黃展輝 魏其鵬 梁煒瑜 周季青 丁富平 張進(jìn)*

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)研究中心,廣東 廣州 510006

2.廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣東 廣州510006

3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)護(hù)理學(xué)院,廣東 廣州510006

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis, PMOP)是以女性絕經(jīng)后因雌激素分泌不足而導(dǎo)致的骨量降低、骨微結(jié)構(gòu)損害、骨脆性增大為特征的一種全身代謝性骨病[1]。中國(guó)已經(jīng)進(jìn)入了中重度人口老齡化社會(huì),進(jìn)入絕經(jīng)期后的女性數(shù)量增多帶來(lái)PMOP高發(fā)性的危機(jī)。PMOP作為老年女性一種高發(fā)的疾病,現(xiàn)已成為一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題,針對(duì)PMOP的預(yù)防和治療是非常有意義的。

大量的臨床觀察性研究發(fā)現(xiàn)左歸丸具有治療PMOP的作用[2],但左歸丸在治療PMOP方面有著多效性、多方向的特性,其潛在的作用機(jī)制還未能完全明了。因此,目前臨床上僅將左歸丸作為一種替代療法使用。中醫(yī)藥在治療PMOP上有著便捷、費(fèi)用低、安全性高的特點(diǎn)[3-4]。因此,研究左歸丸治療PMOP的潛在機(jī)制對(duì)于明確左歸丸療效以及擴(kuò)大臨床治療使用有著重大意義。

FNDC5/Irisin作為新發(fā)現(xiàn)的運(yùn)動(dòng)因子,其與骨骼有著密切的聯(lián)系。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),外源性注射Irisin可以改善卵巢切除(OVX)小鼠的骨骼,Irisin能增加成骨細(xì)胞并減少破骨細(xì)胞的數(shù)量,從而維持OVX小鼠骨量和質(zhì)量[5]。而Wnt信號(hào)通路是調(diào)節(jié)成骨分化的重要通路之一[6]。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)左歸丸能夠通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路影響去勢(shì)骨質(zhì)疏松模型大鼠[7]。但左歸丸通過(guò)調(diào)節(jié)FNDC5進(jìn)而調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥尚未見(jiàn)報(bào)道。因此,本研究將通過(guò)小鼠體內(nèi)外實(shí)驗(yàn),對(duì)左歸丸治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)作用機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞:雄性SD大鼠20只,體重為250～300 g,購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;FNDC5基因敲除(KO)小鼠由賽業(yè)生物科技有限公司構(gòu)建并提供F1代C57BL/6小鼠,后續(xù)由本課題組自行飼養(yǎng)繁育;野生型C57BL/6小鼠購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。選用8周齡雌性野生型和KO小鼠各15只,體重為(20±1)g,在廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng),循環(huán)晝夜光照12 h,溫度(25±2)℃,濕度60 %～65 %,自由飲食飲水。每次實(shí)驗(yàn)都嚴(yán)格遵守動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理要求。小鼠MC3T3-E1細(xì)胞,購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2藥物及試劑:左歸丸(熟地黃24 g、川牛膝9 g、山茱萸12 g、山藥12 g、鹿角膠12 g、菟絲子12 g、枸杞子12 g、龜板膠12 g)購(gòu)自廣東省中醫(yī)院。以上藥物(除鹿角膠和龜板膠)加水至完全沒(méi)過(guò)飲片,浸泡30 min,煎煮30 min后將鹿角膠和龜板膠烊化后加入水煎液中,過(guò)濾,濃縮,除菌,4 ℃冷藏備用。堿性磷酸酶試劑盒(A059-2-2,中國(guó)建成科技);堿性磷酸酶染色試劑盒偶氮偶聯(lián)法(G1480-4,中國(guó)Solarbio);HE染色液試劑盒(G1120,中國(guó)羅基生物);RNA transmate轉(zhuǎn)染試劑(E607402-1000,中國(guó)生工);β-甘油磷酸鈉(G806967,中國(guó)Macklin);抗壞血酸(A92902,美國(guó)Sigma);EDTA脫鈣液(G1105,中國(guó)Servicebio);組織RNA提取試劑盒(EZB-RN001-plus,中國(guó)EZB);彩色逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(A0010CGQ,中國(guó)EZB),實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒(EZB-Probe-R2-L,中國(guó)EZB);小鼠I型前膠原N端前肽(PINP)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(MM-43891M2,中國(guó)MEIMIAN)、小鼠血清雌二醇(E2)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(MM-0566M2,中國(guó)MEIMIAN)、小鼠Irisin酶聯(lián)免疫分析試劑盒(MM-1119M2,中國(guó)MEIMIAN);BCA試劑盒(WLA004b,中國(guó)萬(wàn)類生物);GAPDH(D16H11,美國(guó)CST)、Wnt3a(C64F2,美國(guó)CST)、β-catenin(D10A8,美國(guó)CST);FNDC5抗體(DF13019,中國(guó)Affinity Biosciences);辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)二抗(A0208,中國(guó)Beyotime)。

1.1.3儀器:雙能X線骨密度儀,美國(guó)Hologic公司;紫外分光光度計(jì),美國(guó)NanoDrop科技有限公司;實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(型號(hào):CFX96),美國(guó)Bio-Rad公司;酶標(biāo)儀,美國(guó)Thermo公司;多功能自動(dòng)染色機(jī)、病理切片機(jī)、全自動(dòng)組織脫水機(jī),德國(guó)Leica公司;生物顯微鏡,日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物分組:將SD大鼠隨機(jī)分成空白對(duì)照組、左歸丸低、中、高濃度四組,左歸丸低、中、高濃度組大鼠按體重對(duì)應(yīng)的每日灌胃劑量為10.5 g/kg、21 g/kg、42 g/kg,空白對(duì)照組大鼠灌胃等量生理鹽水,連續(xù)灌胃7 d。灌胃后取各組大鼠含藥血清。將8周齡野生型雌性C57BL/6小鼠,按每組5只隨機(jī)分為三組:野生型對(duì)照組、野生型OVX組、野生型治療組。將8周齡雌性KO小鼠,按每組5只隨機(jī)分為三組:KO對(duì)照組、KO-OVX組、KO治療組。野生型OVX組、野生型治療組、KO-OVX組、KO治療組行卵巢切除,野生型對(duì)照組和KO對(duì)照組僅切除卵巢周圍脂肪。術(shù)后適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行灌胃,野生型治療組和KO治療組灌胃左歸丸水提液[15.75 g/(kg·d)],其余各組灌胃等量生理鹽水,連續(xù)給藥12周。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組:用10 %血清+1 %鏈霉素-青霉素溶液+89 % α-MEM培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞,接種于無(wú)菌培養(yǎng)皿中。將MC3T3-E1細(xì)胞接種于12孔板上,細(xì)胞分組為空白對(duì)照組、成骨誘導(dǎo)組(OGI組)、成骨誘導(dǎo)+左歸丸低濃度組(OGI-ZL組)、成骨誘導(dǎo)+左歸丸中濃度組(OGI-ZM組)、成骨誘導(dǎo)+左歸丸高濃度組(OGI-ZH組)、成骨誘導(dǎo)+轉(zhuǎn)染組(siOGI組)、成骨誘導(dǎo)+轉(zhuǎn)染+左歸丸低濃度組(siOGI-ZL組)、成骨誘導(dǎo)+轉(zhuǎn)染+左歸丸中濃度組(siOGI-ZM組)和成骨誘導(dǎo)+轉(zhuǎn)染+左歸丸高濃度組(siOGI-ZH組),每一組使用對(duì)應(yīng)的大鼠血清培養(yǎng)。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染:在細(xì)胞長(zhǎng)至40 %～50 %時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染?？瞻讓?duì)照組、OGI組、OGI-ZL組、OGI-ZM組、OGI-ZH組加入10 μmol/L空載轉(zhuǎn)染混合液,siOGI組、siOGI-ZL組、siOGI-ZM組和siOGI-ZH組加入含10 μmol/L FNDC5-SiRNA轉(zhuǎn)染混合液。6 h后更換培養(yǎng)液,24 h后進(jìn)行成骨誘導(dǎo)。

1.2.4成骨誘導(dǎo):除空白對(duì)照組外其余各組的培養(yǎng)液里加入50 μg/mL VC+10 mmol/L β-甘油磷酸鈉。每隔2 d換液一次。取第5、7、14天的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞上清ALP活力檢測(cè)。取第7天的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞ALP染色。

1.2.5骨密度檢測(cè):灌胃12周后,將各組小鼠放置于雙能X線骨密度分析儀下檢測(cè)骨密度(bone mineral density, BMD)。

1.2.6血清ELISA檢測(cè):灌胃12周后,通過(guò)眼球摘除方式收集小鼠全血1 mL,室溫靜置30 min后,在4 ℃條件下3 000 r/min離心15 min后,分離血清。具體操作嚴(yán)格按照相應(yīng)的ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。

1.2.7股骨切片和HE染色:分離小鼠股骨組織,在4 %多聚甲醛中充分固定24 h,EDTA脫鈣液脫鈣1個(gè)月。脫鈣后進(jìn)行組織脫水、浸蠟、包埋等制做石蠟切片。切片經(jīng)脫蠟、蘇木精-伊紅染色、脫水、透明、封片等步驟后在顯微鏡下拍照采集圖像。

1.2.8實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng):使用RNA提取純化試劑盒提取股骨組織RNA。使用彩色逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,使用實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒在PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time PCR)。以β-actin為參照基因,用2-△△Cq法進(jìn)行定量。引物序列:β-actin:上游CATTGCTGA CAGGATGCAGA,下游CTGCTGGAAGGTGGACA GTGA;FNDC5:上游GCTAGGCTGCGTCTGCTTCG,下游GCTAGGCTGCGTCTGCTTCG;Runx2:上游CATCGCTTTCAAGGTGGTGG,下游ATGGCTGCGGT AGCATTTCT;OPN:上游CTCCATTGACTCGAA CGACTC,下游CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGAT;OCN:上游GACCTC ACAGATGCCAAGCCC,下游ATAGATGCGTTTGTAGGCGGTC;OSX上游AGC GACCACTTGAGCAAACAT,下游GCGGCTGATTG GCTTCTTCT。

1.2.9Western Blot:用蛋白裂解液提取股骨組織蛋白,BCA試劑盒定量蛋白濃度,在10 % SDS-PAGE凝膠上蛋白樣品進(jìn)行電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,4 %脫脂奶粉封閉2 h,一抗[GAPDH (1∶5 000)、FNDC5 (1∶1 500)、Wnt3a (1: 5 000)、β-catenin(1∶1 500)] 4 ℃孵育過(guò)夜,二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h,ECL顯色,全自動(dòng)發(fā)光儀顯影后使用ImageJ計(jì)算目的蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 左歸丸對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞成骨誘導(dǎo)后ALP含量的影響

第5、7、14天細(xì)胞上清ALP活力檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。除了空白對(duì)照組外,其余各組的ALP含量都隨著成骨誘導(dǎo)的時(shí)間而增加,且OGI組、OGI-ZL組、OGI-ZM組增加幅度較大。第14天各組細(xì)胞上清ALP活力檢測(cè)如表1所示。與空白對(duì)照組對(duì)比,OGI組的ALP活力顯著上升(P=0.001);與OGI組比較,OGI-ZL組稍有升高但無(wú)顯著差異(P=0.402),OGI-ZM組ALP活力顯著升高(P= 0.001),OGI-ZH組和siOGI組ALP活力顯著下降(P<0.001)。與siOGI組相比,siOGI-ZL組、siOGI-ZM組和siOGI-ZH組都無(wú)顯著差異。

表1 第14天MC3T3-E1細(xì)胞上清ALP檢測(cè)

圖1 成骨誘導(dǎo)第5、7、14天各組細(xì)胞上清ALP濃度

對(duì)細(xì)胞進(jìn)行ALP染色結(jié)果如圖2所示,ALP活性部分出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中呈藍(lán)色。空白對(duì)照組未見(jiàn)藍(lán)色染色區(qū),OGI組可見(jiàn)散在的藍(lán)色染色區(qū),siOGI組也僅呈現(xiàn)較少的藍(lán)染。OGI-ZL組和OGI-ZM組可以見(jiàn)到明顯的藍(lán)染區(qū)域,而OGI-ZH組則相對(duì)較少。siOGI-ZL組、siOGI-ZM組、siOGI-ZH組都僅有少量藍(lán)染區(qū)。ALP細(xì)胞染色結(jié)果與細(xì)胞上清ALP檢測(cè)結(jié)果呈一致的趨勢(shì)。

圖2 成骨誘導(dǎo)第7天各組細(xì)胞ALP染色(40×)

圖3 各組小鼠股骨HE染色切片(200×)

2.2 小鼠股骨BMD檢測(cè)

與野生型對(duì)照組小鼠相比,KO對(duì)照組小鼠BMD稍微下降(P=0.089),卵巢切除后的野生型OVX組小鼠的BMD顯著下降(P<0.001);與野生型OVX組相比,野生型治療組小鼠的BMD明顯上升(P=0.002);與KO對(duì)照組小鼠相比,KO-OVX組小鼠的BMD顯著下降(P<0.001);與KO-OVX組小鼠相比,KO治療組小鼠無(wú)明顯差異(P=0.162)。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠股骨

2.3 小鼠股骨HE切片

在鏡下野生型對(duì)照組和KO對(duì)照組的小鼠股骨骨小梁較為致密、結(jié)構(gòu)完整、連續(xù)性好、骨小梁之間間距較窄。OVX組的小鼠股骨骨小梁稀疏變細(xì),結(jié)構(gòu)斷裂,連續(xù)性差,間距變寬。KO-OVX組的小鼠股骨切片較KO對(duì)照組的小鼠也明顯表得稀疏、斷裂以及較大的間隙,同時(shí)股骨內(nèi)的脂肪組織明顯增加。較于野生型OVX組,野生型治療組的小鼠股骨骨小梁面積變寬,結(jié)構(gòu)較為完整、連續(xù)性改善,間距變小。而相較于KO-OVX組,KO治療組的小鼠在左歸丸的治療下,股骨骨小梁依舊稀疏細(xì)短,結(jié)構(gòu)斷裂,連續(xù)性差,間距寬及較多脂肪組織。見(jiàn)圖2。

2.4 小鼠血清ELISA檢測(cè)

與野生型對(duì)照組相比,野生型OVX組的小鼠血清E2、PINP、Irisin含量顯著減少;與野生型OVX組相比,野生型治療組的小鼠血清E2、PINP、Irisin含量顯著減少;與KO對(duì)照組相比,KO-OVX組血清E2、Irisn含量下降,但無(wú)顯著差異,PNIP顯著減少;與KO-OVX組相比,KO治療組小鼠血清E2、PINP、Irisin無(wú)明顯差異。見(jiàn)表3。

表3 小鼠血清ELISA檢測(cè)

2.5 小鼠股骨組織成骨相關(guān)基因mRNA表達(dá)

與野生型對(duì)照組相比,野生型OVX組和KO對(duì)照組Runx2、OSX、OCN mRNA明顯降低,KO-OVX組較KO對(duì)照組Runx2、OSX、OCN明顯下降;野生型治療組相較野生型OVX組Runx2、OSX、OCN顯著升高,而KO-OVX組和KO治療組無(wú)明顯差異。在OPN方面,野生型OVX組較野生型對(duì)照組的OPN顯著上升,野生型治療組較野生型OVX組顯著降低;而KO-OVX組較KO對(duì)照組顯著降低,KO治療組和KO-OVX組無(wú)顯著差異。見(jiàn)表4。

表4 股骨組織Runx2、OPN、OCN、OSX mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.6 FNDC5 mRNA表達(dá)和FNDC5、Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)

與野生型對(duì)照組相比,KO對(duì)照組小鼠的股骨FNDC5 mRNA表達(dá)明顯降低(P=0.03);相比較于野生型OVX組,野生型治療組FNDC5表達(dá)顯著上升(P=0.004);而比較于KO-OVX組,KO治療組FNDC5表達(dá)無(wú)明顯差異(P= 0.840)。見(jiàn)表5。

表5 小鼠股骨FNDC5 mRNA表達(dá)

與野生型對(duì)照組相比,野生型OVX組和小鼠股骨組織中FNDC5、Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)顯著減少(P<0.05),KO對(duì)照組中FNDC5、β-catenin蛋白表達(dá)顯著減少。與野生型OVX組相比,野生型治療組Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)顯著上升(P<0.05)。與KO對(duì)照組相比,KO-OVX組的FNDC5、Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)顯著減少(P<0.05);而KO治療組與KO-OVX組的蛋白表達(dá)均無(wú)明顯差異。見(jiàn)圖4。

圖4 各組小鼠股骨組織中β-catenin、Wnt3a、FNDC5蛋白表達(dá)

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為,腎主骨生髓,腎精的充盛程度與骨強(qiáng)弱關(guān)系密切。補(bǔ)腎壯骨的本質(zhì)就是通過(guò)補(bǔ)腎促進(jìn)骨形成,使骨形成大于骨吸收從,而達(dá)到壯骨的效果。左歸丸作為經(jīng)典的補(bǔ)腎方劑,在臨床上一直以來(lái)都是治療PMOP的重要方劑,但是其內(nèi)在的作用機(jī)制一直尚未闡明。

本研究使用了siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默了MC3T3-E1細(xì)胞FNDC5的表達(dá),進(jìn)而從體外實(shí)驗(yàn)上探討左歸丸促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化與FNDC5之間的關(guān)系。成骨誘導(dǎo)后,通過(guò)細(xì)胞上清ALP檢測(cè)和細(xì)胞ALP染色,發(fā)現(xiàn)了低、中濃度的左歸丸含藥血清可促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞ALP表達(dá),而轉(zhuǎn)染FNDC5會(huì)抑制左歸丸含藥血清對(duì)ALP表達(dá)的促進(jìn)。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)左歸丸可以顯著改善野生型小鼠OVX術(shù)后導(dǎo)致的BMD降低以及股骨骨小梁的損害,左歸丸的治療并不能顯著的緩解KO小鼠OVX后BMD的降低和骨小梁的損害。這說(shuō)明左歸丸發(fā)揮治療PMOP的作用與FNDC5/Irisin有著潛在的關(guān)系。PINP是骨形成的重要標(biāo)志[8],在骨轉(zhuǎn)化的初期會(huì)顯著提高,并且隨著PINP含量降低,骨形成弱于骨吸收,骨量以及骨強(qiáng)度隨之下降[9]。Runx2基因是調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化和骨形成的重要靶基因,是Wnt/β-catenin通路影響成骨細(xì)胞分化所必需的靶基因[10]。OSX是一種可以促進(jìn)骨形成進(jìn)程的成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子,同時(shí)也是Runx2的下游靶基因[11]。OCN是一種鈣結(jié)合蛋白,可以參與鈣和骨轉(zhuǎn)化代謝,能促進(jìn)鈣沉積,是骨形成的標(biāo)志[12]。OPN是由破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞生成的一種多糖蛋白,在骨轉(zhuǎn)化活躍的時(shí)候顯著上升,可激發(fā)骨吸收[13]。OVX術(shù)后,小鼠血清雌激素E2下降,成骨相關(guān)的基因OPN增加,小鼠骨轉(zhuǎn)化進(jìn)入了活躍狀態(tài)。野生型治療組小鼠在左歸丸的干預(yù)下,抑制了OPN的增加,緩解E2下降,并提高了血清PINP含量和Runx2、OSX、OCN等成骨分化相關(guān)基因的mRNA表達(dá)。而對(duì)比KO-OVX組,KO治療組的E2、PINP、OPN、Runx2、OSX、OCN等指標(biāo)均沒(méi)有明顯差異。此外本研究檢測(cè)了FNDC5、Wnt3a、β-catenin的蛋白表達(dá),結(jié)果顯示左歸丸可以上調(diào)Wnt3a和β-catenin的表達(dá),但當(dāng)FNDC5被敲除后這種上調(diào)效果被顯著抑制。這些結(jié)果說(shuō)明了左歸丸可能通過(guò)FNDC5來(lái)激活Wnt3a/β-catenin信號(hào)通路,進(jìn)而促進(jìn)了Runx2、OSX、OCN的表達(dá),抑制OPN,從而促進(jìn)了成骨分化使骨形成大于骨吸收,改善了PMOP小鼠的骨代謝。

綜上所述,左歸丸可能通過(guò)增強(qiáng)成骨基因Runx2、OSX、OCN等的表達(dá)促進(jìn)成骨分化來(lái)改善OVX小鼠的骨質(zhì)疏松,或許是通過(guò)調(diào)控FNDC5/Wnt3a/β-catenin信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的,FNDC5很有可能是左歸丸治療的靶蛋白。