李 鈺,包佩玲,謝 賽,虞典元,李 丹,馮愛(ài)橋

(1. 武漢科技大學(xué)附屬孝感醫(yī)院,湖北 孝感 432000;2. 武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院,湖北 武漢 430000)

糖尿病是一種代謝性疾病,糖尿病腎病是糖尿病微血管病引起的常見(jiàn)并發(fā)癥,是糖尿病患者死亡和殘疾的主要原因之一[1]。流行病學(xué)研究顯示,全世界約有40%的糖尿病患者會(huì)發(fā)展為糖尿病腎病,糖尿病腎病已成為慢性腎臟病的主要病因[2]。既往研究認(rèn)為糖尿病腎病主要是腎小球疾病,然而越來(lái)越多的證據(jù)表明高糖環(huán)境下腎小管的損傷是導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的主要原因,抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡可以減輕蛋白尿,改善腎功能[3]。因此,可以把抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡作為治療糖尿病腎病的有效靶點(diǎn)。 姜黃素具有廣泛的生物活性,其能作用于多種信號(hào)通路,可降低血糖,改善胰島細(xì)胞功能及炎癥和氧化應(yīng)激等造成的器官損傷[4],但姜黃素對(duì)高糖環(huán)境下腎小管上皮細(xì)胞凋亡是否有影響,目前相關(guān)研究較少。本研究探討了姜黃素對(duì)高糖環(huán)境下腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響及其可能作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1材料 大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞株(NRK-52E,購(gòu)于上海中科院細(xì)胞庫(kù)),姜黃素(Sigma公司),兔抗鼠Bcl單克隆抗體、兔抗鼠Bax單克隆抗體、山羊抗兔IgG 標(biāo)記二抗(中杉金橋),彩色預(yù)染Marker(NEB),胎牛血清(Gibco公司),PCR引物及核苷酸序列(北京本元正陽(yáng)基因技術(shù)有限公司),Annexin V/PI染液(BD公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 將大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞株移入含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基,置于含5%CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培育,傳代前先吸去上清液,用PBS洗培養(yǎng)板3次,用0.25%胰酶消化細(xì)胞,加入新的培養(yǎng)液,移液槍吹打細(xì)胞,使其懸浮,將細(xì)胞移至離心管,1 000 r/min離心5 min,移去上清,在沉淀物中加入新的培養(yǎng)液,更換新的培養(yǎng)板,顯微鏡下觀察細(xì)胞,放入恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),每2～3 d傳代1次。

1.2.2細(xì)胞凍存和復(fù)蘇 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腎小管上皮細(xì)胞,倒出培養(yǎng)器皿內(nèi)的培養(yǎng)基,用PBS洗滌細(xì)胞,加入0.25%胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞,再將細(xì)胞移入15 mL離心管中,于水平離心機(jī)上1 000 r/min離心5 min,倒掉胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液,加入適量配制好的凍存培養(yǎng)基,用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻,調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的終密度為(5～10)×106/mL。細(xì)胞復(fù)蘇時(shí),于4 ℃中平衡30 min,-20 ℃放置2 h,移入-70 ℃放置過(guò)夜,次日轉(zhuǎn)入液氮中凍存。細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)將凍存管取出,迅速放入37 ℃水浴,不斷晃動(dòng),保證快速完全解凍。移取細(xì)胞懸液至預(yù)先加入了培養(yǎng)基的離心管中,水平離心機(jī)1 000 r/min離心1 min,小心倒掉上清,加入培養(yǎng)基,輕柔吹吸幾次重懸細(xì)胞,接種至培養(yǎng)瓶,置于含5%CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培育。

1.2.3細(xì)胞分組及干預(yù) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腎小管上皮細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)分為4組:對(duì)照組采用含5.5 mmol/L的D-葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng),高糖組采用含30 mmol/L的D-葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng),姜黃素低劑量組采用含30 mmol/L的D-葡萄糖和5 μmol/L姜黃素的培養(yǎng)基培養(yǎng),姜黃素高劑量組采用含30 mmol/L的D-葡萄糖和10 μmol/L姜黃素的培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1細(xì)胞凋亡檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng)48 h后,收集細(xì)胞,500～1 000 r/min離心5 min,棄去培養(yǎng)液,用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞1次,再次500～1 000 r/min離心5 min,棄去PBS,調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為(1～5)×106/mL,加入預(yù)冷的70%乙醇4 ℃固定1 h。棄去固定液,PBS重懸細(xì)胞5 min,用400目的篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞1次,500～1 000 r/min離心5 min。流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm,用一波長(zhǎng)為515 nm的通帶濾器檢測(cè)FITC熒光,另一波長(zhǎng)大于560 nm的濾器檢測(cè)PI,計(jì)算凋亡率。

1.3.2細(xì)胞中Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)情況 采用Western blot法檢測(cè):用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞中的總蛋白,用BCA試劑盒測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)含量,蛋白樣品與上樣緩沖液Buffer按照1∶5的比例充分混勻,100 ℃煮沸變性8～10 min。取15 μg樣品于SDS-PAGE進(jìn)行電泳并轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜,5%脫脂奶粉+TBST室溫封閉2 h,滴加一抗(Bax 1∶2000,Bcl-21∶5 000),4 ℃孵育過(guò)夜后滴加二抗(1∶5 000),室溫孵育1 h,ECL發(fā)光液孵育,膠片曝光,顯影定影后用ImageScanner Ⅲ掃描儀獲取圖像,采用Quantity One圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析。

1.3.3細(xì)胞中Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)情況 收集細(xì)胞,提取細(xì)胞總RNA,利用primscriprt試劑盒進(jìn)行單鏈cDNA合成,利用CFX96 (BIO-RAD)儀器進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR,并在96孔板上進(jìn)行單獨(dú)的PCRs。引物序列:Bax上游引物為5’-TTTGCTTCAGGGTTTCATCC -3’,下游引物為5’-CAGTTGAAGTTGCCGTCAGA-3’;Bcl-2上游引物為5’-GGATGCCTTTGTGGAACTGC-3’,下游引物為5’-CAGTTGAAGTTGCCGTCAGA-3’;β-actin上游引物為5’-CACACCTTCTACAATGAGCTG-3’,下游引物為5’-GTCTCAAACATGATCTGGGTC-3’。PCR條件:95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃變性5 s、 58 ℃退火15 s,循環(huán)40次,在每個(gè)循環(huán)結(jié)束后,在58 ℃測(cè)量熒光值。應(yīng)用2-△△CT方法計(jì)算Bax、Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,各組計(jì)量數(shù)據(jù)比較采用方差分析,兩兩比較采用LSD檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡情況 高糖組腎小管上皮細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組(P<0.05);姜黃素低、高劑量組細(xì)胞凋亡率均明顯低于高糖組(P均<0.05),且姜黃素高劑量組明顯低于姜黃素低劑量組(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照組和高糖環(huán)境下各組大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡情況

2.2各組大鼠腎小管上皮細(xì)胞中Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)情況 與對(duì)照組比較,高糖組大鼠腎小管上皮細(xì)胞中Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯增高(P<0.05),Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.05);姜黃素低、高劑量組大鼠腎小管上皮細(xì)胞中Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于高糖組(P均<0.05),Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于高糖組(P均<0.05),且姜黃素高劑量組Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于姜黃素低劑量組(P<0.05),Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于姜黃素低劑量組(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 對(duì)照組和高糖環(huán)境下各組大鼠腎小管上皮細(xì)胞中Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)情況

2.3各組大鼠腎小管上皮細(xì)胞中Bax及Bcl-2 mRNA表達(dá)情況 與對(duì)照組比較,高糖組大鼠腎小管上皮細(xì)胞中Bax mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯增高(P<0.05),Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.05);姜黃素低、高劑量組大鼠腎小管上皮細(xì)胞中Bax mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯低于高糖組(P均<0.05),Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯高于高糖組(P均<0.05),且姜黃素高劑量組Bax mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于姜黃素低劑量組(P<0.05),Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于姜黃素低劑量組(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 對(duì)照組和高糖環(huán)境下各組大鼠腎小管上皮細(xì)胞中Bax及Bcl-2 mRNA表達(dá)情況

3 討 論

腎小管間質(zhì)占腎臟體積的90%以上,在糖尿病發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中,高血糖水平、TGF-β、糖基化終末產(chǎn)物、ROS等因素均可導(dǎo)致腎小管損傷,損傷的腎小管上皮細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞增殖、凋亡、自噬和內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化[5]。腎小管上皮細(xì)胞損傷后釋放多種炎癥因子和細(xì)胞因子,引起炎性細(xì)胞浸潤(rùn),使細(xì)胞外基質(zhì)沉積,間質(zhì)纖維化,最終導(dǎo)致腎功能的惡化。高血糖狀態(tài)促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞凋亡是腎臟纖維化的主要原因,而進(jìn)行性腎間質(zhì)纖維化是糖尿病腎病的一個(gè)重要特征,也是導(dǎo)致慢性腎病及終末期腎臟病的重要因素[6-8]。新的研究表明,近端腎小管病變可能早于腎小球病發(fā)生,腎小管損傷標(biāo)志物預(yù)測(cè)糖尿病腎病進(jìn)展的價(jià)值優(yōu)于腎小球病理學(xué)指標(biāo)[9]。目前研究認(rèn)為多種細(xì)胞因子及信號(hào)通路參與了高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡的過(guò)程,如PI3K-Akt通路可與p38-MAPK通路共同介導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡,TGF-β、NF-κB、SAPK/JNK、AMPK等均可調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡[10],各種觸發(fā)細(xì)胞凋亡的因素均能觸發(fā)腎小管上皮細(xì)胞凋亡。

姜黃素是從姜黃屬中藥姜黃、郁金、莪術(shù)等的塊莖中提取出來(lái)的一種酚性色素,具有降脂、抗氧化、抗纖維化、抗氧化應(yīng)激、降血糖、保護(hù)血管內(nèi)皮功能等作用,在糖尿病腎病、急性腎損傷、慢性腎衰竭、藥物性腎損害以及難治性狼瘡性腎炎等疾病中均具有腎臟保護(hù)作用,且不良反應(yīng)很小,具有重要的藥用前景,是潛在治療藥物[11-12]。實(shí)驗(yàn)研究顯示,姜黃素可改善糖尿病腎病大鼠的腎小球增大、基底膜節(jié)段性增厚,減輕腎組織氧化應(yīng)激損傷[13];可抑制2型糖尿病大鼠海馬細(xì)胞凋亡,對(duì)抗糖尿病引起的海馬神經(jīng)變性[14];可以通過(guò)下調(diào)Fas、Caspase-3蛋白表達(dá)而抑制心肌梗死大鼠的心肌細(xì)胞凋亡[15],還可以通過(guò)調(diào)控Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)抑制順鉑導(dǎo)致的腎小管上皮細(xì)胞凋亡[16]。在缺血再灌注大鼠動(dòng)物模型中,姜黃素也有抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡的作用[17]。Zhang等[18]報(bào)道,姜黃素可通過(guò)調(diào)節(jié)Beclin1/UVRAG/Bcl2 抑制糖尿病腎病中的足細(xì)胞凋亡,加速細(xì)胞自噬。

本實(shí)驗(yàn)中觀察到高糖處理可引起腎小管上皮細(xì)胞凋亡增加,促凋亡蛋白Bax蛋白及mRNA表達(dá)增加,抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白及mRNA表達(dá)降低,說(shuō)明高糖可以誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡;給予姜黃素干預(yù)后,腎小管上皮細(xì)胞凋亡減少,Bax蛋白及mRNA表達(dá)降低,Bcl-2蛋白及mRNA表達(dá)增加,且高劑量姜黃素作用更明顯,說(shuō)明姜黃素可以抑制高糖環(huán)境下大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡。姜黃素抗凋亡的機(jī)制可能與激活凋亡抑制基因、阻斷細(xì)胞凋亡的執(zhí)行等有關(guān),但腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡的機(jī)制很復(fù)雜,姜黃素可能的作用機(jī)制還需要深入探討。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。