饒艷玲 黃威

1.武漢市第五醫(yī)院,湖北 武漢 430050

2.武漢市第三醫(yī)院,湖北 武漢 430074

糖尿病性骨質(zhì)疏松癥(diabetic osteoporosis,DOP)是糖尿病造成的與骨骼和關(guān)節(jié)相關(guān)的嚴(yán)重代謝并發(fā)癥,以高血糖微環(huán)境和全身性骨微結(jié)構(gòu)、強度、質(zhì)量損傷為特征,易發(fā)生骨折,治療和康復(fù)困難[1-2]。臨床數(shù)據(jù)顯示,糖尿病患者出現(xiàn)骨質(zhì)疏松的比例高達(dá)60.0%[3]。其最佳防治療法為激素代替療法,但其不良反應(yīng)和副作用使患者的依從性差。研究表明,青娥丸是治療腎虛血瘀型絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的代表性方劑,能抑制破骨細(xì)胞活性,維持骨代謝平衡和骨鈣吸收,藥理療效明顯[4]。同時,加減后的青娥丸還能調(diào)節(jié)大鼠精神狀態(tài)、體質(zhì)量、血糖及脂質(zhì)水平,發(fā)揮對2型糖尿病大鼠的治療作用[5]。馬陳等[6]認(rèn)為青娥丸通過調(diào)控Wnt/β-catenin通路改善骨質(zhì)疏松患者的骨密度,治療絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松,但青娥丸對DOP的治療效果及作用機制還不清楚。因此,本研究用青娥丸干預(yù)DOP小鼠模型,通過對其骨組織的修復(fù)情況,探究青娥丸對Wnt/β-catenin通路的影響,以期為尋找防治DOP的藥物提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物和藥材:SPF級41只8周齡雄性C57小鼠來源于湖南斯萊克景達(dá),于無特定病原體,22 ℃～26 ℃,相對濕度為50%～60%,人工光照明暗各12 h條件下飼養(yǎng)。實驗動物使用許可證號:SYXK(鄂)2018-0104。杜仲、補骨脂、核桃仁、大蒜為主要藥材,按2020版《中華人民共和國藥典》中藥物比例(16∶8∶5∶4)加水煎制,濃縮稀釋至1 mL藥液含生藥5.4 g。

1.1.2試劑:戊巴比妥鈉、STZ購于Sigma公司,高糖高脂糖尿病定制飼料購于江蘇協(xié)同生物公司,DAB濃縮型試劑盒、EDTA·2Na購于北京索萊寶科技公司,蘇木素購于北京雷根生物技術(shù)公司,Tris-EDTA修復(fù)液購于武漢賽維爾生物科技公司,小鼠ALP酶聯(lián)免疫分析試劑盒、兔抗Wnt1、β-catenin、Runx2購于Bioswamp生物有限公司,Max VisionTMHRP-Polymer anti-Mouse/Rabbit IHC試劑盒購于邁新生物技術(shù)公司,Trizol購于美國ambion公司。

1.2 實驗方法

1.2.1DOP小鼠模型構(gòu)建及驗證:空白組小鼠和模型組小鼠分別喂食標(biāo)準(zhǔn)飼料和高脂高糖飼料,模型組每日按照70 mg/kg腹腔注射1% STZ溶液,連續(xù)注射2 d,高脂高糖飼料繼續(xù)飼養(yǎng)4周后尾靜脈采血,隨機血糖≥11.1 mmol/L者為糖尿病造模成功[7]。高脂高糖飼料繼續(xù)飼養(yǎng)8周,從小鼠體重、尾靜脈血糖含量,micro-CT掃描定量和股骨組織形態(tài)學(xué)變化來驗證模型構(gòu)建是否成功。

1.2.2實驗分組及取材:模型構(gòu)建成功后進行藥物干預(yù),對照組6只,其余各組7只。正常飼料喂養(yǎng)的小鼠為對照組,模型組用等體積的飲用水灌胃,青娥丸低、中、高劑量組按成人劑量的5、10、20倍(2.7、5.4、10.8 g/kg)灌胃[5],阿侖膦酸鈉組用阿侖膦酸鈉70 μg/kg灌胃,均為每天1次,連續(xù)給藥12周,藥物干預(yù)期間繼續(xù)使用高脂高糖飼料。藥物干預(yù)完成后處死小鼠,取小鼠血清、股骨,保存待測。

1.2.3HE染色觀察各組股骨組織細(xì)胞形態(tài):小鼠股骨組織置于慢速脫鈣液進行脫鈣處理,脫鈣完成后將小鼠股骨縱切、脫水、浸蠟包埋。將組織切片脫蠟,蘇木精液和伊紅液染色,脫水,透明后封片,顯微鏡拍照。

1.2.4生化檢測各組小鼠堿性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)的水平:按照深圳邁瑞生化試劑盒說明書檢測血清樣本中ALP、BUN及AST含量。以標(biāo)準(zhǔn)物的OD值為橫坐標(biāo),濃度為縱坐標(biāo),獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,將樣品的OD值代入方程式,計算出待測指標(biāo)實際濃度。

1.2.5qPCR檢測GSK-3β、LRP5、COL1A1 mRNA水平:總RNA用Trizol提取,純化后利用PrimeScript Ⅱ RTase試劑盒將RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA,目標(biāo)基因引物見表1。PCR反應(yīng)條件為:95 ℃保溫3 min,95 ℃保溫5 s,56 ℃保溫10 s,40個循環(huán)。根據(jù)GAPDH的Ct值,用公式2-ΔΔCt計算靶基因cDNA相對表達(dá)。

表1 引物序列

1.2.6免疫組化檢測蛋白Wnt1、β-catenin、Runx2表達(dá)水平:取小鼠股骨組織,脫水、浸蠟包埋、脫蠟水化。將水化后的玻片在Tris-EDTA緩沖液中高壓修復(fù)18 min,置于3% H2O2中孵育10 min,10%山羊血清封閉30 min,滴加Wnt1抗體(1∶200)4 ℃孵育過夜,滴加二抗,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,脫水,顯微鏡拍照分析。β-catenin、Runx2檢測過程中,將水化后的玻片在檸檬酸鈉緩沖溶液中高壓修復(fù)23 min,其余步驟同上。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠Micro-CT股骨組織檢測

與對照組相比,模型組小鼠的骨小梁體積數(shù)、厚度和數(shù)量、骨密度顯著降低(P<0.05),而骨小梁間隔顯著增加(P<0.05)。提示小鼠DOP模型構(gòu)建成功。與模型組相比,青娥丸低、中、高劑量組及阿侖膦酸鈉組小鼠骨小梁體積數(shù)、厚度和數(shù)量、骨密度顯著升高(P<0.05),而骨小梁間隔顯著減小(P<0.05),見圖1、表2。

圖1 各組小鼠micro-CT檢測結(jié)果

表2 各組小鼠micro-CT檢測數(shù)據(jù)

2.2 青娥丸對小鼠一般行為的影響

對照組小鼠毛發(fā)光滑,多動,食欲正常。模型組小鼠毛發(fā)粗糙,食欲旺盛,多飲多尿,墊料潮濕,精神萎靡,少動。青娥丸低、中劑量干預(yù)后小鼠一般行為類似模型組,青娥丸高劑量和阿侖膦酸鈉干預(yù)后,小鼠毛發(fā)粗糙,食欲正常,墊料無異常,多動,與模型組相比有明顯改善。

2.3 青娥丸對DOP小鼠體重和血糖的影響

與對照組相比,模型組小鼠的尾靜脈血糖值顯著增加(P<0.01),體重明顯下降(P<0.01)。與模型組相比,青娥丸中、高劑量組及阿侖膦酸鈉組小鼠尾靜脈血糖值顯著下降(P<0.05),體重顯著增加(P<0.05),見表3。

表3 青娥丸對DOP小鼠體重和血糖的影響

2.4 HE染色觀察各組股骨組織細(xì)胞形態(tài)

與對照組相比,模型組小鼠骨細(xì)胞分布松散,胞質(zhì)稀疏;細(xì)胞扁平,空骨陷窩明顯增多;骨小梁寬度變窄,排列疏松。與模型組相比,青娥丸低、中、高劑量組及阿侖膦酸鈉組小鼠股骨組織細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,骨小梁寬度增加,排列更整齊,接近對照組形態(tài),見圖2。

圖2 青娥丸對DOP小鼠股骨組織形態(tài)的影響(×200)

2.5 各組小鼠ALP、BUN、AST水平

與對照組相比,模型組ALP、BUN、AST含量均顯著增加(P<0.01)。與模型組相比,青娥丸低、中、高劑量組及阿侖膦酸鈉組ALP、BUN、AST含量均顯著下降(P<0.01),見表4。

表4 青娥丸對DOP小鼠血清ALP、BUN、AST含量的影響

2.6 各組小鼠GSK-3β、LRP5、COL1A1 mRNA水平

與對照組相比,模型組GSK-3β mRNA水平顯著上調(diào)(P<0.01),LRP5、COL1A1 mRNA水平顯著下調(diào)(P<0.01)。與模型組相比,青娥丸低、中、高劑量組及阿侖膦酸鈉組GSK-3β mRNA水平顯著下調(diào)(P<0.01),LRP5、COL1A1 mRNA水平顯著上調(diào)(P<0.01),見表5。

表5 青娥丸對DOP小鼠血清GSK-3β、LRP5、COL1A1 mRNA水平的影響

2.7 各組小鼠蛋白Wnt1、β-catenin、Runx2表達(dá)水平

與對照組相比,模型組中Wnt1、β-catenin、Runx2蛋白只有少量呈棕色的陽性表達(dá)(P<0.01)。與模型組相比,青娥丸低、中、高劑量組及阿侖膦酸鈉組中Wnt1、β-catenin、Runx2蛋白棕色染色面積變大,陽性表達(dá)增多(P<0.05),見圖3、表6。

表6 青娥丸對Wnt1、β-catenin、Runx2蛋白光密度的影響

3 討論

青娥丸自宋代以來就被用于中醫(yī)臨床治療,現(xiàn)已被納入絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥和非創(chuàng)傷性股骨頭缺血性壞死的治療指南。青娥丸能提高骨形態(tài)生成蛋白水平,促進成骨細(xì)胞分化,提高絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者血清骨硬化蛋白表達(dá),有效緩解骨質(zhì)疏松造成的損傷[8]。在去卵巢小鼠模型中,青蛾丸有效提高骨髓灌注、改善骨髓微循環(huán),對因老年或絕經(jīng)導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松有明顯治療效果[9]。但其對糖尿病導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松治療效果還尚未可知。本研究中DOP小鼠尾靜脈血糖上升,出現(xiàn)多飲、多尿、多食、體重減輕,小鼠股骨組織微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)病理改變,而青娥丸干預(yù)治療后,小鼠股骨組織病理損傷得到改善,骨密度增加,說明青娥丸對DOP小鼠具有治療作用。

在過去20年中,骨質(zhì)疏松癥治療有了實質(zhì)性的進步,研發(fā)了有效的骨吸收抑制劑或骨形成刺激劑藥物。阿侖膦酸鈉是治療骨質(zhì)疏松癥的常用藥之一,可通過抑制骨吸收來增加骨量并降低患者骨折的風(fēng)險,但常見的骨質(zhì)疏松癥藥理療法在DOP中的治療效果還有待增強。DOP是由于胰島素絕對或相對缺乏、激素失衡或內(nèi)分泌功能障礙引起的鈣、磷代謝紊亂,導(dǎo)致骨密度下降和骨微觀結(jié)構(gòu)改變,并且高糖水平會影響成骨細(xì)胞合成骨鈣素的能力,損害骨形成,抑制骨礦化[10]。實驗證據(jù)表明,較高水平的BUN可能會增加胰島素抵抗并抑制胰島素分泌,增加患糖尿病和脂肪肝的風(fēng)險[11-12]。AST分布于肝細(xì)胞線粒體中,其水平升高會使免疫細(xì)胞大量浸入肝臟,誘導(dǎo)肝損傷,加重糖尿病[13]。本研究中,青娥丸和阿侖膦酸鈉均可顯著降低小鼠細(xì)胞中BUN和AST水平,高劑量的青娥丸效果優(yōu)于阿侖膦酸鈉作用效果。同時,青娥丸和阿侖膦酸鈉干預(yù)后ALP表達(dá)降低。ALP是骨形成生物標(biāo)志物,由成骨細(xì)胞合成,可以反映成骨細(xì)胞的成熟度,對骨形成具有重要影響[14-15]。這說明青娥丸不僅可以緩解DOP的骨損傷,同時對糖尿病的發(fā)展具有一定的抑制作用。

研究證明,青娥丸可以通過增加β-catenin蛋白表達(dá)改善去卵巢骨質(zhì)疏松模型的骨微觀結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)[16]。β-Catenin是Wnt通路的重要信號分子,在成骨細(xì)胞分化、增殖和凋亡中起著重要作用。在Wnt/β-catenin通路中,LRP5可以與Wnt構(gòu)成復(fù)合體,抑制由GSK-3β表達(dá),進而抑制β-catenin的磷酸化,而未磷酸化的β-catenin會與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合,從而激活下游轉(zhuǎn)錄因子Runx2[17-18]。GSK-3β可負(fù)向調(diào)節(jié)骨代謝,當(dāng)其表達(dá)受到抑制時,能降低BMP信號通路中硬化蛋白表達(dá),促進成骨細(xì)胞的分化[19]。本研究中,青娥丸干預(yù)DOP小鼠模型后,小鼠細(xì)胞中Wnt1/β-catenin通路蛋白表達(dá)上調(diào),骨形成相關(guān)基因Runx2、LRP5 COL1A1表達(dá)上調(diào),GSK-3β表達(dá)下調(diào)。這說明青娥丸能通過Wnt1/β-catenin通路調(diào)控骨形成相關(guān)基因的表達(dá),從而發(fā)揮對DOP小鼠的治療作用。

綜上所述,青娥丸緩解DOP小鼠骨微結(jié)構(gòu)和骨密度受損,同時抑制糖尿病進展,發(fā)揮積極治療作用,其作用機制可能與青娥丸對Wnt1/β-catenin通路的激活作用有關(guān)。這為青娥丸對DOP患者的治療提供了更多的依據(jù),有望成為臨床抗DOP的理想選擇。