劉 婷，劉平平，胡深德，成瑩瑩，陸 俊

（1.中國檢驗(yàn)認(rèn)證集團(tuán)湖南有限公司，湖南 長沙 410021；2.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410004）

廣金錢草（Desmodium styracifo Lium,(Osb.)Merr）又名假花生、馬蹄金、銅草、落地草，為豆科山螞蟥屬植物。國內(nèi)主要產(chǎn)地為兩廣地區(qū)、福建和湖南等省區(qū)也有較為廣泛的分布，國外東南亞地區(qū)的越南、緬甸、印度等國也有較為普遍的生長[1]，是一種常用的中藥材，全草可供藥用，能清熱利尿、抗炎解毒、抗菌利膽、清除結(jié)石，常用于醫(yī)治尿路感染、黃疸、泌尿系結(jié)石、膽囊結(jié)石等[2-4]，日常作為泡茶使用，廣金錢草中含有多糖成分，可以顯著增強(qiáng)輸尿管上段的腔內(nèi)的壓力，有顯著的利尿作用，廣金錢草中的黃酮能夠明顯增加心肌營養(yǎng)性血流量[5]。

廣金錢草是一種比較傳統(tǒng)的中藥，近年來國內(nèi)外有關(guān)廣金錢草的研究主要集中在指紋圖譜、藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)及其臨床應(yīng)用方面[6-7]。已有研究報(bào)道其含有黃酮類、酚類、萜類、甾醇、苷類等成分[8-10]。但對(duì)于不同極性部位的活性成分及其抗氧化、抑菌活性的研究鮮見報(bào)道。對(duì)廣金錢草進(jìn)行超聲提取和運(yùn)用不同極性溶劑進(jìn)一步萃取，考查其抗氧化和抑菌活性，明確廣金錢草抗氧化活性部位和成分奠定基礎(chǔ)，以期能夠?yàn)閺V金錢草的開發(fā)利用提供更加科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設(shè)備

廣西廣金錢草產(chǎn)自南寧；石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、三氯化鋁、蘆丁、三氯化鐵等碳酸鈉，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；福林酚、沒食子酸，上海源葉生物技術(shù)公司提供；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌菌種，中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

JP-150A-8 型高速多功能粉碎機(jī)，永康市久品工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；JRC-2000 型超聲波清洗機(jī)，濟(jì)寧市潤通超聲電子有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 廣金錢草乙醇提取物的制備

將廣金錢草于50 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，然后用粉碎機(jī)中粉碎，過40 目篩待用。廣金錢草乙醇提取物的制備參考文獻(xiàn)[11]并加以適當(dāng)修改，稱取10 g金錢草細(xì)粉于具塞錐形瓶中，加150 mL 配制好的50%乙醇，等待1 h，置于超聲波清洗機(jī)中，在50 ℃條件下提取45 min，提取液用高速離心機(jī)以轉(zhuǎn)速12 000 r/min 離心10 min，收集上清液，殘?jiān)偌?0%乙醇150 mL 超聲提取45 min 后離心。重復(fù)此步驟3 次，合并3 次離心的上清液備用。

1.2.2 廣金錢草不同極性部位的制備

將超聲提取的廣金錢草溶液，于溫度40 ℃，0.1 MPa下進(jìn)行減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇，然后將濃縮液溶于250 mL 水后依次用250 mL 的石油醚、乙酸乙酯和水飽和正丁醇分步重復(fù)萃取2 次，合并各部位萃取液并于40 ℃，0.1 MPa 條件下進(jìn)行減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，預(yù)凍后放于真空冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行真空冷凍干燥，分別計(jì)算不同極性部位的得率。

1.2.3 廣金錢草總酚含量的測定

按照福林- 酚試劑比色法[12]進(jìn)行多酚含量的測定，具體試驗(yàn)方式如下：分別吸取0.1 mg/mL 沒食子酸溶液0，150，250，500，750，1 000 μL 于5 個(gè)標(biāo)號(hào)的試管中，加蒸餾水至23 mL，每管再加入500 μL 的福林酚試劑和300 μL 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的碳酸鈉溶液反應(yīng)30 min 后，于最高吸收峰波長760 nm 處測定吸光度。多酚含量為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確吸取1 mL 的各待測樣液，進(jìn)行以上相同操作，平行測定3 次，記錄相應(yīng)吸光度，通過標(biāo)曲計(jì)算出樣品中多酚含量（mg GAE/g）。

1.2.4 廣金錢草總黃酮含量的測定

參考Acácio A F Z 等人[13]方法測定廣金錢總黃酮含量，稱取5 mg 兒茶素，加超純水定容至25 mL，配制成質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL 的兒茶素標(biāo)準(zhǔn)液，并將其稀釋為6 個(gè)不同質(zhì)量濃度的兒茶素溶液（準(zhǔn)確吸取0，50，100， 150，200，250 μL 的兒茶素標(biāo)準(zhǔn)液），分置于試管中，加30%乙醇至2 970 μL，然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的亞硝酸鈉溶液120 μL，反應(yīng)5 min 后，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的FeCl3溶液120 μL 放置5 min，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的NaOH 溶液800 μL，搖勻。測定波長510 nm 處吸光值。以吸光度為縱坐標(biāo)，兒茶素含量為橫坐標(biāo)，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。將廣金錢草醇提物用50%乙醇稀釋，配制成一定濃度的待測液，準(zhǔn)確吸取待測液250 μL 于試管中，按上述標(biāo)曲的方法來測定待測液的吸光度，根據(jù)標(biāo)曲計(jì)算得待測液中的黃酮含量（mg CE/g）。

1.2.5 DPPH 自由基清除活性

參考文獻(xiàn)[14]經(jīng)過適當(dāng)修改測定DPPH 自由基清除活性。操作方法如下：用移液槍精密吸取100 μmol/L Trolox 0，50，100，150，200，250，300 μL，加80%甲醇至300 μL，然后加入濃度為0.094 μmol/L的DPPH 溶液1 900 μL ，放置于37 ℃恒溫水浴鍋中等待30 min，測定波長517 nm處的吸光度。以Trolox 含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。按上述方法測定樣品液的吸光度，并根據(jù)標(biāo)曲計(jì)算其抗氧化能力（μmol TE/g）。

1.2.6 ABTS 自由基清除活性

參考文獻(xiàn)[15]測定廣金錢草醇提物ABTS 自由基清除活性。具體方法為：將濃度為7.4 mmol/L 的ABTS 溶液與濃度為2.45 mmol/L 的過硫酸鉀溶液按1∶1 等體積混合，避光、棕色瓶中保存12～16 h 制成ABTS 原液，將ABTS 原液于波長734 nm 處測定吸光度，用無水乙醇不斷減小濃度至其吸光度為0.70±0.02，即可得到現(xiàn)配好的穩(wěn)定的ABTS·+溶液。于試管中吸取4 000 μL 的ABTS·+溶液分別加入1 000 μL的提取液、Trolox 標(biāo)準(zhǔn)液（0，4，8，10， 12，14，16 μmol/L） 并做好標(biāo)記，溶液混合均勻后于波長734 nm 處利用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測定，無水乙醇作為空白對(duì)照。以Trolox 含量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。按上述方法測定樣品液的吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其抗氧化能力（μmol TE/g）。

1.2.7 FRAP 法測定抗氧化活性

參考文獻(xiàn)[16]經(jīng)過適當(dāng)修改進(jìn)行鐵離子還原能力的測定。具體方法為：依次吸取100 μmol/L Trolox（80%甲醇配制） 180，360，450，540，630，720，900 μL，加入2.7 mL 的FRAP 試劑和270 μL 的去離子水，然后放置于37℃恒溫水浴鍋中等待30 min，使用紫外分光光度計(jì)測定波長595 nm 處的吸光度，以蒸餾水作為空白對(duì)照。以Trolox 含量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。按上述方法測定樣品液的吸光值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其抗氧化能力。

1.2.8 抑菌圈直徑的測定

參考文獻(xiàn)[17]的方法將廣金錢草各部位萃取物用無菌蒸餾水和二甲基亞砜（1%） 配制成質(zhì)量濃度為400，200，100 mg/mL 的樣品溶液備用。在超凈工作臺(tái)上，取20 mL 滅菌后的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基倒入經(jīng)過高溫高壓滅菌后的培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基凝成固體后，分別將培養(yǎng)好的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌3 種菌用無菌蒸餾水調(diào)配成含量為1.5×107個(gè)/mL的菌懸液，精確移取菌懸液20 μL 置于平板中涂布均勻，之后用挖孔器挖4 個(gè)孔，于孔中加30 μL 不同濃度樣品液，于溫度37 ℃下培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺精確測量每個(gè)平板的抑菌圈直徑。

1.2.9 最小抑菌濃度（MIC） 的測定

參照文獻(xiàn)[18]的方案經(jīng)修改，采用微量營養(yǎng)肉湯稀釋的方法測定廣金錢草各萃取物最小抑菌濃度。于96 孔板每孔中加80 μL 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，A 行加入質(zhì)量濃度為200 mg/mL 的各待測樣品80 μL，混勻并吸取80 μL 于B 行混勻，重復(fù)此操作至G 行，以此對(duì)待測樣品進(jìn)行2 倍稀釋，留H 行作為對(duì)照組（A～H 行各待測廣金錢草萃取物質(zhì)量濃度按順序?yàn)?00，50，25，12.5，6.25，3.125，1.625，0 mg/mL）。于1～4 列加入金黃色葡萄球菌、5～8 列加入大腸桿菌、9～12 列加入沙門氏菌，3 種菌液各10 μL，于37 ℃下培養(yǎng)22 h 后加6.25 mg/mL 刃天青鈉溶液10 μL，反應(yīng)一段時(shí)間后觀察抑菌效果，以肉眼觀察樣品最低濃度管中無細(xì)菌生長者（未變?yōu)榉奂t色）為該試驗(yàn)樣品的MIC。

1.2.10 數(shù)據(jù)分析

所有的測定都需要做3 次平行，試驗(yàn)的數(shù)據(jù)記錄為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）。然后使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行相關(guān)的統(tǒng)計(jì)及分析，使用Spearman 相關(guān)系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性的檢測，當(dāng)p＞0.05 時(shí)，表示無顯著性差異；p＜0.05 時(shí)，表示有顯著性差異；p＜0.01 時(shí)，表示有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 總酚、黃酮及抗氧化活性的標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1 可知，用于測定多酚的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線、用于測定黃酮的兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線、用于測定抗氧化活性的DPPH、FRAP、ABTS 的Trolox 當(dāng)量標(biāo)準(zhǔn)曲線分別對(duì)應(yīng)圖A、B、C、D、E，其R2的范圍均在在0.999～1.000，線性相關(guān)性良好。

2.2 廣金錢草醇提物及各萃取部位的得率

用石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇對(duì)廣金錢草50%乙醇提取物濃稠浸膏進(jìn)行萃取，冷凍干燥后，稱質(zhì)量并按照公式進(jìn)行計(jì)算，得出個(gè)萃取部位的得率分別為石油醚部位：（16.72±1.01）%、乙酸乙酯部位：（10.98±0.87）%、正丁醇部位：（24.39±1.41）%、水部位：（46.21±3.21）%，其中乙酸乙酯部位得率最低，水部位得率最高，符合一般植物不同極性溶劑萃取特點(diǎn)。

2.3 總酚、黃酮含量及抗氧化活性

廣金錢草不同極性萃取部位的多酚、黃酮含量見圖2。

圖2 廣金錢草不同極性萃取部位的多酚、黃酮含量

結(jié)果表明，廣金錢草醇提物中的總酚含量為（7.074±0.312） mg GAE/g，總黃酮含量為（9.038±0.261） mg/g。經(jīng)石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取后，多酚、黃酮富集后的含量均有顯著性提高，并且含量均為乙酸乙酯部位＞正丁醇部位＞石油醚部位＞水提取部位＞醇提物，特別是乙酸乙酯部位，多酚含量達(dá)到（13.190±0.072） mg CE/g，是醇提物的1.87 倍；黃酮含量達(dá)到了（80.697±0.121） mg CE/g，是醇提物的8.93 倍，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于醇提物中的含量，表明廣金錢草中的活性物質(zhì)主要存在于乙酸乙酯部位中。

廣金錢草不同極性萃取部位的抗氧化活性見圖3。

圖3 廣金錢草不同極性萃取部位的抗氧化活性

DPPH 自由基清除活性在（98.844±1.193）～（121.929±0.556）μmol TE/g。石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位的DPPH 自由基清除活性均有顯著性差異（p＜0.05），而對(duì)于鐵離子還原能力和ABTS 自由基清除活性，石油醚、乙酸乙酯部位和正丁醇部位抗氧化活性無顯著性差異，且這3 個(gè)部位均顯著高于水部位抗氧化活性。鐵離子還原能力在（151.305±1.424） ～（209.066±1.576） μmol TE/g，ABTS 自由基清除能力在（32.455±0.929） ～（74.414±2.029） μmol TE/g。3 種抗氧化活性均呈現(xiàn)出乙酸乙酯部位＞正丁醇部位＞石油醚部位＞水部位的規(guī)律。由此可見，廣金錢草醇提物的乙酸乙酯萃取部位的抗氧化活性效果最好，而剩余水相部位的抗氧化活性最差。可能是乙酸乙酯和正丁醇部位含有較多多酚和黃酮的原因，其作用機(jī)制通過黃酮類、多酚、多糖等多種生物活性成分發(fā)揮出來[19]。廣金錢草總黃酮類活性成分對(duì)黃嘌呤—黃嘌呤氧化酶體系產(chǎn)生的O2-、-OH 有非常好的清除效果，且用量與清除作用呈顯著的正相關(guān)[20]。廣金錢草中的酚酸類成分主要有綠原酸[21]、水楊酸、阿魏酸、升麻酸、香草酸、3,4 - 二甲基苯酚[22]等酚酸類化合物。其黃酮物質(zhì)主要為黃酮碳苷化合物，分別為夏佛塔苷[10]、異牡荊素、木樨草素、異葒草素、文賽寧、6-C- 木糖-8-C- 葡萄糖洋芹素、6-C- 葡萄糖-8-C- 木糖洋芹素、芹菜素[3，10]。

2.4 廣金錢草醇提物不同極性部位抑菌活性

2.4.1 抑菌圈直徑測定結(jié)果

廣金錢草不同極性萃取部位的抑菌圈直徑見表1。

表1 廣金錢草不同極性萃取部位的抑菌圈直徑

當(dāng)廣金錢草萃取物的測試質(zhì)量濃度為100～400 mg/mL 時(shí)，對(duì)沙門氏菌的抑菌圈直徑：乙酸乙酯部位＞正丁醇部位＞石油醚部位＞水部位；對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑：乙酸乙酯部位＞石油醚部位＞正丁醇部位＞水部位，低質(zhì)量濃度的廣金錢草水部位萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌沒有抑菌活性，只有當(dāng)其質(zhì)量濃度為400 mg/mL 時(shí)，廣金錢草水部位萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌才有一定的抑菌活性，廣金錢草石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位萃取物在其質(zhì)量濃度為400 mg/mL 時(shí)，其對(duì)沙門氏菌的抑菌圈直徑依次達(dá)到了14.42，16.32，15.60，14.04 mm，其對(duì)金葡的抑菌圈直徑依次達(dá)到了12.16，13.10，10.16，8.38 mm。由此可見，各萃取部位對(duì)沙門氏菌的抑菌效果最好，而對(duì)大腸桿菌的抑菌效果最差。乙酸乙酯部位和正丁醇部位對(duì)沙門氏菌均有高敏感的抑菌效果，石油醚部位和乙酸乙酯部位對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果較好。綜合來講，廣金錢草萃取物對(duì)沙門氏菌的抑菌效果好于金黃色葡萄球菌的抑菌效果好于大腸桿菌的抑菌效果。

2.4.2 廣金錢草不同極性部位的最低抑菌濃度

廣金錢草不同極性部位對(duì)的最小抑菌濃度見表2。

表2 廣金錢草不同極性部位對(duì)的最小抑菌濃度

由表2 可知，不同極性部位對(duì)其都具有較好的抑菌效果，石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位對(duì)于金黃色葡萄球菌的最小抑菌質(zhì)量濃度分別為6.25，6.25，12.50，25.00 mg/mL；對(duì)于大腸桿菌的最小抑菌質(zhì)量濃度為50，25，50，50 mg/mL；對(duì)于沙門氏菌的最小抑菌質(zhì)量濃度為6.25，6.25，3.13，25.00 mg/mL。由此可知，對(duì)石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位這4 種極性溶劑萃取物最不敏感的菌株是大腸桿菌，而金黃色葡萄球菌和沙門氏菌對(duì)這4 種極性部位的敏感性則較高。具有一定的應(yīng)用潛力。動(dòng)物試驗(yàn)研究[23]表明，復(fù)方廣金錢草顆粒對(duì)變形桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果是最明顯的，MIC 為4.5%（藥物濃度在培養(yǎng)基中的比例）；對(duì)綠膿桿菌和大腸桿菌有一定程度的抑菌效果，MIC 分別為18.0%和9.0%。復(fù)方廣金錢草顆粒對(duì)革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌都有非常明顯的抑制細(xì)菌生長的效果，而且安全劑量的范圍很大。用方金錢草顆粒對(duì)小白鼠進(jìn)行灌喂的急性毒性試驗(yàn)，該試驗(yàn)最后未觀察到比較顯著的毒性反應(yīng)，最大耐受為157.5 g/kg。這些抑菌活性的物質(zhì)基礎(chǔ)則很大可能是由于其含有豐富的多酚類化合物。

3 結(jié)論

主要研究了廣金錢草醇提物及其不同極性萃取部位的抗氧化活性物質(zhì)和抗氧化活性。50%乙醇提取物中的總多酚含量為（7.074±0.312） mg/g，總黃酮含量為（9.038±0.261） mg/g。經(jīng)石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇依次萃取后，萃取部位的多酚、黃酮含量均有顯著性提高，并且含量均為乙酸乙酯部位＞正丁醇部位＞石油醚部位＞水部位＞醇提物，表明廣金錢草中的活性物質(zhì)主要存在于乙酸乙酯部位中。3 種體外抗氧化活性評(píng)價(jià)結(jié)果也以廣金錢草醇提物的乙酸乙酯萃取部位的抗氧化活性效果最好，而剩余水相部位的抗氧化活性最差。廣金錢草不同極性萃取部位的多酚、黃酮含量及抗氧化活性均為乙酸乙酯部位＞正丁醇部位＞石油醚部位＞水部位，在趨勢上呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)性，多酚、黃酮含量越高，抗氧化活性越好。抑菌試驗(yàn)表明，廣金錢草不同極性萃取物的抑菌圈直徑乙酸乙酯部位＞正丁醇部位＞石油醚部位＞水部位，抑菌效果為沙門氏菌＞金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌。綜合來說，乙酸乙酯部位的抑菌效果要好于其他部位，且抑菌效果隨著萃取物濃度的增大而增大。后續(xù)可通過液質(zhì)手段進(jìn)一步對(duì)不同極性部位具體化學(xué)組成成分進(jìn)行鑒定，利用動(dòng)物模型考查其體內(nèi)抗氧化和抑菌活性。