劉寶寶,孟桂智,劉祖江,賈晶瑩,段紅娟,馬 云,蔡小艷

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院/寧夏回族自治區(qū)反芻動(dòng)物分子細(xì)胞育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,銀川 750021)

【研究意義】畜牧生產(chǎn)中,苜蓿(Medicagosativa)作為奶牛重要的飼料來源之一,與產(chǎn)奶量和乳品質(zhì)密切相關(guān)。而miR156家族作為苜蓿中表達(dá)最高的miRNA之一[1],探究和挖掘其生物信息和調(diào)控功能具有潛在的研究意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】微小RNA(microRNA,miRNA)是生物體內(nèi)普遍存在的一種內(nèi)源性的單鏈非編碼RNA,長度大約為18～25 nt。最初在秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans,C.elegan)體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)[2]。其發(fā)揮作用的方式是通過miRNA與靶基因3’非翻譯區(qū)(Untranslated regions,UTR)抑制性結(jié)合,抑制該蛋白合成或誘導(dǎo)該mRNA降解,從而對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控[3]。miRNA參與包括細(xì)胞間信號(hào)傳遞,細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及細(xì)胞代謝等多種生物進(jìn)程[4-5]。植物miRNA與動(dòng)物miRNA最大的區(qū)別在于植物miRNA 3’末端具有2’-O-甲基化修飾,甲基化修飾不僅能夠增強(qiáng)miRNA的穩(wěn)定性,還能保護(hù)甲基化修飾的miRNA不會(huì)被核酸外切酶降解[6]。甲基化修飾使植物miRNA經(jīng)過加工、烹飪和儲(chǔ)存等預(yù)處理后不會(huì)被降解,依然可以進(jìn)入人和動(dòng)物體內(nèi)跨界調(diào)控發(fā)揮一定作用[7]。目前,植物跨界調(diào)控主要在抑制乳腺癌增長、促進(jìn)細(xì)胞增殖、預(yù)防疾病等方面研究較多[8-10]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】苜蓿在畜牧生產(chǎn)中是非常重要的經(jīng)濟(jì)作物,有“牧草之王”之稱的紫花苜蓿產(chǎn)草量高,適口性好,營養(yǎng)價(jià)值高,不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)和維生素等營養(yǎng)成分,而且富含動(dòng)物所需的必需氨基酸、微量元素和未知生長因子[11]。苜蓿以其干草和青貯形式飼喂奶牛在奶牛瘤胃中更容易消化[12]。在日糧中添加苜蓿飼喂荷斯坦奶牛,能夠增加牛乳中乳蛋白率、提高消化率和產(chǎn)奶量[13]。因此,探究苜蓿中的非編碼RNA將具有非常大的潛力。苜蓿中miR156家族成員較多,且在奶牛體內(nèi)具有復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系。明確其家族基因的序列組成及調(diào)控功能,是畜牧生產(chǎn)中利用苜蓿非編碼RNA的關(guān)鍵所在?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究將利用生物信息學(xué)方法,對(duì)mtr-miR156基因家族成員進(jìn)行成熟序列和莖環(huán)序列保守性分析、成熟序列染色體定位、莖環(huán)序列同源樹分析和靶基因預(yù)測,為mtr-miR156在奶牛體內(nèi)的調(diào)控研究以及苜蓿優(yōu)良品種選育等提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

在植物miRNA數(shù)據(jù)庫PmiREN(http://www.pmiren.com/)中搜索mtr-miR156數(shù)據(jù)信息,通過下載獲得mtr-miR156家族全部成員的成熟序列、莖環(huán)序列和染色體定位信息。

1.2 序列比對(duì)和同源樹分析

利用weblogo(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)在線網(wǎng)站對(duì)mtr-miR156家族成員的成熟序列和莖環(huán)序列進(jìn)行多序列比對(duì),并繪制序列保守性分析圖。Logo圖可以顯示出序列中每個(gè)位置上堿基出現(xiàn)的頻率和序列保守程度,其中參數(shù)均設(shè)置為默認(rèn)值。通過DNAMAN軟件對(duì)mtr-miR156家族10名成員的莖環(huán)序列進(jìn)行比對(duì)分析并繪制同源樹,其中參數(shù)均設(shè)置為默認(rèn)值。

1.3 靶基因預(yù)測及功能富集分析

利用聯(lián)川生物云平臺(tái)(https://www.omicstudio.cn/index)、TargetScan、RNAhybrid在線網(wǎng)站預(yù)測獲得mtr-miR156家族成員在牛體內(nèi)的靶基因信息以及靶基因Geng Ontology(GO)功能注釋和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 mtr-miR156家族成熟序列保守性分析及其基因定位

利用PmiREN數(shù)據(jù)庫共搜索到10個(gè)mtr-miR156家族成員(表1)。結(jié)果顯示,除了mtr-miR156g和mtr-miR156j的長度分別為22和21 nt外,其余8個(gè)成員的長度均為20 nt。利用數(shù)據(jù)庫對(duì)10個(gè)家族成員進(jìn)行基因定位,發(fā)現(xiàn)10個(gè)成熟序列共分布在3條染色體上,分別為染色體1、3和4。其中有5個(gè)成員位于染色體3上,分別是mtr-miR156c、mtr-miR156d、mtr-miR156e、mtr-miR156f、mtr-miR156g,有3個(gè)成員位于染色體1上,分別是mtr-miR156a、mtr-miR156b、mtr-miR156j,有2個(gè)成員位于染色體4上,分別是mtr-miR156h、mtr-miR156i。利用DNAMAN軟件對(duì)mtr-miR156家族成員成熟序列進(jìn)行保守性分析(圖1),結(jié)果表明,除mtr-miR156g和mtr-miR156j外,其余成熟序列中20 nt完全保守。

表1 mtr-miR156家族成熟序列及其基因定位

圖1 mtr-miR156家族成熟序列的保守性分析

2.2 mtr-miR156家族成員莖環(huán)序列的保守性分析

對(duì)mtr-miR156家族莖環(huán)序列進(jìn)行保守性分析(表2)發(fā)現(xiàn),堿基長度有4個(gè)組別(mtr-miR156d、mtr-miR156f長度為81 nt;mtr-miR156h、mtr-miR156i長度為84 nt;mtr-miR156a、mtr-miR156b、mtr-miR1 56j長度為86 nt;mtr-miR156c、mtr-miR156e、mtr-miR156g長度為89 nt)。通過DNAMNA軟件比對(duì)(圖2),mtr-miR156家族成員中莖環(huán)序列高度保守區(qū)域與成熟序列完全重合。而其余序列保守性差可能是因?yàn)閙iR156家族成員合成過程在苜蓿的不同組織和不同發(fā)育階段造成。

表2 mtr-miR156家族莖環(huán)序列

圖2 mtr-miR156家族莖環(huán)序列的保守性分析

圖3 mtr-miR156莖環(huán)序列同源樹

2.3 mtr-miR156家族莖環(huán)序列的同源樹分析

利用DNAMAN軟件對(duì)mtr-miR156家族的莖環(huán)序列進(jìn)行比對(duì)分析并繪制同源樹(圖3)。結(jié)果顯示,mtr-miR156家族10個(gè)成員除miR156g外,共分為3個(gè)分支:mtr-miR156a、mtr-miR156b、mtr-miR156c、mtr-miR156e(分支Ⅰ);mtr-miR156d、mtr-miR156f、mtr-miR156j(分支Ⅱ);mtr-miR156h、mtr-miR156i(分支Ⅲ)。從進(jìn)化樹上看,mtr-miR156a和mtr-miR156b、mtr-miR156c和mtr-miR156e、mtr-miR156d和mtr-miR156f、mtr-miR156h和mtr-miR156i親緣關(guān)系分別都達(dá)到100%,成員彼此之間親緣關(guān)系最近,而mtr-miR156g與其他序列差異較大,與其他成員親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。進(jìn)一步分析PmiREN數(shù)據(jù)庫中成熟序列表達(dá)位置和RPM信息,發(fā)現(xiàn)mtr-miR156其他成員主要在植物的幼苗、嫩芽、葉中高表達(dá)。而mtr-miR156g在苜蓿的嫩芽和葉中極少表達(dá),只有在苜蓿的幼苗中高表達(dá),在苜蓿的種子中少量表達(dá)。結(jié)合同源樹,分析mtr-miR156g在苜蓿不同組織中高表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致與其他成員成熟序列有所差異,親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。有研究表明,miRNA在同一物種的不同細(xì)胞或組織中表達(dá)量顯著差異,比如miR171在擬南芥的花序和花組織中表達(dá)量高,而在莖和葉組織中不表達(dá)[14]。這也表明miRNA的表達(dá)模式具有分化的組織特異性和時(shí)序性,即miRNA水平在不同組織、不同發(fā)育階段中有顯著差異。

2.4 mtr-miR156a靶基因GO功能富集分析

miRNA與mRNA作用是通過miRNA成熟序列的種子區(qū)與mRNA的3’UTR結(jié)合,而mtr-miR156家族中種子區(qū)高度保守,因此使用mtr-miR156a在TargetScan、RNAhybrid和聯(lián)川生物云平臺(tái)進(jìn)行牛體內(nèi)靶基因預(yù)測。Gene Ontology(GO)功能富集分析(圖4)發(fā)現(xiàn),注釋到生物學(xué)過程層面顯著富集的功能為RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控-DNA-模板化、正調(diào)控GTRase活性,分別有44、36和34條靶基因富集。注釋到細(xì)胞組成層面顯著富集的功能為膜的組成部分、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核,分別有204、194和177條靶基因富集。注釋到分子功能層面顯著富集的功能為ATP合成、鋅離子結(jié)合、金屬離子結(jié)合、分別有80、73和72條靶基因富集。

2.5 mtr-miR156a靶基因功能KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)(圖5),在靶基因注釋的全部KEGG通路中,最顯著富集的通路是脂肪酸降解(P<0.001),其次是Ras信號(hào)通路的調(diào)節(jié)(P<0.001),其中靶基因數(shù)量最多的是Ras信號(hào)通路,其次是MAPK信號(hào)通路,分別是有35和30個(gè)。表明mtr-miR156a可能對(duì)牛體內(nèi)脂肪酸降解、細(xì)胞生長、分化、蛋白質(zhì)運(yùn)輸和分泌等都具有調(diào)控作用。

2.6 mtr-miR156a調(diào)控乳品質(zhì)中蛋白質(zhì)合成和脂類代謝相關(guān)靶基因預(yù)測

乳蛋白是人類營養(yǎng)優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的重要來源,乳蛋白合成和分泌是由奶牛乳腺上皮細(xì)胞完成,主要由高豐度蛋白和低豐度蛋白構(gòu)成,其中高豐度蛋白以酪蛋白為主,低豐度蛋白主要包括乳清蛋白、乳脂肪球膜蛋白及乳鐵蛋白等[15]。乳蛋白作為牛乳中主要的營養(yǎng)成分之一,其中高豐度的酪蛋白由α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白共同完成,是決定牛乳品質(zhì)的重要因素[16]。乳脂也是牛奶的重要成分,是一種高質(zhì)量的天然脂肪,消化率高達(dá)98%[17]。乳脂乳蛋白率作為評(píng)判牛乳品質(zhì)的重要指標(biāo)之一,成為關(guān)注奶牛營養(yǎng)調(diào)控及分子調(diào)控的熱點(diǎn)。為此,在預(yù)測到的所有靶基因中篩選出mtr-miR156a調(diào)控蛋白質(zhì)合成和脂類代謝相關(guān)的靶基因,并在RNAhybrid在線網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì),最終篩選出符合自由能閾值的靶基因(表3),預(yù)測其靶基因在奶牛體內(nèi)參與乳脂乳蛋白合成代謝,為后續(xù)研究mtr-miR156a調(diào)控奶牛乳脂乳蛋白合成代謝奠定基礎(chǔ)。

圖5 mtr-miR156a在牛體內(nèi)靶基因KEGG通路富集分析

表3 mtr-miR156a調(diào)控蛋白質(zhì)合成和脂類代謝相關(guān)靶基因預(yù)測

3 討 論

在植物miRNA研究中,miR156是一種進(jìn)化非常保守的miRNA[18],在擬南芥、苜蓿、大豆、水稻等多種植物中,均能檢測到iR156,發(fā)現(xiàn)其對(duì)植物開花過程、生長發(fā)育、響應(yīng)生物和非生物脅迫等都具有調(diào)控作用。miR156最早發(fā)現(xiàn)于擬南芥植物中,靶向squamosa啟動(dòng)子結(jié)合蛋白(Squamosapromoterbindingprotein-like,SPL)基因家族參與植物表型改變和調(diào)控開花過程[19-21],可以調(diào)節(jié)植物嫩芽從幼年期到成年期的過渡,伴隨著植物營養(yǎng)形態(tài)的改變和生殖潛力的增加。植物開花易受外界因素的影響,溫度、濕度等環(huán)境因素都會(huì)影響植物開花過程,延期開花會(huì)影響果實(shí)成熟和農(nóng)作物產(chǎn)量,miRNA在植物開花過程中起重要調(diào)節(jié)作用。SPL家族是植物中特有的一類具有多功能的轉(zhuǎn)錄因子家族,具有高度保守的DNA結(jié)合區(qū)域SBP結(jié)構(gòu)域[22]。在擬南芥中,SPL基因家族成員有17個(gè),其中有11個(gè)基因受到miR156調(diào)控,參與調(diào)節(jié)開花過程、代謝調(diào)節(jié)以及非生物脅迫等多種調(diào)節(jié)功能[23]。研究發(fā)現(xiàn),miR156可以靶向SPL3基因控制葉片中的開花基因(FloweringlocusT,FT)表達(dá)以調(diào)節(jié)環(huán)境溫度響應(yīng)性開花,在低溫(16 ℃)條件下,過表達(dá)miR156會(huì)抑制擬南芥開花,而過表達(dá)SPL3基因則會(huì)促進(jìn)擬南芥開花[24]。在大豆(Glycinemax)中,Gm-miR156b靶向SPL直系同源物,并負(fù)調(diào)控GmSPLs,從而上調(diào)大豆開花相關(guān)基因的啟動(dòng)子,延遲大豆開花時(shí)間[25]。在對(duì)SPL家族基因的研究中,發(fā)現(xiàn)其多個(gè)基因可以參與植物生長發(fā)育的調(diào)控。miR156通過靶向SBP/SPL基因參與調(diào)控植物的生長發(fā)育過程[26-27]。多年生低溫短日照植物草莓(Fragaria×ananassa)中miR156通過靶基因FaSPL9對(duì)草莓的生長發(fā)育呈負(fù)調(diào)控作用,抑制草莓的開花及生長發(fā)育[28]。葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的主要色素,在高等植物中葉綠素主要有葉綠素a和葉綠素b,葉綠素含量越多,植物光合作用能力越強(qiáng)。在水稻中SPL14能夠直接結(jié)合葉綠素b還原酶(Non-yellowcoloring1,NYC1)基因的啟動(dòng)子來抑制NYC1的表達(dá),而miR156可以抑制SPL14的表達(dá),即miR156-SPL14-NYC1基因作用在同一信號(hào)通路上,從而對(duì)葉綠素含量起到負(fù)調(diào)控作用,進(jìn)而影響水稻的生長發(fā)育[29]。此外,miR156在轉(zhuǎn)錄水平還可以抑制SPL13,從而增加WD40-1基因表達(dá)來增強(qiáng)紫花苜蓿的抗旱能力[30]。

植物miR156除了可對(duì)植物的種子成熟過程、開花、抗旱能力進(jìn)行調(diào)控外,還可以進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi),被動(dòng)物機(jī)體吸收,跨界調(diào)控動(dòng)物細(xì)胞的生理功能。2012年首次研究發(fā)現(xiàn),植物源外源性miRNA存在人體血清中,檢測到miR168a和miR156a有較高的表達(dá)水平,其中大米來源的miR168a能夠被消化道吸收進(jìn)入肝臟靶向低密度脂蛋白受體銜接蛋白1(Low-densitylipoproteinreceptoradapterprotein1,LDLRAP1),導(dǎo)致小鼠血漿中LDL含量升高[31]。這一現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn),使研究人員對(duì)植物miRNA跨界調(diào)控的研究產(chǎn)生了興趣,因此有更多的人開始對(duì)植物miRNA跨界調(diào)控動(dòng)物基因表達(dá)機(jī)制進(jìn)行深入研究。在之后幾年的研究中,miR156a-5p在小麥[32]和玉米[33]等經(jīng)濟(jì)作物中高表達(dá),小麥和玉米作為人類食品和動(dòng)物飼料的重要來源,被人和動(dòng)物大量攝食,其所含的miR156a-5p也可能隨著飲食進(jìn)入人和動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮跨界調(diào)控作用。在最近的研究報(bào)道中,植物miR156a-5p可以靶向通路上游基因Wnt家族成員10b(Wntfamilymember10b,Wnt10b)在細(xì)胞水平抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性,抑制腸道上皮細(xì)胞增殖,影響小鼠腸道發(fā)育[34]。在成年母豬體內(nèi)也檢測到了玉米來源的miR156a-5p,并發(fā)現(xiàn)玉米衍生的miR156a-5p可以穿過胃腸道并留存在母豬體內(nèi),表明外源性miRNA具有調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物基因表達(dá)的潛力[35]。此外,在甘草水煎劑中發(fā)現(xiàn)的miR156,通過靶向Toll樣受體(Toll-likereceptor,TLR)家族基因從而在小鼠和人體內(nèi)抑制炎癥、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)腸道菌群的組成以及腸道免疫系統(tǒng)的作用[36-38]。研究還發(fā)現(xiàn),miR156可以靶向鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii,AB),調(diào)節(jié)AB菌的生長,通過調(diào)節(jié)腸道菌群來調(diào)節(jié)腸道免疫;與對(duì)照組相比,miR156灌胃組能顯著提高小鼠腸道內(nèi)優(yōu)勢菌群的存活,不僅可以影響自身的腸道菌群和腸道免疫,還會(huì)影響同籠飼養(yǎng)互食糞便共培養(yǎng)未灌胃小鼠的腸道菌群和腸道免疫。miR156可以靶向Cd28和Cd79a基因并使之上調(diào),激活脾臟T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞信號(hào)通路,促進(jìn)小鼠脾臟免疫[39]。Cd28分子是一種廣泛存在于T細(xì)胞表面的Ⅰ型跨膜蛋白受體,屬于免疫球蛋白家族,參與共刺激信號(hào)通路[40],促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖,在免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[41]。Cd79a是B細(xì)胞標(biāo)志物,與B細(xì)胞受體結(jié)合后產(chǎn)生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。研究表明,植物miR156a對(duì)人結(jié)腸腺癌細(xì)胞(Humancolorectaladenocarcinomacells,Caco-2)中JAM-A(Junctionadhesionmolecule-A,JAM-A)基因有直接靶向作用,miR156a可以抑制人Caco-2細(xì)胞中JAM-A的表達(dá)。而對(duì)小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中JAM-A基因的mRNA水平?jīng)]有明顯變化[42]。推測植物miR156在哺乳動(dòng)物中與JAM-A潛在靶點(diǎn)不完全保守,說明植物miR156與JAM-A結(jié)合跨界調(diào)控可能具有種屬性。連接粘附分子A(Junctionadhesionmolecule-A,JAM-A)是免疫球蛋白超家族跨膜粘附分子成員,主要存在于內(nèi)皮和上皮緊密連接處,也存在于循環(huán)白細(xì)胞和血小板上[43]。它發(fā)揮著廣泛的功能,包括調(diào)節(jié)細(xì)胞極性、細(xì)胞遷移、血管完整性和細(xì)胞旁通透性[44-48]。因此,植物miR156a抑制人體內(nèi)JAM-A的表達(dá),可能會(huì)增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移,從而減少人體內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成[49]。

本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)mtr-miR156基因家族的成熟序列和莖環(huán)序列進(jìn)行保守性分析、同源樹分析、成熟序列染色體定位、靶基因預(yù)測。發(fā)現(xiàn)mtr-miR156基因家族共有10個(gè)家族成員,其中8個(gè)成員成熟序列完全一致,其余2個(gè)成員成熟序列保守性較高。在莖環(huán)序列中,10個(gè)成員中位于成熟序列位置的堿基與成熟序列一致。通過對(duì)mtr-miR156基因家族莖環(huán)序列進(jìn)行同源樹分析發(fā)現(xiàn),在進(jìn)化過程中莖環(huán)序列堿基發(fā)生了突變和缺失,產(chǎn)生了莖環(huán)序列只有成熟序列區(qū)高度保守,而其他區(qū)域不保守。

4 結(jié) 論

到目前為止,PmiREN數(shù)據(jù)庫收錄共100多個(gè)物種1807個(gè)miR156家族成員。本研究通過對(duì)mtr-miR156基因家族預(yù)測到的靶基因進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,發(fā)現(xiàn)mtr-miR156家族成員可能會(huì)通過靶向靶基因跨界調(diào)控奶牛體內(nèi)脂肪酸、乳脂乳蛋白合成代謝及其他調(diào)控作用。該結(jié)果為mtr-miR156跨界調(diào)控研究提供理論基礎(chǔ),也對(duì)其他miRNA跨界調(diào)控的研究具有參考意義。