàn)組乳液均呈現(xiàn)較強(qiáng)的流動(dòng)性。HPI/XG 復(fù)合物與純XG 的乳液凝膠均可觀察到固體狀外觀和良好的自持性能，倒置不流動(dòng)。

采用熒光倒置顯微鏡觀察乳液凝膠的微觀結(jié)構(gòu)，如圖2 所示。

圖2 乳液凝膠的微觀形貌Fig.2 Microscopic images of emulsion gel

由圖2 可以看出，在酸性條件下，DHPM 處理后的HPI 不具備凝膠形態(tài)，且液滴絮凝不穩(wěn)定；純XG 穩(wěn)定的乳液凝膠雖具備凝膠特征，但易發(fā)生聚集；然而，酸性條件下HPI 與XG 可以通過靜電吸引形成復(fù)合物，從而極大程度地降低了乳液凝膠的粒徑、提高了乳液凝膠穩(wěn)定性[18]。在HPI 與XG 質(zhì)量比為5∶1 時(shí)，可觀測到較大的聚集體，可能是由于XG 與HPI 表面電荷完全中和，形成聚集體。但隨XG 添加量增加，視野中的液滴尺寸明顯減小、分布更加均勻，原因可能是電荷完全中和后，繼續(xù)增加XG 添加量，溶液中與HPI 作用的電荷增加，沉淀減少，過量XG 會(huì)再次破壞復(fù)合物重新形成團(tuán)聚體[19]。

2.2 乳液凝膠的流變特性分析

乳液凝膠的流變特性如圖3 所示。

圖3 乳液凝膠的流變特性Fig.3 Rheological properties of emulsion gel

由圖3A 可知，隨XG 添加量的增加G′明顯增大，隨著振幅的增加，結(jié)構(gòu)被破壞，表現(xiàn)為儲(chǔ)能模量G′和損耗模量G″產(chǎn)生交叉點(diǎn)，主要是應(yīng)力破壞乳液液滴結(jié)構(gòu)使液滴重排[20]。由圖3B 可知，當(dāng)頻率為0.1～10 Hz時(shí)，所有樣品G′大于G″，說明所有樣品均具有以彈性為主導(dǎo)的黏彈性能。隨著XG 添加量的增加，乳液樣品G′增加，表明乳液凝膠的黏彈性增強(qiáng)，可能是因?yàn)閄G的加入使液滴減小，單位接觸面積增加，增強(qiáng)了液滴間的作用力[21]，促進(jìn)了乳滴之間形成更強(qiáng)的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。由圖3C 可知，所有乳液的表觀黏度均隨著剪切速率的增大而降低，呈現(xiàn)典型的剪切變稀現(xiàn)象?？赡苁怯捎谳^高的剪切速率破壞了乳滴之間的非共價(jià)相互作用[22]。XG 添加量的增加，增強(qiáng)了乳滴之間相互作用，增強(qiáng)了乳液凝膠的表觀黏度和抗剪切的能力。

2.3 乳液凝膠的凍融穩(wěn)定性分析

圖4 為乳液凝膠凍融后的直觀圖。

圖4 乳液凝膠凍融后外觀Fig.4 Appearance of freeze-thaw emulsion gel

由圖4 可知，HPI 與XG 以不同質(zhì)量比（5∶1、2∶1、1∶1、1∶2）和純XG 制備的乳液凝膠3 次凍融循環(huán)后均未發(fā)生明顯的破乳或油析現(xiàn)象，仍具備自支撐的凝膠特性，說明添加XG 有助于提升乳液凝膠的凍融穩(wěn)定性，而純HPI 制備的乳液1 次凍融循環(huán)后即出現(xiàn)了嚴(yán)重的破乳與相分離現(xiàn)象。結(jié)果表明，XG 與HPI 復(fù)配可以增強(qiáng)乳液凝膠的黏彈性，同時(shí)提高乳液凝膠的凍融穩(wěn)定性。

圖5 為乳液凝膠動(dòng)凍融后的微觀形貌。

圖5 乳液凝膠動(dòng)凍融后的微觀形貌Fig.5 Microscopic images of dynamic freeze-thaw emulsion gel

由圖5 可知，凍融前后HPI 與XG 復(fù)合物（質(zhì)量比5∶1、2∶1、1∶1、1∶2）穩(wěn)定乳液凝膠的微觀結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定，乳滴排列緊密，未出現(xiàn)較大油滴聚集體。主要的原因有以下3 個(gè)方面，首先，隨著XG 添加量的增加，分子間靜電相互作用和空間相互作用增強(qiáng)，使乳滴粒徑減小，有助于提高乳液的凝聚穩(wěn)定性；其次，由于XG自身具備的黏度，促進(jìn)油水界面處形成了更致密的界面膜，減小了凍融過程中晶體對界面膜的破壞[23]；最后，XG 含量的增加會(huì)提高水相黏度，降低水相結(jié)晶速率并減少冰晶的生成數(shù)量[24]，HPI 與XG 在酸性條件下的分子間非共價(jià)相互作用（靜電相互作用、空間相互作用）進(jìn)一步阻礙了冷凍過程中產(chǎn)生的結(jié)晶對自身及相鄰乳滴的破壞，減少了乳液的絮凝[25]。

2.4 乳液凝膠凍融后的流變特性分析

由于在凍融過程中純HPI 組與HPI∶XG=5∶1（質(zhì)量比）試驗(yàn)組發(fā)生了破乳，因此不對這兩個(gè)試驗(yàn)組進(jìn)行流變特性分析，凍融后得乳液凝膠的流變特性如圖6 所示。

圖6 凍融后乳液凝膠的流變特性Fig.6 Rheological properties of freeze-thaw emulsion gel

由圖6A 可知，在應(yīng)力掃描模式中，經(jīng)過3 次凍融循環(huán)處理后，1∶2 試驗(yàn)組的G′和G″交叉點(diǎn)（即臨界應(yīng)力）左移，表明凍融處理后1∶2 試驗(yàn)組抵抗應(yīng)力變化的能力減弱，推測可能是由于過量的XG 會(huì)破壞HPI/XG 復(fù)合物，導(dǎo)致穩(wěn)定性下降。由圖6B 可知，所有樣品G′仍大于G″，表明凍融后能較好地維持彈性為主導(dǎo)的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。凍融后，添加XG 的試驗(yàn)組仍能保持良好黏彈性的原因與XG 的加入降低了水的結(jié)冰點(diǎn)、增強(qiáng)了分子間非共價(jià)作用并且形成的致密的界面膜、減少了結(jié)晶對液滴和界面膜的破壞有關(guān)[23-25]。結(jié)果表明，質(zhì)量比為1∶1 的HPI 與XG 對維持黏彈性結(jié)構(gòu)效果影響明顯。由圖6C 可知，所有樣品均呈現(xiàn)剪切變稀現(xiàn)象，凍融處理后，XG 與HPI 復(fù)合物組穩(wěn)定的乳液凝膠仍具備較高黏度。

2.5 乳液凝膠的貯藏過程外觀

乳液凝膠貯藏期間的外觀如圖7 所示。

圖7 貯藏期間的乳液凝膠外觀Fig.7 Appearance of emulsion gel during storage

由圖7 可知，純HPI 組穩(wěn)定的乳液凝膠，在貯藏第3 天發(fā)生明顯的相分離現(xiàn)象，隨著貯藏時(shí)間的延長，頂部顏色逐漸加深，氧化程度不斷增加。但隨著XG 的添加，乳液凝膠貯藏期間仍保持穩(wěn)定，不會(huì)發(fā)生相分離，且隨XG 添加量的增加，乳液顏色變化不明顯，表明氧化程度逐漸降低。

2.6 乳液凝膠貯藏過程穩(wěn)定性分析

為了提高乳液凝膠的營養(yǎng)價(jià)值，采用富含多不飽和脂肪酸的亞麻籽油作為油相，但過于豐富的多不飽和脂肪酸會(huì)加速脂質(zhì)氧化。因此測定乳液凝膠貯藏過程中的氧化穩(wěn)定性具有重要意義。通過檢測乳液凝膠貯藏過程中初級(jí)氧化產(chǎn)物和次級(jí)氧化產(chǎn)物變化，以監(jiān)測乳液凝膠中脂質(zhì)的氧化速率[26]。以純亞麻籽油組作為對照，乳液凝膠貯藏穩(wěn)定性結(jié)果見圖8。

圖8 乳液凝膠貯藏穩(wěn)定性Fig.8 Storage stability of emulsion gel

由圖8 可知，隨著貯藏時(shí)間的延長，所有樣品中的POV、TBARS 含量、CD 含量和CT 含量明顯增加。與純亞麻籽油相比，乳液凝膠表現(xiàn)出明顯的脂質(zhì)氧化抑制作用。隨著XG 添加量的增加，乳液凝膠的抗氧化性增強(qiáng)。當(dāng)HPI∶XG=1∶1（質(zhì)量比）時(shí)，氧化速率最低，貯藏期間產(chǎn)生POV、TBARS、CD、CT 的速率最慢，乳液凝膠的抗氧化性最強(qiáng)?？赡艿脑虬? 個(gè)方面：1）DHPM處理后的HPI 本身具有自由基清除能力，可清除油水界面的自由基[27]，阻斷脂質(zhì)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，有效抑制脂質(zhì)氧化；2）當(dāng)HPI∶XG=1∶1（質(zhì)量比）時(shí)，所形成的乳液凝膠液滴尺寸更小、分布更加均勻，增強(qiáng)了凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成了致密的界面層，可以防止油滴與連續(xù)相中促氧化劑如金屬離子之間的接觸[28]；3）游離的XG可以提高連續(xù)相的黏度并誘導(dǎo)凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成，降低促氧化劑的轉(zhuǎn)移速率，減少脂質(zhì)的氧化[29]。隨著XG 添加量的增加，致密的物理屏障和更高的連續(xù)相黏度，有效地阻止氧自由基的傳遞和轉(zhuǎn)移，進(jìn)而明顯抑制了乳液凝膠貯藏過程中初級(jí)氧化產(chǎn)物、次級(jí)氧化產(chǎn)物、共軛二烯烴和酮類物質(zhì)的產(chǎn)生速率。

3 結(jié)論

HPI 與XG 通過靜電吸引作用結(jié)合，當(dāng)HPI 與XG復(fù)配質(zhì)量比為1∶1 時(shí)，所構(gòu)建的乳液凝膠具有良好的黏彈性、凍融穩(wěn)定性和貯藏穩(wěn)定性。結(jié)果表明，HPI 與XG 分子間相互作用增強(qiáng)有助于維持乳液液滴的穩(wěn)定性、提高乳液凝膠黏彈性；XG 在HPI 表面形成致密的界面膜，阻礙了凍融過程中脂質(zhì)結(jié)晶對自身和相鄰乳液液滴的破壞，有效維持凍融后乳液凝膠的黏彈性，而致密的界面膜又可以阻礙脂質(zhì)與連續(xù)相中存在的金屬離子等促氧化劑接觸，降低自由基的擴(kuò)散速率以提高乳液氧化穩(wěn)定性。具備高凍融穩(wěn)定性、貯藏穩(wěn)定性的乳液凝膠的成功制備為蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合提供理論基礎(chǔ)，為拓展低脂乳液凝膠在食品體系中的應(yīng)用提供新的思路。