胡建文,馮群虎,王業(yè)皇,杜光信,柯 可

(深圳市寶安區(qū)中醫(yī)院肛腸科,廣東 深圳 518133)

肛周膿腫是由肛門、直腸組織發(fā)生的化膿性感染所引發(fā)的一種病變,中醫(yī)稱為肛癰,主要表現(xiàn)為肛周疼痛、肛門灼熱、排便疼痛等,發(fā)病率可達30%左右,目前對肛周膿腫的處理原則是及時切開和引流。而30%～70%的肛周膿腫患者會伴發(fā)肛瘺,因此尋找新的治療藥物對于改善患者預(yù)后具有重要意義[1-2]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞缺氧,與腫瘤、血管生成、炎癥反應(yīng)、瘢痕疙瘩、創(chuàng)面修復(fù)等有關(guān)[3]。HIF-1α還具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的作用,可正向調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的轉(zhuǎn)錄表達,而VEGF具有調(diào)節(jié)新血管生成的作用,促進創(chuàng)面愈合[4]。研究顯示,HIF-1α/VEGF信號通路的激活可促進血管生成,通過增加血管生成對糖尿病創(chuàng)面愈合發(fā)揮治療作用[5]。王氏生肌散由石膏、珍珠粉、白及、三七、冰片等組成,對肛周膿腫的治療具有良好的臨床實驗效果,本研究基于HIF-1α/VEGF信號通路分析王氏生肌散治療大鼠肛周膿腫的效果,以探究其具體機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:SD大鼠,雌雄各半,SPF級,8～9周齡,體重251～314 g,購自儀征安立卯生物科技有限公司,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(蘇)2019-0008。大鼠在溫度(22±2)°C、濕度(45～55)%的環(huán)境下飼養(yǎng)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 主要藥物、試劑和儀器:王氏生肌散(石膏25 g,珍珠粉15 g,白及、三七各10 g,冰片2 g,打成粉末)由深圳市寶安區(qū)中醫(yī)院中藥房提供;龍珠軟膏(批號20210619,規(guī)格10 g)購自馬應(yīng)龍藥業(yè)集團股份有限公司;大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)(批號EL-R2856c)、C反應(yīng)蛋白(CRP)(批號EL-R0506c)、血管生成素-2(Ang-2)(批號EL-R1902c)ELISA試劑盒、Trizol試劑(批號EL-K2037)購自襄陽凱得爾森生物科技有限公司;蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(批號C1617R)、PCR試劑(批號HR3605M)、兔抗鼠白細(xì)胞分化抗原34(CD34)(批號AF1387)、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)(批號AF1363)、HIF-1α(批號AF7087)、VEGF(批號AF1309)、β-actin(批號AF6134)抗體購自南京東極生物科技有限公司;RIPA裂解液(批號HB-8037)、羊抗兔二抗(批號HB-1522)購自深圳子科生物科技有限公司。酶標(biāo)儀(型號DNM-9602G)、顯微鏡(型號NIB700)、凝膠成像儀(型號SmartGe 2000)購自武漢成名儀器有限公司;實時熒光定量PCR儀(型號PikoReal1200)購自廣西前沿生物技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 建模、分組及給藥:參照文獻[6]中的方法建立肛周膿腫大鼠模型:戊巴比妥鈉麻醉大鼠,在尾部右側(cè)做直徑約2 cm切口,深至肌層,創(chuàng)面滴加0.5 ml糞便上清液(20 g糞便加10 ml 0.9%氯化鈉溶液離心取上清),用醫(yī)用紗布將創(chuàng)面覆蓋48 h固定,造模成功判定依據(jù)為創(chuàng)面滲出膿性分泌物并伴隨糞臭味。將造模成功大鼠隨機分為模型組、王氏生肌散組、陽性藥物組,每組10只。另取10只健康大鼠作為對照組(只做切口,然后滴加0.5 ml 0.9%氯化鈉溶液)。

王氏生肌散組大鼠使用王氏生肌散涂抹創(chuàng)面,厚度約1 mm[7];陽性藥物組大鼠使用龍珠軟膏涂抹創(chuàng)面,厚度約1 mm[7];均為每天換藥1次;對照組和模型組大鼠不給予藥物處理;模型組、王氏生肌散組、陽性藥物組大鼠在每次換藥前30 min用0.5 ml糞便上清液滴加創(chuàng)面(模擬肛周膿腫每日的糞便污染),對照組大鼠每次換藥前30 min用0.5 ml 0.9%氯化鈉溶液滴加創(chuàng)面,連續(xù)給藥14 d。

1.2.2 創(chuàng)面愈合情況檢測:在給藥4、9、14 d后,采用透明膠片法測定創(chuàng)面面積[8],計算創(chuàng)面愈合率(創(chuàng)面愈合率越高表示愈合情況越好),創(chuàng)面愈合率=(建模時面積-檢測面積)/建模時面積×100%。

1.2.3 血清TNF-α、CRP、Ang-2水平檢測:給藥周期結(jié)束后第2天,戊巴比妥鈉麻醉大鼠,尾靜脈采血,分離血清后,采用ELISA法檢測血清TNF-α、CRP、Ang-2水平。

1.2.4 創(chuàng)面組織HE染色:大鼠麻醉后處死,取肛周膿腫創(chuàng)面組織,一部分組織使用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,并切片,HE染色觀察病理變化,另一部分組織-80 ℃冷凍保存。

1.2.5 大鼠新生毛細(xì)血管數(shù)、成纖維細(xì)胞數(shù)檢測:取大鼠創(chuàng)面組織石蠟切片,采用免疫組化檢測創(chuàng)面組織CD34、PCNA表達,CD34為創(chuàng)面肉芽組織中毛細(xì)血管標(biāo)記,PCNA為成纖維細(xì)胞的標(biāo)記,陽性表達為黃色顆粒,顯微鏡觀察陽性表達情況,并隨機選擇3個視野,計算平均數(shù)。

1.2.6 實時熒光定量PCR法檢測創(chuàng)面組織HIF-1α、VEGF信使RNA(mRNA)表達:取-80 ℃冷凍保存的大鼠部分創(chuàng)面組織,研磨后,使用Trizol試劑提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,采用PCR試劑檢測HIF-1α、VEGF mRNA表達水平,引物序列見表1。引物由西安中團生物科技有限公司設(shè)計合成。反應(yīng)體系(25 μl):cDNA 2 μl、PCR試劑3 μl、正反向引物各1 μl、ddH2O 18 μl。反應(yīng)條件:PCR預(yù)變性95 ℃ 300 s,95 ℃變性13 s,60 ℃退火21 s,72 ℃延伸23 s,以β-actin作為內(nèi)參照,采用2-ΔΔCt法分析HIF-1α、VEGF mRNA相對表達水平。

表1 基因引物序列

1.2.7 蛋白印跡法檢測創(chuàng)面組織HIF-1α、VEGF蛋白表達:取-80 ℃冷凍保存的大鼠創(chuàng)面組織,解凍后勻漿加入RIPA裂解液,離心提取上清液,定量蛋白濃度,電泳并轉(zhuǎn)膜,封閉后,加入兔抗鼠HIF-1α(1∶790)、VEGF(1∶760)、β-actin(1∶1400)一抗稀釋液,37 ℃孵育12 h,再加入羊抗兔二抗稀釋液(1∶1900),室溫孵育2 h,顯色后β-actin作為內(nèi)參,使用凝膠成像儀分析蛋白表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較行SNK-q檢驗;P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組肛周膿腫大鼠創(chuàng)面愈合率比較 在給藥4、9、14 d后,與對照組比較,模型組大鼠創(chuàng)面愈合率顯著降低(P<0.05);與模型組比較,王氏生肌散組、陽性藥物組大鼠創(chuàng)面愈合率顯著升高(P<0.05);王氏生肌散組和陽性藥物組大鼠創(chuàng)面愈合率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組肛周膿腫大鼠創(chuàng)面愈合率比較

2.2 各組肛周膿腫大鼠血清TNF-α、CRP、Ang-2水平比較 與對照組比較,模型組大鼠血清TNF-α、CRP水平顯著升高,Ang-2水平顯著降低(P<0.05);與模型組比較,王氏生肌散組、陽性藥物組大鼠血清TNF-α、CRP水平顯著降低,Ang-2水平顯著升高(P<0.05);王氏生肌散組和陽性藥物組大鼠血清TNF-α、CRP、Ang-2水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組肛周膿腫大鼠血清TNF-α、CRP、Ang-2水平比較

2.3 各組肛周膿腫大鼠創(chuàng)面組織病理變化比較 HE染色顯示,對照組大鼠創(chuàng)面組織有大量新生毛細(xì)血管和成纖維細(xì)胞,有肉芽形成,無炎性細(xì)胞浸潤;模型組大鼠創(chuàng)面組織炎癥細(xì)胞浸潤明顯,可見少量顆粒肉芽、成纖維細(xì)胞;王氏生肌散組、陽性藥物組大鼠創(chuàng)面組織病理變化較模型組大鼠明顯減輕,炎性細(xì)胞浸潤減少,表皮層增厚,有大量肉芽、成纖維細(xì)胞、新生毛細(xì)血管形成。見圖1。

圖1 各組肛周膿腫大鼠創(chuàng)面組織病理變化比較(HE染色,×200)

2.4 各組肛周膿腫大鼠新生毛細(xì)血管數(shù)、成纖維細(xì)胞數(shù)比較 與對照組比較,模型組大鼠新生毛細(xì)血管數(shù)、成纖維細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.05);與模型組比較,王氏生肌散組、陽性藥物組大鼠新生毛細(xì)血管數(shù)、成纖維細(xì)胞數(shù)顯著升高(P<0.05);王氏生肌散組和陽性藥物組大鼠新生毛細(xì)血管數(shù)、成纖維細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2、3(表4)。

圖2 各組肛周膿腫大鼠創(chuàng)面組織CD34表達(免疫組化染色,×200)

表4 各組肛周膿腫大鼠新生毛細(xì)血管數(shù)、成纖維細(xì)胞數(shù)比較(個)

2.5 各組肛周膿腫大鼠創(chuàng)面組織HIF-1α、VEGF mRNA表達比較 與對照組比較,模型組大鼠創(chuàng)面組織HIF-1α、VEGF mRNA表達水平顯著降低(P<0.05);模型組比較,王氏生肌散組、陽性藥物組大鼠創(chuàng)面組織HIF-1α、VEGF mRNA表達水平顯著升高(P<0.05);王氏生肌散組和陽性藥物組大鼠創(chuàng)面組織HIF-1α、VEGF mRNA表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 各組肛周膿腫大鼠創(chuàng)面組織HIF-1α、VEGF mRNA表達比較

2.6 各組肛周膿腫大鼠創(chuàng)面組織HIF-1α、VEGF蛋白表達比較 與對照組比較,模型組大鼠創(chuàng)面組織HIF-1α、VEGF蛋白表達水平顯著降低(P<0.05);與模型組比較,王氏生肌散組、陽性藥物組大鼠創(chuàng)面組織HIF-1α、VEGF蛋白表達水平顯著升高(P<0.05);王氏生肌散組和陽性藥物組大鼠創(chuàng)面組織HIF-1α、VEGF蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

圖4 各組大鼠創(chuàng)面組織HIF-1α、VEGF蛋白印跡圖

3 討 論

肛周膿腫發(fā)病的高峰年齡通常在20～40歲,由于肛門位置的特殊,易受大便污染,會存在復(fù)發(fā)、創(chuàng)面愈合慢等問題[9-10]。創(chuàng)面愈合是一個復(fù)雜的過程,與肉芽組織生長、成纖維細(xì)胞數(shù)量和血管新生有關(guān),成纖維細(xì)胞數(shù)量增多可加快創(chuàng)面愈合,血管可促進創(chuàng)面血運重建和組織修復(fù)。王氏生肌散由多味中藥組成,在臨床上對肛周膿腫具有一定的治療作用,本研究使用王氏生肌散給予肛周膿腫大鼠治療14 d后,結(jié)果顯示,大鼠創(chuàng)面組織病理變化明顯減輕,炎性細(xì)胞浸潤減少,表皮層增厚,有大量肉芽、成纖維細(xì)胞、新生毛細(xì)血管形成,創(chuàng)面愈合率、新生毛細(xì)血管數(shù)、成纖維細(xì)胞數(shù)顯著升高,提示王氏生肌散可促進肛周膿腫大鼠創(chuàng)面愈合。龍珠軟膏為治療痔瘡的常用藥,對肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面愈合具有一定療效[11]。本研究發(fā)現(xiàn)王氏生肌散作用與龍珠軟膏類似,分析其可能的原因為,王氏生肌散以石膏、珍珠粉作為君藥,石膏具有斂瘡、止血的功效,能夠促進組織的修復(fù)與再生,珍珠粉可減少創(chuàng)面滲出物,具有良好抗炎、抗菌、生肌作用[12-13]。白及為臣藥,具有抗菌、收斂止血、消腫生肌的功效,三七、冰片為佐使,具有清熱抗炎、抑菌鎮(zhèn)痛之功效,全方配伍起到解毒生肌、消炎斂瘡的功效,促進創(chuàng)面愈合[14-15]。

創(chuàng)面愈合初期為炎癥期,肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面由于細(xì)菌感染,有大量炎癥因子釋放。研究顯示,肛周膿腫創(chuàng)面感染大鼠血清CRP、白細(xì)胞介素17(IL-17)等炎癥因子水平顯著升高[16]。炎癥反應(yīng)可引起組織損傷,導(dǎo)致傷口難以愈合或產(chǎn)生疤痕,TNF-α、CRP為臨床常見炎癥因子,TNF-α在損傷組織中升高,可誘導(dǎo)IL-1β、IL-6等因子的釋放,加重組織的損傷,不利于創(chuàng)面愈合[17]。Ang-2與新生血管生成有關(guān),其水平越高可使得新生血管生成速率加快[18]。本研究顯示,使用王氏生肌散治療的肛周膿腫大鼠血清TNF-α、CRP水平顯著降低,Ang-2水平顯著升高,表明王氏生肌散可顯著抑制肛周膿腫大鼠炎癥因子的釋放,促進新血管生成,加速創(chuàng)面愈合。

HIF-1α是缺氧狀態(tài)下激活的轉(zhuǎn)錄因子,活化HIF-1α可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖,促進創(chuàng)口愈合,HIF-1α還可調(diào)節(jié)VEGF的轉(zhuǎn)錄,促進新生血管生成。研究顯示,激活HIF-1α/VEGF信號通路,可使得糖尿病足潰瘍大鼠創(chuàng)面愈合加快[19]。另有研究顯示[20],黃連皂苷Ⅵ上調(diào)HIF-1α/VEGF通路可加快人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管生成,并有效增強再生組織中的血管形成,促進體內(nèi)傷口愈合。以上研究顯示,HIF-1α/VEGF信號通路的激活在創(chuàng)口愈合中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示,使用王氏生肌散治療肛周膿腫大鼠后,大鼠創(chuàng)面組織HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白表達水平顯著升高,提示王氏生肌散可激活HIF-1α/VEGF信號通路,抑制炎癥反應(yīng),促進血管生成進而加快肛周膿腫大鼠創(chuàng)面愈合,與于澤洋等[19]研究結(jié)果一致。

綜上所述,王氏生肌散可能通過激活HIF-1α/VEGF信號通路抑制炎癥反應(yīng),促進血管生成,加快肛周膿腫大鼠創(chuàng)面愈合。