陽 妮,瑪依拉·玉素音,楊延龍,李春平,張大偉,徐海江,賴成霞

(新疆農業(yè)科學院經濟作物研究所,烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】棉花在種植過程中易遭受黃萎病的侵害,隨著大面積種植、連作年限的延長等原因,導致棉花黃萎病病害愈加嚴重,給棉花生產造成損失[1]。棉花黃萎病(CottonVerticilliumWilt,CVW)主要是由大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)引起的1種嚴重的土傳真菌病害,侵染棉花主要表現(xiàn)為黃化狀和枯斑狀[2]。該病原菌的遺傳穩(wěn)定,潛伏期長,普通化學防治很難根除,在加上其具有豐富的變異性,同一病菌可能造成植株呈現(xiàn)相同、相似、或不同的表征,給黃萎病診斷和防治帶來難度[3]。植物在面對病原菌侵染時,會產生某些與防御相關的代謝物質來抵御病原菌侵入,植物病癥的形成與植物體內代謝物的變化有關,這些代謝物質不僅是植物基因復制、轉錄以及蛋白質表達的最終的產物,也是植物病癥形成的物質基礎[4-5]。因此,研究棉花黃萎病病癥中的相關代謝物質變化,對于防治棉花黃萎病具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】植物揮發(fā)物物質(volatile organic compounds,VOCs)是植物與病原菌互作過程中的重要代謝物,大致分為脂肪酸衍生物、芳香族化合物、單萜和倍半萜類物質[6]。當植物受到病原菌侵害時,植物能通過改變揮發(fā)物的種類和數(shù)量上來抵御病原菌入侵,如油菜揮發(fā)物中的二甲基二硫醚(DMDS)、二甲基三硫醚(DMTS)和異硫氰酸烯丙酯(AITC)對三七根腐病菌均有抑菌活性,且濃度不同抑菌率也不同[7];在柑橘中揮發(fā)性的檸檬烯能抵御指狀青霉菌、單胞桿菌等病原菌的入侵[8];綠葉揮發(fā)物中的(E)-2-己烯醛、(Z)-3-己烯醛等物質能誘導植物產生抗真菌蛋白、植物抗毒素來抵御病原菌的侵染[9]。氣相色譜與質譜聯(lián)用(Gas Chromatography-Mass Spectrometry,GC-MS)技術因具有較高的分辨率和較高的靈敏度,已成為研究揮發(fā)性代謝物的主要技術[10]。例如Batovska等[11]采用GC-MS技術比較了不同抗性葡萄葉片的代謝組分差異,獲得了抑制白粉病菌、霜霉病菌及灰霉病菌的16種抗性代謝物。McCartney等[12]利用GC-MS技術對杜鵑花與雷公藤疫霉(Phytophthoraramorum)病原菌互作進行研究,檢測出78種揮發(fā)性化合物?！颈狙芯壳腥朦c】在棉花與黃萎病互作的研究中,僅有李社增等[13]通過液相色譜與質譜聯(lián)用(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry,LC-MS)技術獲得了一些與棉花黃萎病病程相關的代謝產物,如咖啡酸、紫云英苷、異紫云英苷、五椏果素等,而目前基于GC-MS技術上研究棉花中黃萎病不同病癥的揮發(fā)性成分差異還未見報道。棉花在抵御病原菌入侵過程中,會發(fā)生大幅度的生理生化代謝及表型變化,而目前棉花對黃萎病的防御相關物質研究成果仍然不足以解析病癥變化的機制。需研究黃萎病病原菌與棉花互作過程中的揮發(fā)性物質的變化?！緮M解決的關鍵問題】采用固相微萃取(solid phase microextraction,SPME),結合GC-MS技術,檢測分析棉花植株健康葉片、黃化狀和枯斑狀病葉中的揮發(fā)性物質變化,研究與病癥差異相關的主要揮發(fā)性物質,為棉花抗黃萎病機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 棉花品種

供試棉花品種新陸早75號,健康葉片、枯斑狀病片和黃化狀病葉采自新疆沙灣市不同試驗棉田的不同棉花植株,每個樣本采集3個生物學重復用于代謝組學分析。取樣后葉片樣品用含水脫脂棉包裹葉柄并放入10℃的保鮮盒內,迅速帶回實驗室。

1.1.2 儀器與設備

SPME支架和65 μm二乙烯基苯/羧基/聚二甲基硅氧烷纖維(DVB/CAR/PDMS)萃取頭購自Supelco(美國Supelco公司); GC/MS-2020NX氣質聯(lián)用儀(日本島津公司)。

1.2 方 法

1.2.1 樣品制備

準確稱取0.4 g棉花葉片,并分割成0.5 cm的小塊狀迅速放入 30 mL萃取瓶中,瓶蓋用鋁蓋和封口膜進行密封。萃取頭250℃老化30 min后,將萃取頭插入萃取瓶的2/3處,31℃條件下萃取30 min,之后將萃取頭插入GC-MS進樣口內,進行GC-MS分析,每份樣品重復3次。

1.2.2 揮發(fā)性成分

參照Qiu等[14]的方法進行揮發(fā)性成分的提取和分析,并做適當改動。具體條件如下,色譜柱:SH-Rtx-Wax(30 m×0.25 mm,0.25 μm)石英毛細管色譜柱;色譜柱初始溫度35℃,保留5 min,按照4℃/min升溫至60℃,再以3℃/min升溫至180℃,然后以4℃/min升溫至240℃,保留5 min;載氣:高純氦氣;色譜柱流量:1 mL/min;分流,分流比6∶1,溶劑延遲0.5 min;接口溫度:240℃。質譜條件:離子源為EI源,溫度200℃,電子能量70 eV,采集方式為scan,質譜掃描范圍:35～350 m/z。

1.3 數(shù)據處理

將樣品總離子流色譜圖中色譜峰的質譜圖逐一與NIST 17譜庫進行檢索匹配,并對代謝物進行定性分析。采用MetaboAnalyst(https://www.metaboanalyst.ca)對數(shù)據進行歸一化處理,主成分分析(principal component analysis,PCA)及偏最小二乘法判別(Partial least squares discrimination analysis,PLS-DA);通過SPSS 22進行t檢驗(Student’st-test);根據PLS-DA模型獲得的變量重要性投影(variable importance in project,VIP)值(闕值﹥1)和t檢驗的P值(闕值﹤0.05)來篩選差異化合物,并采用Excel 2010和GraphPad Prism 9制作差異化合物的柱狀圖;韋恩圖和條形圖通過在線數(shù)據分析https://www.omicshare.com完成。

2 結果與分析

2.1 不同病癥葉片的揮發(fā)性成分及含量變化

研究表明,與健康葉片相比,黃化狀病葉葉色失綠變淺呈黃色,病葉邊緣和主脈間出現(xiàn)黃色斑塊,枯斑狀病葉病斑色澤加深,變黃褐色,病葉邊緣上卷,但主脈及其附近的葉肉仍保持綠色。各類葉片的質譜譜圖,與NIST17質譜庫檢索,結合相關文獻搜索查詢,共鑒定出158種揮發(fā)性化合物,其中醇21種、綠葉揮發(fā)物9種、萜烯類49種、烷烴類16種、酯類38種、芳香烴類5種、醛類13種、其他類8種。不同病癥葉片中的化合物數(shù)量差異較大,其中健康葉片檢測到的化合物總數(shù)為104種、枯斑狀病葉為112種、黃化狀病葉為54種,且黃化狀病葉中未檢測到芳香烴類物質?？莅郀畈∪~中的醇類、綠葉揮發(fā)物、酯類、烷烴類、芳香烴類、醛類和其他類的相對含量均大于黃化狀病葉、萜烯類小于黃化狀病葉。在所有化合物類別中,萜烯類和綠葉揮發(fā)物的比例最大,健康葉片、黃化狀病葉和枯斑狀病葉的萜烯類物質占比分別為35.04%,62.61%和42.31%,其中香柑油烯、(E)-β-金合歡烯、(+)-苜蓿烯、別香橙烯、欖香烯、萜品油烯、E-11,13-十四二烯和長葉烯-(V4)只存在于枯斑病葉中;綠葉揮發(fā)物在健康葉片、黃化狀病葉和枯斑狀病葉中的占比為54.58%、29.73%和46.78%,其中3-己烯醛是枯斑病葉中的特有成分;醇類化合物在健康葉片、黃化狀和枯斑狀病葉占比分別為5.27%、3.64%、4.40%,十氫化萘-2-醇只存在于黃化狀病葉中,枯斑病葉中包含了5種特有成分,以松香芹醇含量最高;而烷烴類、醛類、酯類、芳香烴類、其他類的含量較低,均在4%以下,健康葉片含量最高的化合物是水楊酸甲酯,且此物質未在病葉中未檢出,黃化狀病葉和枯斑病葉含量較高的是β-苯丙氨酸。圖1,表1

表1 不同病癥葉片的揮發(fā)性成分及含量變化

注:CK:健康葉片,Y:黃化狀病葉,K:枯斑狀病葉。下同

2.2 主成分分析與偏最小二乘法判別

研究表明,3組樣本中PC1和PC2的貢獻率分別為50.3%、24.9%,其中CK組、K組、Y組分別位于第一、二、四象限上,組間化合物分離趨勢明顯且組內生物重復性好,3組間化合物有較大差異。使用偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)表明,組內數(shù)據重復性好,3組樣品的區(qū)分效果非常明顯,具有明顯不同的代謝特征。圖2

注:A:PCA分析圖;B:PLS-DA分析圖。

2.3 差異化合物篩選

研究表明,設定條件為VIP >1.0,且P<0.05。K和CK間存在61種差異化合物(23種上調/39種下調),主要包括12種醇類、20種萜烯類、13種酯類、6種烷烴類、3種醛類、1種綠葉揮發(fā)物,2種芳香烴類和4種其他類物質。Y和CK間存在24種差異化合物(14種上調/10種下調),包含醇類2種、萜烯類14種、酯類5種和烷烴類3種;K和Y共有差異化合物26種(19種上調/7種下調),包含3種醇類、10種萜烯類、6種酯類、3種烷烴類、2種醛類、1種綠葉揮發(fā)物和1種其他類物質。圖3

圖3 不同病癥葉片的差異化合物篩選

2.4 不同病癥葉片的差異化合物變化

研究表明,化合物β-蒎烯在3個比較組間均發(fā)生了差異變化,其中K組、Y組與CK組相比分別上調了2.33、3.97,而K組與Y組相比下調了1.65。與CK相比,K組和Y組中有5個共有化合物發(fā)生差異變化,其中角鯊烯、坎烯、(E)-2-丁酸己烯酯在病癥葉片中顯著下調,香橙烯、2,6-二甲基-3,7-辛二烯-2,6-二醇顯著上調,且這些化合物在Y組中的變化更大。K組與Y組的相比,有13個差異化合物與K組相連,其中以(Z)-2-丁酸己烯酯倍數(shù)變化最大,上調3.76,5個差異化合物與Y組相連,倍數(shù)變化最大化合物是(Z)-3-己烯基2甲基丁酸酯,下調3.03,7個化合物發(fā)生特有表達,其中(Z)-3-己烯基乙酸酯,(Z)-3-己酸己烯酯,γ-依蘭油烯和正十六烷均顯著上調,且變化倍數(shù)均大于2。圖4

注:A: 差異化合物韋恩圖;B-D: 差異化合物條形圖,紅色代表上調,藍色代表下調

3 討 論

SPME是一種集萃取、濃縮、進樣等功能為一體的檢測方法,靈敏性高且操作簡單,被應用于提取各類樣品,如甘薯[15]、西洋參[16],同樣也被用于植物-病原菌互作中揮發(fā)性物質的提取,如Chen等[17]采用頂空固相微萃取與氣相色譜-質譜聯(lián)用法,從豆根內生真菌ETR-B22中共鑒定出了32種揮發(fā)性有機化合物,其中鄰氨基甲酸甲酯、水楊酸甲酯、苯甲酸甲酯等表現(xiàn)出廣譜抗真菌活性。研究利用SPME-GC-MS技術,從3組樣品中獲得了包括醇類,綠葉揮發(fā)物、萜烯類、烷烴類、酯類,芳香烴類和醛類在內的158種揮發(fā)性化合物,SPME應用于揮發(fā)性物質提取是可行的。鄭雪芳等[18]采用GC-MS法對青枯菌菌株侵染后的番茄進行了化合物分析,檢測到的化合物種類主要有萜烯類、醇類、酯類和烷烴類,且致病性不同的菌株化合物數(shù)量也不同。研究在不同病癥葉片中也檢測出不同數(shù)量的化合物,其中健康葉片的化合物總數(shù)為104種、枯斑狀病葉為112種、黃化狀病葉為54種,病癥葉片中的化合物數(shù)量差異較大,其差異主要集中于萜烯類、酯類化合物上。各類別物質的相對含量變化反映了寄主植物對病原菌的響應,ROBISON等[19]利用UPLC-MS和GC-MS研究發(fā)現(xiàn)感染核盤菌后,抗性大豆品種中的萜烯類含量增加,而酯類、氨基酸及糖類減少。在研究中,健康葉片和病癥葉片中各類別物質含量差別明顯,可能是導致了病葉呈枯斑和黃化狀的重要原因。其中枯斑狀病葉中的醇類、綠葉揮發(fā)物、酯類、烷烴類、芳香烴類、醛類和其他類的相對含量均大于黃化狀病葉、萜烯類小于黃化狀病葉。

在大麗輪枝菌與棉花互作中,包括半棉酚、棉酚、半棉酚酮在內的萜類物質和酚類物質是棉花抗病工作過程中的重點之[20]。研究從枯斑狀病葉、黃斑狀病葉分別篩選到了61、24個差異化合物,通過對比比較,從兩個病癥葉片中篩選到了6種共有差異化合物,主要為萜烯類、酯類等物質,這些類別物質可能是棉花抗黃萎病過程中的重要代謝組分。其中β-蒎烯更是在病癥葉片中顯著上調,且在黃化狀病葉中的表達倍數(shù)大于枯癍病葉,其作為萜烯類中的重要物質,在植物抗逆過程中起重要作用[21]。高全等[22]研究顯示草果揮發(fā)油中發(fā)揮抑菌作用的主要活性成分為β-蒎烯;張美紅等[23]在研究葉同樣證實了β-蒎烯可顯著抑制柑橘青霉菌生長繁殖,抑菌作用的大小與其濃度正相關。在枯斑狀病葉與黃化狀病片比較中發(fā)現(xiàn)了(Z)-3-己烯基2甲基丁酸酯,(Z)-3-己烯基乙酸酯,(Z)-3-己酸己烯酯,γ-依蘭油烯和十六烷等差異化合物均發(fā)生顯著的倍數(shù)變化。(Z)-3-己烯基2甲基丁酸酯已被證實是棉花抗逆過程中具有揮發(fā)性質的間接防御物質[24]。智亞楠等[25]曾在研究中證實了(Z)-3-己酸己烯酯對茶樹輪斑病菌具有抑制能力,其熏蒸抑制率可達到27%。(Z)-3-己烯基乙酸酯是綠葉揮發(fā)物重要成分,在增強小麥對禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)的防御能力、提高馬鈴薯對晚疫病的抗病能力等生物脅迫方面發(fā)揮作用[26-27]。γ-依蘭油烯已被鑒定是果實精油中的主要成分,具有良好的抗生物膜活性和抑制病原菌粘附的性質[28]。以上鑒定出的揮發(fā)性化合物在大麗輪枝菌與棉花互作相關文獻中未見報道,可能為新發(fā)現(xiàn)的棉花與病原菌互作過程中相關化合物,這些化合物的含量差異是病癥葉片呈現(xiàn)不同表型的關鍵。

4 結 論

4.1枯斑型葉片與黃化型葉片中的化合物數(shù)量差異較大,其差異主要集中于萜烯類、酯類化合物上,其中枯斑病葉的萜烯類、酯類化合物分別有37種、26種,而黃化狀病葉為24種、8種?？莅郀畈∪~中的醇類、綠葉揮發(fā)物、酯類、烷烴類、芳香烴類、醛類和其他類的相對含量均大于黃化狀病葉、萜烯類小于黃化狀病葉?？莅卟∪~以綠葉揮發(fā)物(46.78%)的相對含量最高,黃化狀病葉以萜烯類(62.61%)最高,且黃化狀病葉無芳香烴類物質。

4.2與健康葉片相比,β-蒎烯、(E)-2-丁酸己烯酯、坎烯、角鯊烯、香橙烯、2,6-二甲基-3,7-辛二烯-2,6-二醇均在病癥葉片顯著富集,且在黃化狀病葉的變化倍數(shù)大于枯斑病葉?？莅卟∪~與黃化狀病葉相比,(Z)-2-丁酸己烯酯,(Z)-3-己烯基2甲基丁酸酯,(Z)-3-己烯基乙酸酯,(Z)-3-己酸己烯酯,γ-依蘭油烯和正十六烷均發(fā)生了顯著性倍數(shù)變化,差異化合物是黃萎病菌與棉花互作的結果,是病癥葉片呈現(xiàn)不同表型的關鍵。