何 莉, 候延寧, 唐玉林, 杜昕穎, 徐翠蓮

(塔里木大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 新疆 阿拉爾 843300)

大豆體細(xì)胞胚胎發(fā)生和器官發(fā)生再生系統(tǒng)于20世紀(jì)80年代初期成功建立,目前雖趨于完善,但相對(duì)于其他作物,大豆組織培養(yǎng)體系中仍然存在再生頻率較低,重復(fù)性差,基因型依賴性強(qiáng)等問(wèn)題。在大豆組織培養(yǎng)的整個(gè)過(guò)程中,從外植體到愈傷組織,再到不定芽分化以及植株再生過(guò)程中,受諸多因素的影響,其中第一因素是內(nèi)部因素,主要包括材料本身基因型的影響,同時(shí)合適的外植體選取同樣也是大豆愈傷組織能否誘導(dǎo)成功的關(guān)鍵;其二是外部因素,即培養(yǎng)基的種類和激素的組合配比以及光照、溫度等培養(yǎng)條件。培養(yǎng)基成分以及激素種類配比選取不同,大豆愈傷組織的誘導(dǎo)以及再生也會(huì)相應(yīng)呈現(xiàn)不同的效果。培養(yǎng)條件對(duì)大豆組織培養(yǎng)的作用也不容忽視。因此,深入探索大豆組培過(guò)程中愈傷組織誘導(dǎo)和不定根芽再分化的影響因素,并積極尋找對(duì)策是大豆組織培養(yǎng)體系得以完善的關(guān)鍵。

1 內(nèi) 因

1.1 材料本身基因型的影響

材料的基因型對(duì)愈傷組織的器官分化有決定性的影響,不同植物之間有明顯差異,比如煙草、胡蘿卜和矮牽牛等植物容易誘導(dǎo)器官的形成。而禾谷類、豆類、棉花等就比較困難。同一種植物不同品種,由于基因型差異,其誘導(dǎo)難易程度以及誘導(dǎo)頻率也不同。程林梅等[1]以8種不同基因型的大豆為試驗(yàn)材料,研究激素濃度對(duì)大豆植株再生體系的影響發(fā)現(xiàn),所有的基因型在合適的培養(yǎng)條件下都可以誘導(dǎo)愈傷組織的生成,但不同的基因型由愈傷組織誘導(dǎo)植株再生頻率有顯著差異。李換麗等[2]探究了品種對(duì)大豆再生體系的影響,選取10個(gè)大豆品種在子葉與胚尖兩種不同的再生體系培養(yǎng),結(jié)果同樣表明,不同品種的大豆在同一再生體系有不同的誘導(dǎo)效果,即同一品種在不同的再生體系表現(xiàn)也不同。

1.2 外植體的影響

除了受基因型影響外,同一品種的不同外植體,其誘導(dǎo)的發(fā)生率也有差異,因此選擇適合的外植體也是組培成功的關(guān)鍵因素。外植體對(duì)再生體系的影響,主要包括外植體本身的種類、外植體的成熟度、大小以及選取季節(jié)等方面。通常,不同種類的植物甚至同一植物的不同外植體對(duì)誘導(dǎo)條件反應(yīng)不同,即有的部位誘導(dǎo)分化的成功率高,有的部位極難脫分化或再分化率很低。雷海英等[3]以晉豆19號(hào)為材料,選取子葉節(jié)、下胚軸、上胚軸、子葉、真葉等5個(gè)部位,旨在探究不同外植體的誘導(dǎo)效果,結(jié)果顯示,下胚軸誘導(dǎo)效果最好,其次依次是上胚軸,子葉節(jié)、子葉和真葉,愈傷組織誘導(dǎo)效果依次遞減,說(shuō)明胚軸是比較適合的外植體。再者,外植體幼嫩程度的不同會(huì)影響外植體的滅菌率、誘導(dǎo)率和褐化率以及后期愈傷組織的生理狀況等。年齡較幼或幼嫩的外植體,污染程度較低,細(xì)胞活力好,易于誘導(dǎo)形成愈傷組織,而且也容易誘導(dǎo)分化成植株[4]。另外,取材季節(jié)、外植體的大小與滅菌效果及存活率存在一定關(guān)聯(lián),在合適時(shí)間如生長(zhǎng)旺季取樣,試驗(yàn)材料的消毒效果、成活率、誘導(dǎo)率及增殖率往往比在生長(zhǎng)末期取樣有顯著提高。過(guò)小的外植體存活率很低,而過(guò)大的則容易污染,兩者均不利于誘導(dǎo)的成功。

2 外 因

2.1 培養(yǎng)基的影響

2.1.1培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)組分的影響

培養(yǎng)基是外植體賴以生存的基質(zhì)。培養(yǎng)基的種類、營(yíng)養(yǎng)組分以及培養(yǎng)基的狀態(tài)等也關(guān)系著組織培養(yǎng)效果的好壞。用于植物細(xì)胞組培的培養(yǎng)基種類較多,其中MS培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)中最常用的培養(yǎng)基,B5培養(yǎng)基是基于大豆根尖細(xì)胞培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基。這兩種培養(yǎng)基在大豆組織培養(yǎng)過(guò)程中較常用。離體培養(yǎng)和正常植株生長(zhǎng)過(guò)程同樣需要齊全的營(yíng)養(yǎng),培養(yǎng)基中的大量元素、微量元素、鐵鹽和有機(jī)物等四大類物質(zhì)會(huì)給外植體提供生長(zhǎng)發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng),如果缺乏某種元素,同樣會(huì)出現(xiàn)缺素癥狀或培養(yǎng)效果差。

培養(yǎng)基的狀態(tài)也對(duì)培養(yǎng)效果產(chǎn)生一定影響。通常,植物細(xì)胞培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)常用液體培養(yǎng)基,而器官的培養(yǎng)絕大部分常用固體培養(yǎng)基。瓊脂作為固體培養(yǎng)基常用的固化劑,其用量對(duì)培養(yǎng)效果也有一定影響,用量大則培養(yǎng)基透性較差,養(yǎng)分和激素的擴(kuò)散速度慢,外植體無(wú)法及時(shí)獲取養(yǎng)分和生理活性物質(zhì)而受到抑制,同時(shí)代謝產(chǎn)生的廢物不能很好地?cái)U(kuò)散。若瓊脂用量過(guò)低,培養(yǎng)基凝固性差,不利于無(wú)菌操作的進(jìn)行,同時(shí)也會(huì)增加培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的濕度而容易產(chǎn)生“玻璃化苗”而導(dǎo)致培養(yǎng)效果不佳[5]。此外,培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)培養(yǎng)基的酸堿度和滲透壓也有較為嚴(yán)格的要求[5]。

2.1.2培養(yǎng)基中激素組合與配比的影響

培養(yǎng)基的組成成分供給植物細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng),而植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(激素)則決定著細(xì)胞發(fā)育的方向。接種的外植體在激素的誘導(dǎo)下形成愈傷組織,是大豆組織培養(yǎng)的第一步,愈傷組織誘導(dǎo)的質(zhì)量對(duì)于大豆植株再生起著關(guān)鍵作用。不同種類的激素組合和配比對(duì)大豆愈傷組織的誘導(dǎo)效果有顯著差異。對(duì)大豆子葉形成愈傷組織的研究結(jié)果表明,所加激素均能誘導(dǎo)形成愈傷組織,但不同激素種類誘導(dǎo)愈傷有差異,以MS添加2 mg/L 2,4-D+1 mg/L KT效果最好[6]。因此,通常情況下,幾乎所有的大豆基因型材料都能誘導(dǎo)出愈傷組織,但是愈傷組織的進(jìn)一步分化存在著一定的困難,在愈傷組織再分化及植株再生過(guò)程中,起決定性作用的依然是生長(zhǎng)素類激素和細(xì)胞分裂素類激素的種類組合及濃度配比。愈傷組織分化根和芽與培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的相對(duì)濃度有關(guān),當(dāng)生長(zhǎng)素/細(xì)胞分裂素比值高時(shí),促進(jìn)根的分化;比值低時(shí)則促進(jìn)芽的分化;而當(dāng)兩者平衡時(shí)則會(huì)一直處于愈傷組織狀態(tài)。因此,探索最適的激素配比是組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。為此,大量研究人員針對(duì)大豆子葉節(jié)[7-10]、葉柄[11]以及胚尖[12-13]再生體系進(jìn)行了探討。其中,劉思言等[9]以吉農(nóng)28、吉農(nóng)27、吉農(nóng)17三個(gè)基因型大豆子葉節(jié)作為外植體進(jìn)行植株再生的研究,結(jié)果表明,適合大豆子葉節(jié)不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基是MS+3 mg/L 6-BA。適合大豆子葉節(jié)不定芽增殖的最佳增殖培養(yǎng)基是MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+31 mg/L GA。郭陽(yáng)鑫等[11]建立了大豆葉柄外植體的離體再生體系,研究結(jié)果表明,葉柄愈傷組織形成的適宜培養(yǎng)基為改良MS+2 mg/L NAA,不定芽分化的適宜培養(yǎng)基為改良MS+2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA,不定根誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為1/2改良MS+0.8 mg/L IBA。胡潤(rùn)芳[12]對(duì)菜用大豆胚尖轉(zhuǎn)化再生體系進(jìn)行了優(yōu)化研究;閆帆等[13]對(duì)大豆胚尖再生體系建立的結(jié)果表明,6-BA對(duì)不定芽再生作用顯著,單獨(dú)使用或配合IBA使用均可獲得較高的再生率。

2.2 培養(yǎng)條件

2.2.1光的影響

在植物組織培養(yǎng)的愈傷組織誘導(dǎo)階段,一般因植物種類不同通常采用全暗、周期性光照、散射性光照3種做法,大豆愈傷組織誘導(dǎo)采用散射性光照比較好;而在器官發(fā)生階段,則一般給予周期性光照比較好。多數(shù)植物最常用的光周期是光照16 h,黑暗8 h。除此之外,光照強(qiáng)度影響外植體細(xì)胞的增殖,組織和器官的分化,因此不同植物對(duì)光照強(qiáng)度也有不同要求。大豆在體細(xì)胞胚胎發(fā)生誘導(dǎo)過(guò)程中對(duì)光照的要求不太嚴(yán)格,可以是黑暗,也可以采用12～24 h光照,光照強(qiáng)度的變化范圍也較寬,在50～6 000 lx之間[14]。

2.2.2溫度的影響

植物離體材料培養(yǎng)的最適溫度為(25±2)℃,而且對(duì)于多數(shù)植物的離體培養(yǎng)通常均采用恒溫培養(yǎng)即可較好地完成不定芽和植株再生等過(guò)程,大豆離體材料培養(yǎng)的溫度控制在25 ℃左右即可。

但也有資料表明,溫度高低對(duì)器官發(fā)生的數(shù)量和質(zhì)量仍有影響。如對(duì)禾本科、蘭科等的喜溫性植物的培養(yǎng)溫度可上調(diào)1～2 ℃,控制在26～28 ℃比較適宜。而對(duì)于十字花科、菊科等喜涼性植物的培養(yǎng)溫度可向下微調(diào),控制在25 ℃以下,20 ℃以上較為適宜。