張欣如,吳陽升,汪立芹,陳 瑩,古麗米熱·阿布都熱依木,黃俊成,王旭光,林嘉鵬

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學動物科技學院,烏魯木齊 830091;2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草食家畜遺傳育種與繁殖重點實驗室,烏魯木齊 830011;3.新疆動物生物技術重點實驗室,烏魯木齊 830011)

【研究意義】卵泡是哺乳動物卵巢的基本結構組成和功能單元,卵泡發(fā)育是一個復雜的過程,受內(nèi)分泌、旁分泌和自分泌因子以及卵泡細胞周圍環(huán)境的調(diào)節(jié)。同時受多個基因調(diào)控,這些基因產(chǎn)物的相互作用可以調(diào)節(jié)顆粒細胞、卵泡膜細胞和卵母細胞的發(fā)育[1]?！厩叭搜芯窟M展】FKBPs是一種多功能蛋白,也稱為FK506結合蛋白,屬于免疫親和蛋白家族成員,在細胞中大量表達并且高度保守。研究發(fā)現(xiàn),FKBPs蛋白不僅在免疫抑制過程中起作用,還調(diào)控其它信號轉(zhuǎn)導通路[2]。FKBP5基因也被稱為FK506結合蛋白51或FKBP51,編碼FKBP5蛋白,目前被研究最多的功能,是其能通過結合其伴侶蛋白Hsp90抑制糖皮質(zhì)激素受體(GR)的信號傳遞,從而增加對應激的易感性,已被鑒定為與應激相關的精神疾病(如抑郁癥)的候選基因和生物標志物[3-4]。FKBP5參與多種生物過程,包括免疫調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)折疊和轉(zhuǎn)運[5-7]作為糖皮質(zhì)激素受體(GR)復合體的輔助伴侶,FKBP5與熱休克蛋白90(Hsp90)[8]。另外,FKBP5蛋白還在代謝調(diào)控、癌癥發(fā)生、細胞增殖及內(nèi)分泌調(diào)控等過程中發(fā)揮了重要作用[9-12]。研究發(fā)現(xiàn),牛經(jīng)過hCG誘導后,其排卵前卵泡顆粒細胞的FKBP5基因表達升高,顯著高于小卵泡和優(yōu)勢卵泡的顆粒細胞以及黃體中的表達量[13],提示FKBP5基因可能參與了卵泡的生長發(fā)育。新疆畜牧科學院生物技術研究所生殖與調(diào)控課題組前期通過轉(zhuǎn)錄組分析也發(fā)現(xiàn),羔羊經(jīng)FSH處理后,其卵泡顆粒細胞中FKBP5基因表達量發(fā)生顯著變化,FKBP5基因是否與阿勒泰羊顆粒細胞甚至卵泡發(fā)育相關,還未有相關報道。【本研究切入點】以新疆阿勒泰羊為研究對象,利用PCR擴增FKBP5CDS區(qū)全長并進行測序,同時構建分子系統(tǒng)進化樹;分析FKBP5基因或蛋白在阿勒泰羊不同組織和卵泡發(fā)育不同時期的表達量變化情況,并對FKBP5蛋白在阿勒泰羊卵巢中的表達進行定位分析,為深入探索FKBP5基因在阿勒泰羊卵泡發(fā)育中的作用提供基礎試驗數(shù)據(jù)?！緮M解決的關鍵問題】通過對阿勒泰羊不同器官組織、不同發(fā)育時期卵泡中FKBP5基因的表達特征進行分析,并對FKBP5蛋白在阿勒泰羊卵巢中的表達進行定位分析,以期為進一步研究其在阿勒泰羊卵泡發(fā)育中的生物學功能及作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用阿勒泰羊器官及組織樣本均采自烏魯木齊市華凌屠宰場。分別取3只成年阿勒泰羊個體母羊的心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、子宮、卵巢、輸卵管,公羊的睪丸等,剪成1 g的小塊,放入凍存管中,液氮保存,用于RNA和蛋白提取。挑選有較多卵泡或黃體的完整卵巢放于波恩固定液中固定,用于免疫組化。

將阿勒泰羊卵巢置于裝有37 ℃生理鹽水的保溫杯內(nèi),3 h內(nèi)送回實驗室。選取有較多卵泡的卵巢,用小鑷子剝下完整卵泡,根據(jù)直徑大小分為大卵泡(>5 mm)和小卵泡(<3 mm),分別放于生理鹽水內(nèi)。用2個干凈的小鑷子將卵泡撕開,釋放顆粒細胞,并在體視顯微鏡下?lián)斐雎亚鹇涯讣毎麖秃象w。將大、小卵泡及其顆粒細胞、卵丘細胞和膜細胞分別保存于液氮中,用于定量分析。

1.2 主要試劑

兔多克隆抗體FKBP5一抗購自武漢愛博泰克生物科技有限公司,HRP二抗購自上海碧云天生物技術有限公司,DAB顯色液購自北京蘭杰柯科技有限公司,BCA試劑盒購自美國Thermo公司,Trizol試劑和普通凝膠回收試劑盒購自南京諾唯贊生物公司,PCR擴增試劑購自普洛麥格(北京)生物技術有限公司,反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒購自成都福際生物技術有限公司,DNA Maker和大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術股份有限公司。

1.3 引物設計及合成

引物序列信息如表1所示。

表1 引物序列信息

1.4 試驗方法

1.4.1 阿勒泰羊卵巢總RNA的提取及cDNA的合成 使用TRizol法提取阿勒泰羊卵巢組織總RNA,取2 μL RNA置于Nano2000上檢測其濃度及純度,根據(jù)濃度值、RNA圖譜及OD260mm/OD280mm比值判斷RNA的質(zhì)量。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,于-20 ℃冰箱保存。

1.4.2 阿勒泰羊FKBP5基因的克隆及測序 以阿勒泰羊卵巢cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系(25 μL):模板cDNA 2 μL,上、下游引物各0.5 μL,promega 2×mix 12.5 μL,ddH2O 10.5 μL。PCR反應程序:95 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,59 ℃退火30 s,72 ℃延伸4 min 30 s,共35個循環(huán);72 ℃延伸5 min;12 ℃保存。PCR產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,膠回收,將目的片段連接至T載體上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細胞,在LB固體培養(yǎng)基(Amp+)上涂板,37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜,挑選單克隆PCR菌液驗證,陽性克隆送上海生工公司進行測序。

1.4.3 阿勒泰羊FKBP5基因相對表達量的測定 以阿勒泰羊cDNA為模板,阿勒泰羊GAPDH基因為內(nèi)參進行實時熒光定量Real time-qPCR,反應條件:95 ℃預變性10 min;95 ℃ 10 s,引物特異Tm30 s,58 ℃ 30 s,循環(huán)40次。熔解曲線分析:95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,然后從55 ℃緩慢遞增到95 ℃。根據(jù)閾值循環(huán)(CT)值計算各基因相對于內(nèi)參基因GAPDH的表達量。每組重復3次。

1.4.4 FKBP5蛋白表達水平的測定 阿勒泰羊組織樣品中加入1 mL蛋白裂解液和1%蛋白酶抑制劑,充分勻漿,4 ℃離心,加入蛋白上樣緩沖液,煮沸10 min,收集組織總蛋白。用BCA試劑盒測定蛋白濃度。每孔加入蛋白在SDS-PAGE凝膠跑電泳,將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上,用含有5%脫脂奶粉的TBST液,室溫封閉1 h;洗脫封閉液,一抗孵育1 h,洗3次;二抗孵育40 min,洗3次;用ECL顯影液[m(A液)∶m(B液)]=1∶1顯影,GE6100系統(tǒng)檢測化學發(fā)光,ImageJ軟件分析蛋白灰度值。

1.4.5 阿勒泰羊卵巢免疫組織化學分析 阿勒泰羊卵巢用波恩固定液固定24 h后,換70%酒精保存。常規(guī)石蠟包埋,石蠟切片。石蠟切片脫蠟,復水,用蒸餾水浸洗;抗原熱修復,PBS洗3次;3% H2O2封閉,PBS洗3次;5% BSA室溫封閉1 h;加FKBP5一抗(1∶100),室溫孵育90 min,PBS洗3次;加HRP二抗(1∶50),室溫孵育40 min,PBS洗3次;加入DAB顯色試劑,自來水沖洗;放入蘇木素染劑復染,自來水浸洗;鹽酸酒精分化,自來水浸洗;脫水/透明,樹膠封片。

1.4.6 阿勒泰羊FKBP5氨基酸序列系統(tǒng)進化樹分析 根據(jù)克隆得到的FKBP5基因序列和從GenBank下載的基因序列分析核酸和氨基酸序列,使用Mega11.0中的鄰接法(NJ)構建進化樹,不同物種GenBank登錄號如表2所示。

1.5 統(tǒng)計分析

使用GraphPad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計分析,組間差異通過One-way ANOVA多重比較進行方差分析和顯著性檢驗,數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示。

表2 不同物種GenBank登錄號

圖1 總RNA凝膠電泳

2 結果與分析

2.1 阿勒泰羊總RNA提取質(zhì)量檢測

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測阿勒泰羊總RNA完整性。從圖1可知,28S和18S 2個條帶清晰,無拖尾現(xiàn)象,表明提取的總RNA完整性好。采用分光光度計測定RNA濃度,OD260mm/OD280mm在1.8～2.1,表明RNA純度和濃度較好,可用于后續(xù)實驗。

1:FKBP5全長片段; M:DNA Marker。

圖3 FKBP5基因的核苷酸序列及氨基酸序列

2.2 阿勒泰羊FKBP5 mRNA 序列的克隆及生物信息學分析

以阿勒泰羊卵巢cDNA為模板,用FKBP5基因克隆引物(表1)進行PCR擴增,產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析,獲得符合預期大小(1532 bp)的目的條帶(圖2)。將菌液PCR的陽性克隆進行測序鑒定,結果表明,成功克隆阿勒泰羊FKBP5基因1532 bp序列(圖3)。

經(jīng)測序和拼接后,得到1390 bp的FKBP5基因開放閱讀框全長,共編碼462個氨基酸(圖3)。與預測序列(登錄號:XM_042237052.1)相比,FKBP5基因的編碼區(qū)序列完全一致,不存在變異位點。

為了進一步了解綿羊FKBP5基因與其他物種之間的親緣關系,使用MEGA11.0軟件中的NJ法對綿羊、牛、人、雞、山羊、黑猩猩、小鼠、豬、兔和馬等不同物種構建系統(tǒng)進化樹。綿羊FKBP5基因與山羊位于同一分支,表明它們之間的親緣關系較近,而與雞(禽類)親緣關系較遠(圖4)。

2.3 FKBP5基因和蛋白在阿勒泰羊不同器官及組織中的表達分析

利用Real-time qPCR和Western Blot檢測阿勒泰羊心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、子宮、卵巢、輸卵管和睪丸等9個器官和組織中FKBP5基因和蛋白的表達量。FKBP5基因在各個器官和組織中均有表達,在輸卵管中表達量最高,隨后依次是肝臟、脾臟、子宮、卵巢和睪丸,在心臟、肺和腎臟中表達量較低(圖5-A)。Western Blot結果與定量結果基本一致,阿勒泰羊FKBP5蛋白分子量為51 kD,在阿勒泰羊輸卵管中豐度較高,在肺和腎臟等組織中表達量較低(圖5-B)。說明FKBP5基因可能與阿勒泰羊生殖有關系。

2.4 阿勒泰羊FKBP5基因和蛋白在卵泡細胞中的表達定位分析

從圖6-A可知,阿勒泰羊FKBP5基因在大卵泡中的表達量最高,且極顯著高于卵巢、小卵泡和黃體(P<0.01),其次是卵巢和小卵泡,在黃體中表達量最低。

圖4 MEGA 11.0 鄰接法(NJ)構建進化樹

圖5 阿勒泰羊不同組織中FKBP5 mRNA水平表達(A)、蛋白表達量及灰度值分析(B)

A:實時定量 PCR 驗證 FKBP5 在不同大小卵泡及黃體中的表達,小寫字母代表差異顯著(P<0.05),大寫字母代表差異極顯著;B:實時定量 PCR 驗證 FKBP5在各卵泡細胞中的表達(GCs,顆粒細胞;CCs,卵丘細胞;Oo,卵母細胞;TCs,膜細胞);不同字母代表差異顯著(P<0.05);C～J:免疫組化檢測FKBP5在卵泡中的定位表達。C:原始卵泡;D:初級卵泡;E:次級卵泡;F:小有腔卵泡;G:大有腔卵泡;H:大有腔卵泡卵丘卵母細胞復合體;I:黃體;J:陰性對照)。C、D、E標尺為20 μm,F、G、I、J標尺為200 μm,H標尺為50 μm。

從圖6-B可知,FKBP5基因在阿勒泰羊卵巢大、小卵泡不同細胞中的表達情況略有不同,在大卵泡膜細胞中的表達極顯著高于其他各類細胞(P<0.01),而在大卵泡顆粒細胞中的表達量也顯著高于小卵泡的顆粒細胞、膜細胞以及大、小卵泡的卵丘細胞(P<0.05)。FKBP5基因在大卵泡顆粒細胞中表達量最高。說明FKBP5蛋白可能參與卵泡發(fā)育,FKBP5蛋白可能促進卵泡進一步發(fā)育成優(yōu)勢卵泡。

從圖6-C～6-J可知,FKBP5蛋白在初級、次級卵泡和黃體組織中均有表達,在大、小有腔卵泡的卵母細胞、卵丘細胞、顆粒細胞及膜細胞中也有表達。說明FKBP5蛋白可能參與卵泡發(fā)育。

3 討 論

FKBP5蛋白在藥物抵抗、免疫及治療癌癥等方面的研究較多[14-16]。近年來,豬、雞、鴨等畜禽的FKBP5基因已被陸續(xù)克隆,且在豬T淋巴細胞增殖和鴨成肌細胞增殖分化中進行了相對深入的功能研究[17-18]。但關于FKBP5 蛋白參與阿勒泰羊繁殖相關過程上的研究還未見報道。本研究發(fā)現(xiàn),FKBP5蛋白與其他物種有較高的同源性,這將為在后續(xù)研究中將其廣泛應用于不同物種奠定基礎。

FKBP5基因在人體基因中廣泛表達,在心臟、肝臟、腎臟、外周淋巴細胞、卵巢、睪丸等器官和組織中表達量較高[19]。本研究發(fā)現(xiàn),FKBP5基因和蛋白在阿勒泰羊心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、子宮、卵巢、輸卵管、睪丸中均有表達,但在肝臟、子宮、卵巢、輸卵管、睪丸表達量較高,這與在前人的相關研究結果一致[20],說明FKBP5基因在阿勒泰羊中也是廣泛表達的,且在卵巢、輸卵管和睪丸等生殖器官中表達量較高。定量和免疫組化結果也說明,FKBP5蛋白在卵巢的不同時期卵泡及不同類型細胞中也均有表達。

在松鼠猴的研究中發(fā)現(xiàn),黃體酮能直接調(diào)控FKBP5基因的轉(zhuǎn)錄,并且FKBP5基因表達量的增加導致其對黃體酮的反應減弱[21]。在牛顆粒細胞中也發(fā)現(xiàn),FKBP5基因的表達量在hCG誘導后的排卵前卵泡中顯著升高,而在黃體中顯著降低[13]。本研究發(fā)現(xiàn),FKBP5基因的表達量隨著卵泡發(fā)育不斷升高,到黃體期又顯著下降,大卵泡中FKBP5基因的表達量極顯著高于小卵泡和黃體(P<0.01);并且在不同大小卵泡顆粒細胞中的表達也存在差異,大卵泡顆粒細胞的表達量顯著高于小卵泡顆粒細胞中的表達量(P<0.05)。阿勒泰羊卵巢卵泡的直徑直接反應其發(fā)育階段,一般認為卵泡小于3 mm處于卵泡募集期,3～5 mm處于卵泡選擇期,大于5 mm的卵泡就是優(yōu)勢卵泡或排卵前卵泡[22]。本研究結果與對牛的研究結果[13]類似,表明阿勒泰羊卵巢從募集期的小卵泡發(fā)育到排卵前的大卵泡,LH濃度不斷升高的同時,黃體酮濃度也隨之增加,從而在大卵泡時刺激FKBP5基因的轉(zhuǎn)錄,可能導致FKBP5基因在顆粒細胞中的表達增加而形成一個較短的負反饋循環(huán),來參與減弱顆粒細胞分泌孕酮的反應,在黃體期又迅速下降。這將為深入研究FKBP5基因在阿勒泰羊卵巢中的調(diào)控及功能提供新的試驗依據(jù)。

FKBP5蛋白作為一種支架蛋白,可以招募磷酸酶PHLPP來促進AKT及其下游靶點p38MAPKα(也被稱為MAPK14)的去磷酸化,從而降低糖皮質(zhì)激素受體的活化[23-24]。類似的機制可能與形成LH峰后的孕酮受體有關。在牛的研究中發(fā)現(xiàn),顆粒細胞中AKT/p38MAPKα的磷酸化是通過對EGFR的激活而增加的,EGF樣蛋白、表皮調(diào)節(jié)蛋白(EREG)和雙調(diào)節(jié)蛋白(AREG)結合后,LH/hCG濃度的激增誘導了牛顆粒細胞中的EREG和AREG[25-26]。這種依賴于EGFR的AKT/p38MAPKα 通路的激活可能有助于孕激素受體的磷酸化和激活[27-28]?；诖送茰y,隨著阿勒泰羊排卵前LH濃度升高,顆粒細胞中FKBP5蛋白的高表達可能會限制EGFR依賴的AKT/p38MAPKα 發(fā)生磷酸化,降低孕酮受體的磷酸化和活化,從而減弱排卵和初始黃體形成期間顆粒細胞分泌孕酮的反應性。為了驗證這種推測還需在阿勒泰羊顆粒細胞上進一步研究。

4 結 論

本研究克隆得到阿勒泰羊FKBP5基因CDS區(qū)序列1390 bp,編碼個462氨基酸;綿羊FKBP5基因與山羊和牛關系較近,與雞(禽類)親緣關系較遠;阿勒泰羊FKBP5基因和蛋白在心、肝臟、脾、肺、腎、子宮、輸卵管、卵巢和睪丸的表達存在差異,在輸卵管中表達較高;在大、小卵泡及其不同細胞和黃體中的表達也存在一定差異,在大卵泡及其顆粒細胞中表達量較高;阿勒泰羊FKBP5蛋白在卵泡中各類細胞中均有表達。本研究初步探討了FKBP5基因在阿勒泰羊卵巢中的表達和定位,但其在阿勒泰羊卵泡發(fā)育過程中的作用還需進一步研究。