董志強(qiáng),史正軍,謝惠春,曾 偉,馮世秀,鄧 麗

(1.青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,西寧 810008;2.深圳市中國(guó)科學(xué)院仙湖植物園/深圳市南亞熱帶植物多樣性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 深圳 518004;3.廣東深圳城市森林生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家定位觀測(cè)研究站,廣東 深圳 518004)

【研究意義】土壤細(xì)菌是土壤生態(tài)系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分,在生態(tài)系統(tǒng)中占據(jù)重要地位。土壤細(xì)菌在土壤發(fā)育過(guò)程中起著物質(zhì)循環(huán)、能量流動(dòng)和信息傳遞等關(guān)鍵作用,且土壤細(xì)菌群落變化也是反映土壤發(fā)育程度和健康狀況的重要指標(biāo)[1]。不同恢復(fù)模式不僅可以改變土壤細(xì)菌群落和多樣性,而且對(duì)土壤微環(huán)境也有重要影響[2]。本研究通過(guò)分析景觀林、人工林和次生林3種林分類(lèi)型對(duì)土壤細(xì)菌群落的作用,研究不同植物類(lèi)型與土壤細(xì)菌群落之間的關(guān)系?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究表明,不同植被會(huì)引起土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的不同[3]。不同植被凋落物的量、土壤酸堿度及不同植被區(qū)域土壤C、N和P含量也是影響土壤微生物群落的因素[4-5]。微生物是一種重要的環(huán)境因子,在改變土壤微環(huán)境中發(fā)揮重要作用。其存在會(huì)改變土壤中的微生態(tài)平衡,并促進(jìn)植物的健康成長(zhǎng)[6-7]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】1990年以來(lái),深圳市積極推進(jìn)“滅荒復(fù)綠”運(yùn)動(dòng),大力發(fā)展馬占相思人工林,使其成為當(dāng)?shù)氐闹匾坝^[8],為紀(jì)念香港回歸種植土沉香景觀林以及天然次生林3種林分類(lèi)型,利用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)不同林分土壤細(xì)菌群落變化特征?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】從微觀角度探討3種林分土壤細(xì)菌群落特征,分析不同林分土壤細(xì)菌群落組成及多樣性的變化趨勢(shì),為研究南亞熱帶不同植被恢復(fù)模式林分生態(tài)系統(tǒng)特征提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

深圳市屬于亞熱帶海洋性氣候,全市平均氣溫22.4～38.7 ℃,極端情況下低至0.2 ℃,無(wú)霜期355 d。雨量充沛,4—9月是雨季,降雨量達(dá)1933.3 mm。9塊林內(nèi)含3塊沉香人工林(“97回歸林”)、3塊馬占相思人工林和3塊天然次生林。在海拔91～110 m的山谷和丘陵地帶,植被豐富,大部分都是由花崗巖構(gòu)成的酸性赤紅壤。土沉香林(表示為“A”)林齡約25年,優(yōu)勢(shì)樹(shù)種為土沉香,平均胸徑15.6 cm,平均樹(shù)高8.2 m,郁閉度0.85;下層植被主要為蟛蜞菊(Pengqijudecoction),覆蓋度10%。馬占相思林(表示為“B”)林齡約35年,優(yōu)勢(shì)樹(shù)種為馬占相思,平均胸徑27.5 cm,平均樹(shù)高23.4 m,郁閉度0.85;下木主要為紫金牛(Ardisiajaponica);灌木主要為豺皮樟(Litsearotundifoliavaroblongifolia)與珊瑚樹(shù)(Viburnumodoratissimum),平均樹(shù)高2.5 m,蓋度為75%;草本主要為芒箕,蓋度為80%～90%。次生林(表示為“C”)林齡大概30年,優(yōu)勢(shì)樹(shù)種為黃牛木(Cratoxylumcochinchinense)與栲樹(shù)(Castanopsisfargesii),平均胸徑14.1 cm,平均樹(shù)高11.5 m,郁閉度0.95;下木主要為紫金牛,平均樹(shù)高1.5 m;灌木主要為珊瑚樹(shù),平均樹(shù)高3.8 m,蓋度15%;草本主要為苔草(Carexleucochlora)、芒箕(Dicranopterisdichoyoma)、鐵線(xiàn)蕨(Adiantumcapillus-veneris),蓋度5%。

1.2 樣地選擇和樣品采集

各林分固定樣地規(guī)格為20 m×20 m,內(nèi)設(shè)5 m×5 m共3塊小樣方。同林分各樣地間距約50 m。本研究在每塊樣地的3塊小樣方中心區(qū)域進(jìn)行取樣,記為該固定樣地的3次重復(fù)。為減小每種林分樣地之間的影響,樣地與樣地之間設(shè)置50 m過(guò)渡帶。取土之前先從土壤表層剝離出0～10 cm層的凋落物,并從中取出5個(gè),均勻混合,最終獲得27個(gè)土壤樣品。將這些樣品帶回實(shí)驗(yàn)室,其中一部分經(jīng)過(guò)風(fēng)干處理,篩選出2 mm顆粒,用于土壤理化性質(zhì)檢測(cè),另一部分則保存-80 ℃超低溫冰箱中,以備后續(xù)測(cè)定土壤細(xì)菌多樣性。

1.3 土壤化學(xué)性質(zhì)分析方法

重鉻酸鉀氧化-外加熱法確定土壤有機(jī)質(zhì),鉬銻抗比色法測(cè)定速效磷,凱氏定氮法測(cè)出全氮,火焰光度法測(cè)出全鉀,NaOH堿溶-鉬銻抗比色法測(cè)出全磷,NH4Ac浸提-火焰光度法測(cè)定速效鉀,水解性氮通過(guò)堿解擴(kuò)散法測(cè)定,酸堿度通過(guò)電位法(土地比為1∶2.5)和電導(dǎo)法(土地比為1∶5)確定[9]。

1.4 土壤DNA提取

采用E.Z.N.A.提取試劑盒(D4015,Omega,Inc.,USA),根據(jù)其產(chǎn)品標(biāo)簽的指示,從中抽取出微生物的DNA樣本,利用NanoDrop ND-1000分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)或者0.8%瓊脂糖凝膠電泳,對(duì)獲得的DNA數(shù)量及其質(zhì)量作出準(zhǔn)確檢驗(yàn)。為了更深入地研究樣本,需將其放置在-80 ℃低溫條件下。

表1 3種不同恢復(fù)模式林分土壤基本化學(xué)性質(zhì)

1.5 基因擴(kuò)增與測(cè)序

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物序列為341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和805R(5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)。在測(cè)定土壤細(xì)菌V3～V4區(qū)域時(shí),采用PCR反應(yīng)體系,其中包括DNA 50 ng、PCR預(yù)混物12.5 μL、正反向引物各2.5 μL和dd H2O 25 μL。擴(kuò)展過(guò)程分別為:98 ℃預(yù)變性30 s,98 ℃改變10 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延長(zhǎng)45 s,35個(gè)周期,最后延長(zhǎng)10 min。高通量測(cè)序委托廣州普樂(lè)倍康生物科技有限公司完成。

1.6 數(shù)據(jù)處理及作圖

采用Microsoft Excel 2013對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理,采用SPSS 26.0進(jìn)行方差分析比較不同林分土壤化學(xué)性質(zhì)差異性,通過(guò)RDA冗余分析探討土壤化學(xué)指標(biāo)與土壤細(xì)菌群落之間的關(guān)系,并利用R語(yǔ)言中g(shù)gplot2包進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同恢復(fù)模式林分土壤化學(xué)性質(zhì)基本特征

由表1可知,經(jīng)過(guò)25～30年的恢復(fù)期后,3種林分土壤化學(xué)性質(zhì)表現(xiàn)出一定差異。其中闊葉次生林有機(jī)質(zhì)平均含量為105.2 g/kg,顯著高于土沉香林(73.7 g/kg),而土沉香林和馬占香思林之間、闊葉次生林和馬占相思林之間土壤有機(jī)質(zhì)平均含量無(wú)顯著差異(P>0.05,下同),土壤全氮和水解性氮表現(xiàn)為闊葉次生林和馬占相思林之間無(wú)顯著差異,但均顯著高于土沉香林(P<0.05,下同);而土壤全磷和有效磷平均含量則相反,表現(xiàn)為土沉香林最高。土壤全鉀平均含量表現(xiàn)為闊葉次生林最高,其它2個(gè)林分差異不顯著,但速效鉀含量則表現(xiàn)為土沉香林顯著高于其它2個(gè)林分。3種恢復(fù)模式林分之間土壤pH呈顯著差異。其中,土沉香林土壤pH平均值為6.25,而馬占相思林和闊葉次生林土壤pH分別為4.0和4.61。土壤電導(dǎo)率表現(xiàn)為闊葉次生林最低,土沉香林和馬占相思林土壤電導(dǎo)率未表現(xiàn)出顯著差異。

2.2 不同恢復(fù)模式林分土壤細(xì)菌群落多樣性

2.2.1 阿爾法(Alpha)多樣性分析 韋恩圖可以揭示3種林分細(xì)菌群落門(mén)水平下共有和特有的菌群。本研究選取豐度>1%的菌群,從門(mén)分類(lèi)水平上進(jìn)行分析,共鑒定出44個(gè)門(mén),其中馬占相思林和次生林各有一個(gè)獨(dú)有菌群,土沉香林土壤門(mén)水平細(xì)菌群落有9個(gè)特有的細(xì)菌群落(圖1)。

由圖2可知,在3種不同林分中, 次生林土壤細(xì)菌群落 Chao1指數(shù)高于土沉香林與馬占相思林土壤細(xì)菌群落Chao1指數(shù),但三者不存在顯著差異。土沉香林土壤細(xì)菌群落Shannon指數(shù)與馬占相思林土壤以及次生林土壤細(xì)菌群落Shannon指數(shù)均存在顯著差異,而馬占相思林土壤細(xì)菌群落Shannon指數(shù)與天然次生林土壤細(xì)菌群落Shannon指數(shù)無(wú)顯著差異。說(shuō)明土沉香林土壤細(xì)菌群落數(shù)量在門(mén)水平上結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜。

2.2.2 貝塔(Beta)多樣性分析 通過(guò)坐標(biāo)中上的點(diǎn),分析不同樣本群落組成,反應(yīng)樣本之間的差異和距離,基于 Bray-Curtis 對(duì)其進(jìn)行 PCoA 分析(主坐標(biāo)分析),反映樣本間的差異和距離因素。由圖3可知,在土壤微生物群落中主成分1(PCoA1)的貢獻(xiàn)率為26.21%,主成分2(PCoA2)的貢獻(xiàn)率為14.1%。土沉香林與馬占相思林橢圓沒(méi)有存在交集,表示兩種土壤中細(xì)菌組成成分不相似;次生林橢圓幾乎與土沉香林和馬占相思林重疊,表明該地區(qū)土壤細(xì)菌群落與其余二者中土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成相似。

圖1 門(mén)水平上3種林分細(xì)菌群落

圖2 α多樣性指數(shù)

2.3 不同恢復(fù)模式土壤細(xì)菌群落組成

在分析土壤細(xì)菌群落組成時(shí),過(guò)濾掉相對(duì)豐度0.001%的群落,保留在各組樣品群落出現(xiàn)頻率為70%以上的菌群,對(duì)檢測(cè)出對(duì)各個(gè)水平前10的群落進(jìn)行分析。由圖4可知,土沉香林土壤細(xì)菌群落在門(mén)水平分別為變形菌門(mén)(Proteobacteria,34.64%)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria,25.92%)、放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria,9.03%)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi,5.27%)、疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia,3.97%)、浮霉菌門(mén)(Planctomycetes,3.82%)等。馬占相思林土壤細(xì)菌群落中酸桿菌門(mén)(Acidobacteria,37.32%)為優(yōu)勢(shì)菌群,其次為變形菌門(mén)(Proteobacteria)、放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria)以及WPS和疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia)等。次生林土壤細(xì)菌群落在門(mén)水平優(yōu)勢(shì)菌群分別為酸桿菌門(mén)(Acidobacteria,41.37%)、變形菌門(mén)(Proteobacteria,28.78%)、放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria,8.9%)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi,4.26%)、疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia,4.04%)等。

2.4 土壤細(xì)菌群落與環(huán)境因子冗余分析

通過(guò)RDA冗余分析發(fā)現(xiàn),3種林分土壤細(xì)菌群落組成與土壤環(huán)境因子之間存在顯著關(guān)聯(lián),第一排序軸的特征值高達(dá)32.63%,第二排序軸的特征值達(dá)7.75%,前兩軸的累計(jì)解釋變量占總特征值的40.38%。RDA冗余分析可以很好地反映土壤細(xì)菌群落與環(huán)境因子直接關(guān)系的相關(guān)性。研究表明,土沉香林的樣本點(diǎn)分布十分稀疏,表明不同林分的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異,且這種差異受土壤理化特征的顯著影響。馬占相思林的樣本點(diǎn)密集,說(shuō)明不同樣地土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)基本相似且受土壤理化性質(zhì)影響較小。研究發(fā)現(xiàn),形菌群和浮霉菌群與速效鉀、有效磷及全磷呈顯著正相關(guān)。酸桿菌門(mén)與土壤pH、有效磷和速效鉀呈極顯著負(fù)相關(guān);綠彎菌門(mén)與有機(jī)質(zhì)和全氮之間呈顯著負(fù)相關(guān)。

3 討 論

3.1 不同恢復(fù)模式林分土壤細(xì)菌群落組成

不同植被類(lèi)型會(huì)影響土壤細(xì)菌群落類(lèi)型和組成,細(xì)菌作為植物與土壤之間的媒介,使其互相適應(yīng),共同生長(zhǎng)發(fā)育[3]。本研究發(fā)現(xiàn),酸桿菌門(mén)、變形菌門(mén)及放線(xiàn)菌門(mén)是本研究區(qū)域的主要優(yōu)勢(shì)菌群。與楊虎等[9]對(duì)寧夏南部生態(tài)移民遷出區(qū)土壤微生物組成的研究結(jié)果類(lèi)似,不同恢復(fù)模式下的細(xì)菌相對(duì)豐度并不一樣,說(shuō)明不同植被類(lèi)型對(duì)土壤中細(xì)菌數(shù)量有一定影響。其原因可能是不同恢復(fù)模式土壤養(yǎng)分不同,因此會(huì)形成不同的微生物群落且微生物量也不同[10]。土沉香林土壤pH 6.25,表明該林地土壤屬于弱酸性,酸桿菌門(mén)為主要優(yōu)勢(shì)菌群。這與鄭威等[11]的研究結(jié)果一致。高溫土壤環(huán)境利于放線(xiàn)菌門(mén)的生長(zhǎng)發(fā)育[12],本研究采樣時(shí)間為夏季,土壤養(yǎng)分豐富,為土壤中放線(xiàn)菌門(mén)提供適合生長(zhǎng)發(fā)育的水熱條件。變形菌門(mén)在土壤中最活躍且最豐富,在3種林分土壤中,土沉香林土壤變形菌門(mén)相對(duì)豐度高于其余2種林分,可能是由于土沉香林土壤為其提供一個(gè)適合變形菌門(mén)的生長(zhǎng)環(huán)境。馬占相思林土壤放線(xiàn)菌群相對(duì)豐度比其余2種林分高,可能是由于馬占相思林植被生長(zhǎng)在較為空曠的山地,樹(shù)與樹(shù)之間的距離較遠(yuǎn),郁閉度較低,導(dǎo)致陽(yáng)光直射在土壤表層,形成高溫干旱的環(huán)境。綠彎菌門(mén)屬于自養(yǎng)型細(xì)菌,可以生活在各種復(fù)雜的環(huán)境中,這可能是導(dǎo)致土壤中綠彎菌門(mén)豐度高的原因之一,也有可能是因?yàn)橥寥阑仔再|(zhì)對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響較大,從而導(dǎo)致該地區(qū)土壤中綠彎菌門(mén)數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其余2種土壤[13]。

圖4 門(mén)水平土壤細(xì)菌群落分布A(土沉香林)、B(馬占相思林)和C(次生林)

A.土沉香林;B.馬占相思林;C.次生林;V1.Others; V7.Acidobacteria; V8.Actinobacteria; V15.Chloroflexi; V26.Gemmatimonadetes;V33.Planctomycetes;V34.Proteobacteria; V41.Verrucomicrobia; V42.WPS-2; SOM.有機(jī)質(zhì);TK.全鉀; NN.水解性氮; TN.全氮;TP.全磷;AK.速效鉀; AP.有效磷; EC.電導(dǎo)率;pH.酸堿度。

3.2 不同恢復(fù)模式土壤理化性質(zhì)與土壤細(xì)菌群落的關(guān)系

土壤理化性質(zhì)影響土壤細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)及多樣性。反之,土壤細(xì)菌群落又能有效改變土壤的肥力特征,并且能夠有效降低土壤中的有害元素[14]。RDA冗余分析發(fā)現(xiàn),酸桿菌門(mén)與土壤pH、有效磷和速效鉀呈極顯著負(fù)相關(guān),酸桿菌屬于寡營(yíng)養(yǎng),在嗜酸環(huán)境生長(zhǎng),植被根系交錯(cuò)盤(pán)踞在土壤中,分泌出大量有機(jī)酸,為酸桿菌群提供適合生長(zhǎng)發(fā)育的環(huán)境[15-16]。變形菌群和浮霉菌群與速效鉀、有效磷及全磷呈顯著正相關(guān),這與杜昊楠等[17]研究結(jié)果相似。

4 結(jié) 論

不同林分土壤中,變形菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)和酸桿菌門(mén)為土壤細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群但相對(duì)豐度不同。不同林分土壤細(xì)菌群落多樣性有差異,通過(guò)α多樣性分析,次生林土壤細(xì)菌群落 Chao1 指數(shù)最高,但3種林分土壤細(xì)菌群落Chao1指數(shù)無(wú)顯著差異(P>0.05)。土沉香林土壤細(xì)菌群落Shannon 指數(shù)均顯著高于馬占相思林與次生林(P<0.05),說(shuō)明土沉香林土壤中細(xì)菌群落種類(lèi)多于其余兩種林分類(lèi)型。β多樣性分析顯示,土沉香林土壤細(xì)菌群落與馬占相思林土壤細(xì)菌群落有差異。變形菌群和浮霉菌群與速效鉀、有效磷及全磷呈顯著正相關(guān)。酸桿菌門(mén)與土壤pH、有效磷和速效鉀呈極顯著負(fù)相關(guān)。

土壤特性與土壤細(xì)菌群落之間互惠共生,相互適應(yīng)生長(zhǎng),不同恢復(fù)模式下的措施不僅在宏觀上改變了不同植被類(lèi)型與土壤之間的關(guān)系,而且從微觀上也改變了土壤內(nèi)微環(huán)境,從而改變土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其組成成分。不同恢復(fù)模式下的土壤細(xì)菌群落優(yōu)勢(shì)種基本相同,但其余細(xì)菌豐度均不相同,土壤細(xì)菌各個(gè)群落的功能各不相同,參與土壤內(nèi)環(huán)境能量流動(dòng)與物質(zhì)運(yùn)輸?shù)然顒?dòng)越多,該土壤細(xì)菌群落的相對(duì)豐度也越高。本研究不僅可以了解不同恢復(fù)模式下土壤細(xì)菌群落的組成和差異,也可以了解土壤中細(xì)菌群落對(duì)土壤環(huán)境變化的適應(yīng)情況。本研究利用不同植被對(duì)土壤環(huán)境進(jìn)行改變,從而為后續(xù)選取合適的恢復(fù)模式提供理論依據(jù)。目前,經(jīng)過(guò)人工恢復(fù)綠植后的人工林土壤退化嚴(yán)重、生長(zhǎng)力低下,且不同恢復(fù)方式下的植被具備的環(huán)境條件也不一樣,生長(zhǎng)發(fā)育節(jié)律也有差異,后續(xù)研究中,在不同時(shí)間(比如一年四季土壤的理化性質(zhì)和土壤細(xì)菌群落的動(dòng)態(tài)變化特征)進(jìn)行研究,通過(guò)更長(zhǎng)的時(shí)間恢復(fù),來(lái)判斷人工恢復(fù)的模式是否優(yōu)于自然條件恢復(fù)模式,因此,通過(guò)了解不同恢復(fù)方式措施下的林分土壤中細(xì)菌差異以及功能顯得尤為重要。