劉艷軍 徐永平 李淑英 羅祥林 陳元維*

1. 太原工業(yè)學院材料工程系,山西 太原 030008

2. 大連賽姆生物工程技術有限公司博士后工作站,遼寧 大連 116600

3. 大連理工大學生物工程學院,遼寧 大連 116600

4. 四川大學高分子科學與工程學院,四川 成都 610065

由于具有良好的生物可降解性和生物相容性,聚乳酸組織工程支架廣泛應用于骨缺損修復[1-3]。聚乳酸在體內(nèi)通過酶解和水解最終生成乳酸,這是糖的一種代謝產(chǎn)物[4]。然而,在臨床應用過程中,部分植入聚乳酸支架的患者出現(xiàn)無菌性炎癥或骨溶解,可能原因是聚乳酸在體內(nèi)降解引起微環(huán)境改變,抑制成骨細胞發(fā)揮功能,影響破骨細胞功能[5-7]。為了探究聚乳酸降解產(chǎn)物對細胞生長微環(huán)境的影響,已有研究利用乳酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH來探究乳酸對細胞增殖活性和成骨表型的影響,發(fā)現(xiàn)隨著乳酸濃度增加(pH從7.4至6.8),乳酸對細胞增殖活性和成骨分化能力抑制作用增強[8]。研究表明,植入體內(nèi)的聚乳酸支架降解產(chǎn)生大量乳酸,乳酸累積使微環(huán)境pH降至6以下[9-11]。He等[12]在體外研究乳酸的細胞毒性,并探究其對細胞堿性磷酸酶活性的影響,結果表明隨著乳酸濃度增加(pH從7.4至5.5),其細胞毒性增大,細胞堿性磷酸酶活性降低。馮婷婷等[13]探究聚乳酸降解終產(chǎn)物乳酸對成骨樣細胞增殖和成骨表型的影響,結果表明乳酸濃度增加(pH從7.4至5.5)會抑制細胞增殖能力,而低濃度乳酸(4 mmol/L)對細胞堿性磷酸酶活性和形成鈣結節(jié)能力無影響,但高濃度乳酸對于細胞成骨表型的影響并未研究。此外,乳酸對I型膠原和骨鈣素等成骨表型關鍵標志物的影響也未研究,因此聚乳酸降解終產(chǎn)物對細胞成骨礦化影響的機理尚不明確。

本研究利用聚乳酸降解終產(chǎn)物乳酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH,模擬聚乳酸降解終產(chǎn)物對微環(huán)境的影響,用含不同濃度乳酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)大鼠成骨樣細胞,觀察乳酸對細胞形態(tài)的影響,并檢測與成骨密切相關的I型膠原、堿性磷酸酶和骨鈣素的分泌量和礦化鈣結節(jié)形成情況,在分子水平探討了細胞堿性磷酸酶mRNA表達情況,探討聚乳酸降解終產(chǎn)物對細胞成骨礦化的影響機理,為聚乳酸骨支架的精確設計與體內(nèi)應用提供參考意義。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑和主要設備

實驗所用細胞為大鼠成骨樣細胞Ros17/2.8,購自四川大學華西醫(yī)院;左旋乳酸溶液(L-LA)購自美國Alfa Aesar公司;DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibico公司;青霉素、鏈霉素購自中國北京索萊寶公司;小牛血清購自中國北京圣馬元亨生物制品研究所;ALP試劑盒購自中國北京柏定試劑公司;TRIZOL購自美國Molecular Research Center INC;逆轉錄試劑盒和PCR master mix購自美國賽默飛世爾科技公司;I型膠原和骨鈣素ELISA試劑盒品牌為Novus Biologicals,購自美國Bio-Techne公司。

MCO-18AIC型細胞培養(yǎng)箱購自日本SANYO公司;IX51熒光倒置相差顯微鏡購自日本Olympus公司;實驗所用的細胞培養(yǎng)板購自美國Corning公司;DNM-9606型酶標儀購自中國北京普朗公司;7300型Real time PCR儀購自美國ABI公司;VAPRO5520型露點滲透壓儀購自美國Wescor公司。

1.2 方法

1.2.1含乳酸培養(yǎng)基的制備:分別配制乳酸濃度為8、16、22、27 mmol/L的培養(yǎng)基,將不含乳酸的培養(yǎng)基作為對照組,利用pH計和滲透壓儀檢測培養(yǎng)基的pH和滲透壓。

1.2.2細胞形態(tài)觀察:將細胞以4×104個/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔200 μL,細胞培養(yǎng)箱溫度為37 ℃,保持5 % CO2和飽和濕度,培養(yǎng)24 h后,吸去舊液,加入含乳酸培養(yǎng)基(8、16、22、27 mmol/L),不含乳酸培養(yǎng)基為對照組,培養(yǎng)3 d后,利用倒置顯微鏡觀察并拍照記錄。

1.2.3ALP活性檢測:通過ALP試劑盒測定細胞ALP活性。按照1.2.2方法接種細胞,培養(yǎng)3 d后,吸去培養(yǎng)基,加入200 μL細胞裂解液0.1 % Triton X-100,放置過夜后,利用超聲破碎細胞,測定細胞ALP活性。

1.2.4ELISA法檢測I型膠原和骨鈣素含量:通過ELISA試劑盒檢測細胞I型膠原和骨鈣素含量。按照1.2.2方法接種細胞,培養(yǎng)3 d后,按照使用說明測定I型膠原含量;每3天換一次液,培養(yǎng)7 d后,按照使用說明測定骨鈣素含量。

1.2.5細胞礦化鈣結節(jié)檢測:將細胞以105個/mL的密度接種于24孔板內(nèi),培養(yǎng)24 h后,吸去舊液,加入含乳酸培養(yǎng)基(8、16、22、27 mmol/L),將不含乳酸培養(yǎng)基為對照組,培養(yǎng)3 d后,采用含礦化誘導液(10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 mg/LL-抗壞血酸)的正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)21 d。期間每3天換一次正常培養(yǎng)基,吸棄舊液,加入鹽酸四環(huán)素濃度為100 μg/mL的正常培養(yǎng)基,培養(yǎng)30 min后,PBS清洗兩遍,倒置熒光顯微鏡下觀察拍照。利用Image Pro Plus 6.0軟件,計算所生成的鈣結節(jié)面積占總面積的百分比來進行鈣結節(jié)定量分析,得到鈣結節(jié)陽性面積比。

1.2.6實時定量PCR方法檢測ALP mRNA表達:將細胞以105個/mL的密度接種于6孔板內(nèi),培養(yǎng)24 h后,吸去舊液,加入含乳酸培養(yǎng)基(8、16、22、27 mmol/L),將不含乳酸培養(yǎng)基為對照組,培養(yǎng)3 d后,裂解細胞,提取總RNA,利用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性檢測并測定濃度,反轉錄成cDNA,然后利用實時定量PCR擴增目的基因,具體步驟如下:(1)樣本稀釋:每個標本取4 μL于200 μL無菌EP管中,然后加入16 μL無菌H2O稀釋,充分混勻,于冰浴中按每管6 μL分裝于PCR 8連管中備用;(2)實時定量PCR反應體系的配制:預混實時定量PCR反應液,其中H2O 4.7 μL,PCR master mix 12.5 μL,上下游引物及探針各0.6 μL,充分混勻后,分裝于含cDNA模板的PCR管中。離心后,轉移至實時熒光定量基因擴增儀中;(3)反應條件設置為:① 94 ℃ 2 min;② 94 ℃ 20 sec,50 ℃～60 ℃(依據(jù)引物的Tm值可變)30 sec,60 ℃ 40 sec,45個循環(huán);于60 ℃ 40 sec時采集熒光。其中,ACTB復性溫度為53 ℃;ALP復性溫度為54 ℃;反應結束后,分析擴增動力學曲線,確定樣品Ct值,并換算成相對于內(nèi)參照基因的相對表達量。采用REST軟件對所獲得的Ct進行統(tǒng)計學處理。根據(jù)基因序列設計各基因的引物和探針,見表1。

表1 各基因的引物與探針序列

1.3 統(tǒng)計學分析

通過SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學分析,結果采用均數(shù)±標準差表示,組間比較通過單因素方差分析,檢驗標準α=0.05。

2 結果

2.1 乳酸對培養(yǎng)基pH和滲透壓的影響

如表2所示,與對照組(不含乳酸培養(yǎng)基)相比,含乳酸培養(yǎng)基的pH隨乳酸濃度增加而降低,滲透壓升高。

表2 不同培養(yǎng)基的pH值和滲透壓

2.2 乳酸對細胞形態(tài)的影響

不同培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞3 d后,發(fā)現(xiàn)對照組細胞呈長梭形,少量圓形,平行排列或呈漩渦狀,細胞鋪滿了基底,如圖2A所示。隨著培養(yǎng)基中乳酸濃度增加,細胞的形態(tài)發(fā)生改變,長梭形細胞減少,圓形細胞數(shù)量增加,同時細胞數(shù)量減少,如圖2B～圖2E所示,當乳酸濃度增加至27 mmol/L時,細胞收縮變形,觀察到少量長梭形細胞,排列不規(guī)則,數(shù)量明顯減少。

圖1 不同培養(yǎng)基中成骨樣細胞的形態(tài)

圖2 乳酸對細胞分泌I型膠原、堿性磷酸酶、骨鈣素的影響

2.3 乳酸對細胞成骨表型的影響

培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞3 d后,利用ELISA法測定I型膠原含量,如圖3A所示,與對照組相比,低濃度乳酸組(8、16 mmol/L)的I型膠原量都顯著高于對照組,其余組與對照組相比無顯著差異;培養(yǎng)3 d后,檢測細胞堿性磷酸酶活性,如圖3B所示,與對照組相比,16、22、27 mmol/L組ALP活性隨乳酸干預濃度的增加呈濃度依賴性下降,差異有統(tǒng)計學意義。當乳酸濃度為16、22、27 mmol/L時,細胞ALP活性分別為對照組的59.4%(P<0.05)、34.7%(P<0.01)和22.4%(P<0.01);培養(yǎng)7 d后,通過ELISA法測定骨鈣素含量,如圖3C所示,含乳酸組的骨鈣素量與對照組之間沒有顯著差異(P>0.05)。

圖3 不同培養(yǎng)基中所形成的鈣結節(jié)

2.4 乳酸對礦化鈣結節(jié)的影響

細胞在體外條件下經(jīng)增殖期、分泌期和礦化期,最終以鈣結節(jié)的形式生成鈣鹽沉積,經(jīng)四環(huán)素染色后呈現(xiàn)黃色熒光[14-16]。如圖3A～圖3E所示,對照組中鈣結節(jié)數(shù)量多,體積大,是由大量細胞堆積生成,與對照組相比,含乳酸組中所形成的鈣結節(jié)數(shù)量少,體積較小。隨著乳酸濃度增加,鈣結節(jié)數(shù)量減少。當乳酸濃度為27 mmol/L時,完全沒有鈣結節(jié)生成。通過定量分析(圖3F),與對照組相比,16、22、27 mmol/L組鈣結節(jié)陽性面積隨著乳酸干預濃度的增加呈濃度依賴性下降,差異有統(tǒng)計學意義。

2.5 乳酸對堿性磷酸酶mRNA表達的影響

培養(yǎng)3 d后,測定細胞ALP mRNA的相對表達量。利用動力學曲線讀取Ct值,通過REST軟件確定ALP相對表達量。如表3所示,當乳酸濃度為8 mmol/L時,ALP mRNA表達量為對照組的0.594,當乳酸濃度為16 mmol/L時,ALP mRNA表達量為對照組的0.104(P<0.01),顯著低于對照組。

表3 不同培養(yǎng)基中細胞ALP mRNA的相對表達量

3 討論

意外事故、運動損傷和骨科疾病通常會導致骨缺損[17-18]。人體骨具有一定的自愈能力,但通常情況下都需要植入骨組織工程支架來實現(xiàn)骨修復或重建[19-20]。然而患者常在聚乳酸支架植入處出現(xiàn)不良反應,主要因為聚乳酸降解終產(chǎn)物乳酸引起骨組織生理環(huán)境改變,影響細胞正常功能,導致骨組織處炎癥和病變[5-6]。

本研究將不同濃度乳酸加入培養(yǎng)基來模擬聚乳酸降解終產(chǎn)物對微環(huán)境的影響,結果表明,對照組pH為7.2～7.4之間,滲透壓為(318.7±1.5)mOsm/kg,此時酸度和滲透壓與體內(nèi)生理環(huán)境條件接近,能夠滿足細胞的生長和增殖要求[21]。當加入乳酸后,培養(yǎng)基的pH和滲透壓改變,微環(huán)境改變會影響細胞的正常功能,尤其當pH低于6.8時,明顯觀察到細胞形態(tài)收縮,細胞間雜質增多,可能是低pH引起的酸中毒影響細胞的代謝活動。另外,高滲透壓也會引起細胞皺縮。此外,還研究了乳酸對細胞成骨分化標志物的影響,主要有早期分化標志物I型膠原和堿性磷酸酶,晚期分化標志物-骨鈣素[22-23]。結果表明,低濃度乳酸(8、16 mmol/L)對細胞分泌I型膠原有一定的促進作用,顯著高于對照組。有研究表明乳酸和乙醇酸處理的成骨細胞更傾向于成為晚期成骨細胞,乳酸對于細胞分泌I型膠原具有促進作用,因此低濃度乳酸對細胞分泌I型膠原具有促進作用,筆者推測當乳酸濃度增大時,對細胞增殖的抑制作用增強,細胞數(shù)量減少,使得細胞分泌I型膠原總量減少[24]。乳酸濃度到達某一濃度時,其對細胞分泌I型膠原的促進與對細胞增殖的抑制共同作用下,高濃度的乳酸沒有體現(xiàn)出促進作用。乳酸會抑制細胞堿性磷酸酶活性,并且隨乳酸濃度增大,抑制作用增強,該結果與以前的報道基本一致,可能是因為酸性條件下細胞的基質Gla蛋白(一種礦化抑制劑)上調(diào)而導致堿性磷酸酶活性降低[24]。骨鈣素是由成熟成骨細胞分泌一種非膠原蛋白,通過特異性吸附鈣,在成骨晚期能夠促進形成鈣結節(jié)[25],乳酸對細胞骨鈣素的分泌沒有抑制作用,如圖3C所示。

成骨細胞經(jīng)體外培養(yǎng)誘導分化,形成礦化鈣結節(jié),最終完成骨礦化過程[26]。如圖3所示,乳酸會抑制細胞的成骨礦化能力。成骨細胞的礦化過程十分復雜,多種調(diào)節(jié)因子都會對細胞的礦化過程發(fā)揮作用[27],根據(jù)實驗結果(圖3),乳酸通過抑制細胞堿性磷酸酶活性,從而影響成骨礦化能力。此外,細胞形態(tài)改變和數(shù)量減少,也會影響細胞的成骨礦化能力。堿性磷酸酶是成骨細胞早期成熟的主要標志物,其通過水解磷酸酯,提高磷酸根濃度,從而啟動鈣化過程[28],因此在分子水平上,筆者進一步研究了乳酸對于細胞ALP mRNA表達的影響。結果表明,隨著乳酸濃度增加,細胞ALP mRNA相對表達量降低,乳酸抑制細胞堿性磷酸酶mRNA表達,這與堿性磷酸酶活性實驗結果一致(圖3B)。

聚乳酸植入物降解引起無菌性炎癥或骨溶解,研究表明,聚乳酸降解終產(chǎn)物乳酸是引起上述癥狀的原因之一[7-12]。已有研究關注乳酸對成骨細胞成骨功能的影響,但乳酸影響成骨細胞礦化的機理還不明確。本研究探討了乳酸對微環(huán)境的影響,重點研究乳酸對于成骨樣細胞生長和成骨表型標志物的影響,在分子水平上進一步研究了乳酸對堿性磷酸酶mRNA表達的影響。聚乳酸降解終產(chǎn)物乳酸可抑制細胞ALP mRNA的表達,降低ALP活性,隨著乳酸濃度增大,乳酸抑制作用增強,最終降低細胞的成骨礦化能力。此外,乳酸并不會抑制細胞分泌I型膠原和骨鈣素,細胞形態(tài)改變和數(shù)量減少也可能會影響細胞的成骨礦化能力。

聚乳酸一直被認為具有良好的生物相容性和生物可降解性,然而實驗結果表明,其作為骨組織工程支架需要面對諸多問題:如何控制其降解速度,使得降解產(chǎn)生的乳酸濃度控制在安全的濃度范圍內(nèi),減少乳酸對微環(huán)境的影響;能否通過制備聚乳酸復合支架來避免乳酸對細胞堿性磷酸酶活性的不良影響,保持成骨細胞的成骨礦化能力。但總的來說,本研究結果仍然能夠為聚乳酸骨組織工程支架的設計提供一定的參考意義。