任彥煒，李琦一，何 冰，李昊逾，趙 麗，李玉艷*

（1中國藥科大學(xué)藥物化學(xué)系，南京 211198；2中國藥科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床藥學(xué)學(xué)院，南京 211198）

自組裝是單體在無干預(yù)的情況下，從游離的、無規(guī)律分布的狀態(tài)，借助分子間的非共價(jià)相互作用（如范德華力、靜電力、疏水作用力、氫鍵和π-π堆積），自發(fā)形成具有特定結(jié)構(gòu)的有序狀態(tài)的過程［1］。自組裝在自然界中普遍存在，細(xì)胞是一個(gè)經(jīng)由自組裝形成的聚集體［2-3］，通過自組裝，磷脂分子形成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)［4］，組蛋白和DNA 組成核小體［5］，肌動(dòng)蛋白和微管蛋白構(gòu)成了細(xì)胞骨架［6］。從這些復(fù)雜生物結(jié)構(gòu)的形成中汲取靈感，巧妙設(shè)計(jì)的小分子化合物經(jīng)由自組裝形成超分子納米結(jié)構(gòu)，在腫瘤治療和成像、免疫分析、藥物遞送等領(lǐng)域顯示出了巨大的應(yīng)用前景，成為生物與藥學(xué)發(fā)展的一個(gè)全新領(lǐng)域［7-9］。

近年來，采用酶促自組裝（enzyme-instructed self-assembly，EISA）策略，在特異性酶的催化下，小分子化合物在腫瘤中形成超分子納米結(jié)構(gòu)的研究取得了重要進(jìn)展［10］。細(xì)胞中的許多生物過程往往需要多種蛋白的參與，而酶是促進(jìn)生物大分子形成、相互作用和發(fā)揮生物學(xué)功能的強(qiáng)大生物催化劑，具有高催化效率和底物專一的特性［11］。相關(guān)的酶，如堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、去乙?；负屠野彼崦敢驯蛔C實(shí)與腫瘤的生長代謝存在密切聯(lián)系。小分子化合物生物相容性好，對(duì)腫瘤的穿透性強(qiáng)，可以抵達(dá)病灶的內(nèi)部。但是，存在缺乏靶向性導(dǎo)致不良反應(yīng)較大，在腫瘤細(xì)胞的積聚能力較弱，停留時(shí)間短等問題［12］。借助腫瘤細(xì)胞上活性異?；蜻^表達(dá)的酶，促進(jìn)小分子化合物原位聚集，生成大分子的納米結(jié)構(gòu)，既實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤的靶向、蓄積和滯留，又降低了對(duì)正常組織潛在的副作用［13］。

EISA 在腫瘤的治療和分子成像等領(lǐng)域存在巨大的研究和臨床價(jià)值［14-15］。從ALP開始，多種酶已經(jīng)被證實(shí)能夠激活小分子進(jìn)行自組裝，它們的催化活性各異，有著不同的底物結(jié)構(gòu)特征，拓寬了EISA的應(yīng)用范圍。在腫瘤的治療方面，EISA已經(jīng)進(jìn)入亞細(xì)胞單位，實(shí)現(xiàn)了小分子化合物對(duì)細(xì)胞器的靶向自組裝，誘發(fā)腫瘤細(xì)胞器功能性障礙，從而達(dá)到治療癌癥的目的［16］。在腫瘤的成像方面，EISA 可以極大程度地增強(qiáng)成像信號(hào)，幫助分子探針區(qū)分正常組織與病灶［13］。因此，本文對(duì)應(yīng)用于EISA 的多種酶進(jìn)行介紹，闡述了細(xì)胞器靶向治療癌癥的EISA策略，并介紹了EISA在腫瘤成像中的應(yīng)用（圖1）。

圖1 酶促自組裝（EISA）在腫瘤治療和成像中的應(yīng)用

1 催化原位自組裝的特異性酶

EISA 采用具有適度水溶性的小分子化合物，在到達(dá)腫瘤部位后，經(jīng)腫瘤細(xì)胞高表達(dá)的酶識(shí)別，催化小分子轉(zhuǎn)化為親脂親水兩親性分子，從而改變分子間的非共價(jià)相互作用，激發(fā)自組裝過程形成納米結(jié)構(gòu)［17-18］。多肽片段易于合成，是體內(nèi)酶或反應(yīng)的天然底物，并且可以提供有效的分子間非共價(jià)相互作用，如Phe-Phe 的疏水作用力和π-π堆積。根據(jù)酶的特異性和底物結(jié)構(gòu)特征，可以開發(fā)出具有不同靶向性和功能性的EISA 小分子，實(shí)現(xiàn)研究的多樣性。

自從2004 年，Yang 等［19］首次報(bào)道了ALP 觸發(fā)小分子化合物組裝成納米結(jié)構(gòu)后，多種酶被報(bào)道在EISA 的研究中表現(xiàn)出較好的自組裝驅(qū)動(dòng)能力，實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤的靶向。

1.1 堿性磷酸酶

作為多肽折疊和蛋白質(zhì)活性的常用調(diào)節(jié)開關(guān)，磷酸化與去磷酸化已被用來控制超分子納米結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)換［10］。ALP 在HeLa、HepG2、Saos-2 等腫瘤細(xì)胞上過表達(dá)，可以水解小分子結(jié)構(gòu)中的磷酸基團(tuán)，完成去磷酸化，具有廣泛的底物譜和高效的催化能力，在EISA中得到廣泛應(yīng)用［17］。

磷酸化位點(diǎn)影響ALP 的水解活性，Chen 等［20］探討了不同的磷酸化位點(diǎn)對(duì)酶促功能的影響。雖然化合物Nap-pYYYH（1，圖2）、Nap-YpYYH（2）和Nap-YYpYH（3）具有相同的去磷酸化產(chǎn)物Nap-YYYH（4），但是去磷酸化速率有著明顯差異?；衔? 位于C-端的磷酸酪氨酸是去磷酸化的優(yōu)勢位點(diǎn)，最大轉(zhuǎn)化率達(dá)到了每小時(shí)54.1%，相較于化合物1（每小時(shí)18.1%）和化合物2（每小時(shí)34.2%），更易于被ALP 脫除磷酸后自組裝形成納米結(jié)構(gòu)。同時(shí)，圓二色光譜（circular dichroism, CD）和透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy,TEM）圖像顯示，去磷酸化后，化合物3形成了由β-折疊構(gòu)成的6 nm 纖維結(jié)構(gòu)，CD 峰強(qiáng)度和最小峰位移說明化合物3 納米結(jié)構(gòu)的性質(zhì)要優(yōu)于化合物1和化合物2，表現(xiàn)出更強(qiáng)的自組裝能力。

圖2 ALP酶促自組裝的底物結(jié)構(gòu)

除了小分子直接作為自組裝的模塊，ALP 也可以催化納米結(jié)構(gòu)的去磷酸化，調(diào)節(jié)其自組裝形成更復(fù)雜的納米結(jié)構(gòu)。He等［21］設(shè)計(jì)合成了含有4-硝基-2，1，3-苯并■二唑（4-nitro-2，1，3-benzoxadiazole，NBD）熒光基團(tuán)的化合物NBD-1p（5，圖2），它在超過臨界聚集濃度（critical aggregation concentration，CAC）時(shí)自組裝形成納米顆粒。激光掃描共聚焦熒光顯微鏡（confocal laser scanning microscopy，CLSM）和TEM 圖像顯示，磷酸化納米顆?？梢砸鸺?xì)胞膜上紅色熒光蛋白標(biāo)記的組織非特異性堿性磷酸酶（red fluorescent protein-tagged tissuenonspecific alkaline phosphatase，TNAP-RFP）聚集，之后在細(xì)胞內(nèi)吞的過程中持續(xù)發(fā)生去磷酸化，完成從納米顆粒到納米纖維的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致內(nèi)涵體膜結(jié)構(gòu)被破壞，最終發(fā)生內(nèi)涵體逃逸。

盡管對(duì)ALP 的底物研究主要集中在含有磷酸酪氨酸的小分子上，但是磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸的潛在應(yīng)用也不可忽視［17］。Zhou等［22］將底物研究轉(zhuǎn)向了攜帶磷酸絲氨酸的小分子化合物L(fēng)-pS（6，圖2），TEM 圖像顯示，其可以在ALP的催化下形成直徑約為24 nm的納米纖維。

1.2 去乙?；?/h3>

蛋白質(zhì)中賴氨酸殘基可以發(fā)生多種翻譯后修飾，包括琥珀酰化、乙?；图谆?，而賴氨酸在蛋白質(zhì)折疊過程中十分重要，所以賴氨酸的修飾會(huì)影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能［23］。去乙?；福╯irtuin）家族對(duì)多種蛋白均具有一定的去乙?；芰?，共包含7種亞型（SIRT1-SIRT7），它們在細(xì)胞內(nèi)的分布、功能和酶活等方面存在一定差異。其中SIRT5是一種線粒體酶，參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞代謝途徑，具有高效的去琥珀?；钚裕?4］。SIRT5是一個(gè)潛在的靶標(biāo)，有研究報(bào)道其在某些腫瘤，如非小細(xì)胞肺癌、三陰性乳腺癌、結(jié)直腸癌中過表達(dá)，并且可以改變正常酶和蛋白的功能，促進(jìn)癌細(xì)胞，如骨肉瘤細(xì)胞、結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長與增殖［25-26］。

Yang 等［23］設(shè)計(jì)了一類新型的小分子化合物NBD-FFFGKsuccG（7，攜帶熒光基團(tuán)NBD，圖3）和Fmoc-FFFGKsuccG（8，無熒光基團(tuán)NBD，圖3），賴氨酸的琥珀?；黾恿嘶衔镒陨淼乃苄?。當(dāng)SIRT5 催化裂解化合物7 中的琥珀酰化基團(tuán)時(shí)，分子疏水性的增加誘發(fā)體外和活細(xì)胞中自組裝形成納米纖維結(jié)構(gòu)。納米結(jié)構(gòu)的生成使得分子聚集并停留在腫瘤部位，顯著增強(qiáng)了NBD 的熒光強(qiáng)度。通過這種方法，首次實(shí)現(xiàn)了針對(duì)活細(xì)胞中SIRT5活性的熒光成像。此外，還發(fā)現(xiàn)SIRT5 介導(dǎo)的EISA可以實(shí)現(xiàn)線粒體膜電位的去極化并促進(jìn)ROS 的形成，致使線粒體功能紊亂。將化合物8 與3 種不同的化療藥物（二氯乙酸鹽、順鉑和紫杉醇）聯(lián)用，可顯著增強(qiáng)這些藥物的抗癌活性。

圖3 SIRT5酶促自組裝的底物結(jié)構(gòu)

1.3 酪氨酸酶

酪氨酸酶是一種含銅氧化酶，可以使單酚（酪氨酸）氧化生成鄰二酚（多巴），后者可進(jìn)一步氧化生成多巴醌，這是黑色素的前體，廣泛存在于動(dòng)植物中［27-28］。除了催化游離的酪氨酸，酪氨酸酶也可以氧化蛋白質(zhì)中的酪氨酸殘基［29］。酪氨酸酶在黑色素瘤細(xì)胞中過表達(dá)，過度的催化氧化是黑色素瘤產(chǎn)生的重要誘因之一［28］。

依據(jù)酪氨酸酶催化的底物結(jié)構(gòu)，Sun等［30］設(shè)計(jì)并合成了三肽化合物Phe-Phe-Tyr（9，圖4）。在酪氨酸酶的催化下，化合物9 首先被氧化成黑色素樣的二聚體，進(jìn)一步自組裝形成納米顆粒。這些納米顆?？梢砸种萍?xì)胞內(nèi)微管蛋白的組裝，干擾細(xì)胞骨架的形成，誘發(fā)嚴(yán)重的G2/M 期阻滯。除此之外，隨著化合物9 的作用，在黑色素瘤細(xì)胞中引起嚴(yán)重的線粒體功能紊亂。小鼠體內(nèi)研究表明，經(jīng)過化合物9 瘤周注射治療后，耐藥黑色素瘤的腫瘤體積比對(duì)照組減少了87.4%。在抗黑色素瘤藥物的研發(fā)中，EISA 策略給藥物研究一種新的啟發(fā)。

圖4 酪氨酸酶催化底物氧化生成二聚體的結(jié)構(gòu)和反應(yīng)示意圖

1.4 γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶

γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-glutamyl transpeptidase，GGT）是一種細(xì)胞膜結(jié)合酶，可以催化γ-谷氨?；牧呀猓?1］。GGT 在體內(nèi)谷胱甘肽（glutathione，GSH）的代謝和穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用，可以利用胞外GSH，為腫瘤細(xì)胞快速的生長分裂提供充足的半胱氨酸，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移［32］。GGT 在多種腫瘤細(xì)胞，如肝癌、宮頸癌、乳腺癌和卵巢癌中均過表達(dá)［33-34］。

Ye 等［35］開發(fā)了一種基于GGT 響應(yīng)的新型18F標(biāo)記的自組裝探針18F-1G（10，圖5），可以用于腫瘤的正電子發(fā)射斷層掃描（positron emission tomography， PET）成像。探針10 被腫瘤細(xì)胞膜上標(biāo)志物GGT 特異性切割掉N-端半胱氨酸上連接的γ-谷氨?；瑢?shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的靶向攝取。同時(shí)胞內(nèi)過量的GSH 又可以破壞N-端半胱氨酸上的二硫鍵，分子間的氨基硫醇基團(tuán)和氰基發(fā)生高效的點(diǎn)擊縮合反應(yīng)形成二聚體，最終由于π-π堆積作用形成直徑約為142 nm 的納米顆粒滯留在腫瘤細(xì)胞中。研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)GGT 的腫瘤細(xì)胞（HCT119）對(duì)探針10 的攝取是正常細(xì)胞（L929）的4 倍，而較高的靶向攝取和蓄積實(shí)現(xiàn)了PET信號(hào)的增強(qiáng)。

圖5 GGT與谷胱甘肽參與的點(diǎn)擊縮合反應(yīng)示意圖

1.5 胱天蛋白酶3

胱天蛋白酶（caspase）家族被發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞凋亡進(jìn)程的啟動(dòng)和執(zhí)行密切相關(guān)，caspase-3 是細(xì)胞凋亡執(zhí)行酶（executioner caspases）的一種。通過特異性地切割天冬氨酸和半胱氨酸之間的肽鍵，破壞不同結(jié)構(gòu)和功能的蛋白質(zhì)而導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的細(xì)胞凋亡［36］。利用caspase-3 特異性水解肽鍵的能力，開發(fā)出靶向caspase-3 的EISA 探針實(shí)現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞凋亡成像。

Wang等［37］設(shè)計(jì)合成了光聲（photoacoustic，PA）成像探針1-RGD（11，圖6），分子結(jié)構(gòu)中包含一個(gè)2-氰基-6-羥基喹啉（2-cyano-6-hydroxyquinoline，CHQ），一個(gè)D 型半胱氨酸（D-Cys），一個(gè)可被caspase-3 識(shí)別和裂解的多肽序列（DEVD），一個(gè)可供GSH還原的二硫鍵，一個(gè)近紅外熒光基團(tuán)（ICG），以及一個(gè)靶向整合素αVβ3的配體RGD 序列。通過整合素靶向進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，探針11 經(jīng)過Caspase-3的水解和GSH 的還原產(chǎn)生了游離的氨基硫醇基團(tuán)，再與同分子CHQ 基團(tuán)的氰基發(fā)生分子內(nèi)點(diǎn)擊縮合反應(yīng)最終形成環(huán)狀分子。分子間疏水作用和π-π堆積作用的加強(qiáng)誘發(fā)自組裝形成納米顆粒，而顆粒中高密度的ICG 由于聚集熒光淬滅（aggregation-caused quenching，ACQ）效應(yīng)，不得不增強(qiáng)非輻射弛豫過程，這樣就可以檢測到更加清晰的PA 信號(hào)。由此，探針11 能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)腫瘤中凋亡細(xì)胞的PA成像，可用于實(shí)時(shí)評(píng)估體內(nèi)腫瘤的治療效果。

圖6 Caspase-3和谷胱甘肽（GSH）參與的點(diǎn)擊縮合反應(yīng)

在EISA 中使用的酶種還包括弗林蛋白酶［38］，胰蛋白酶-1［39］等，而且越來越多的課題組正嘗試將更多的酶應(yīng)用于EISA，未來的EISA 將迎來“百花齊放”的研究熱潮。

2 細(xì)胞器靶向EISA在腫瘤治療中的研究進(jìn)展

細(xì)胞器在細(xì)胞的各項(xiàng)生命活動(dòng)中起主導(dǎo)作用，靶向性破壞腫瘤細(xì)胞器的功能，可以提高對(duì)腫瘤尤其是耐藥腫瘤的治療效果［40］。將EISA 技術(shù)與細(xì)胞器靶向結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)小分子化合物在腫瘤細(xì)胞器中的定點(diǎn)蓄積，提高治療的選擇性。目前，研究較多的靶向腫瘤細(xì)胞器的EISA 策略主要有兩種［14］：（1）給予小分子化合物以靶向細(xì)胞器的官能團(tuán)；（2）選擇細(xì)胞器上過表達(dá)的酶設(shè)計(jì)EISA小分子化合物。

2.1 線粒體靶向

三苯基膦（triphenylphosphinium，TPP）陽離子可以在較高的線粒體膜電位驅(qū)動(dòng)下，實(shí)現(xiàn)線粒體積累，是一種靶向線粒體的功能基團(tuán)［41］。Wang等［42］將TPP 連接在含有磷酸酪氨酸的四肽衍生物上，開發(fā)出了具有靶向Saos-2細(xì)胞線粒體功能的化合物1P（12，圖7）?；衔?2 在Saos-2 細(xì)胞膜上過表達(dá)的ALP 作用下去磷酸化，納米結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)化，內(nèi)吞進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，借助NBD 基團(tuán)，在CLSM圖像中觀察到線粒體處存在強(qiáng)綠色熒光。隨后線粒體功能紊亂，向細(xì)胞質(zhì)中釋放出大量細(xì)胞色素c，激活caspase介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路，最終導(dǎo)致Saos-2細(xì)胞的死亡。研究發(fā)現(xiàn)，缺乏TPP 的對(duì)照化合物由于沒有線粒體靶向能力，對(duì)Saos-2細(xì)胞幾乎沒有任何殺傷作用。

圖7 線粒體靶向的化合物結(jié)構(gòu)

腸激酶（enterokinase，ENTK）存在于HeLa 細(xì)胞線粒體［43］，可以特異性地識(shí)別DDDDK 短肽序列，并將切下序列的羧基端。He 等［43］設(shè)計(jì)合成了化合物D-2TˉFLAG（13，圖7），結(jié)構(gòu)中含有脂溶性的萘環(huán)和苯丙氨酸，親水性的DDDDK 短肽序列，并通過一個(gè)甘氨酸連接，分子的兩親性可以使其自組裝形成膠束?；衔?3（200 μmol/L）與HeLa細(xì)胞共孵育2 和24 h 后的TEM 圖像顯示，線粒體分別被納米顆粒和納米纖維包圍。另外，形成的膠束可以包被抗腫瘤藥物（如多柔比星），增強(qiáng)對(duì)HeLa細(xì)胞的殺傷作用。

2.2 高爾基體靶向

破壞細(xì)胞高爾基體的功能將嚴(yán)重影響蛋白質(zhì)的合成，翻譯后修飾和運(yùn)輸。Tan 等［44］設(shè)計(jì)了一個(gè)含有磷酸半胱胺的探針pS1（14，圖8），與O-磷酸鍵相比，S-磷酸鍵是更好的ALP 底物，具有更高效的去磷酸化效率。經(jīng)過EISA 與二聚體化（dimerization）形成納米纖維，最后被高爾基體中富半胱氨酸的蛋白（cysteine rich proteins，CRPs）以二硫鍵捕獲。將10 μmol/L 的探針14 與HeLa 細(xì)胞共孵育8 min，在高爾基體處觀察到NBD 基團(tuán)明顯的強(qiáng)綠色熒光，表明該探針對(duì)HeLa 細(xì)胞具有良好的瞬時(shí)靶向性。

圖8 高爾基體靶向的化合物結(jié)構(gòu)

盡管HepG2 細(xì)胞也過表達(dá)ALP，但是胞內(nèi)過量的GSH 會(huì)干擾高爾基體中CRPs 的捕獲。Tan等［45］對(duì)探針14 進(jìn)行了優(yōu)化，用乙酰基替代磷酸基團(tuán)，構(gòu)成了硫代乙酸酯，得到探針15。通過高爾基體相關(guān)的硫酯酶（Golgi apparatus-associated thioesterases）對(duì)硫代乙酸酯的水解，在高爾基體原位形成與探針14 相同的半胱胺產(chǎn)物，可以降低胞內(nèi)過量GSH 帶來的干擾。相似的反應(yīng)過程確保了探針15（圖8）對(duì)高爾基體的瞬時(shí)靶向能力，與HeLa 細(xì)胞共孵育4 min，就可以很容易地將高爾基體區(qū)分出來。雖然兩種探針都是以二硫鍵與CRPs 接合，但是探針15 卻可以靶向更多細(xì)胞系（如HepG2，HEK293 等）的高爾基體，實(shí)現(xiàn)熒光成像，這可能與硫酯酶普遍存在于大多數(shù)細(xì)胞系有關(guān)。機(jī)制研究顯示，探針14 和15 主要通過擾亂內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的蛋白質(zhì)運(yùn)輸而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

2.3 細(xì)胞核靶向

細(xì)胞核是重要的細(xì)胞器，許多化療藥物的作用靶點(diǎn)位于細(xì)胞核，如喜樹堿類抗腫瘤藥物的靶標(biāo)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ。由于進(jìn)入細(xì)胞核的藥量少，削弱了其抗腫瘤活性［46］。因此，靶向細(xì)胞核增加藥物的蓄積量，有著增加抗腫瘤活性的潛力［47］。

Liu 等［48-49］報(bào)道了第1 例核靶向的EISA 分子，并在隨后的研究中將其應(yīng)用在骨肉瘤細(xì)胞（SJSA-1，Saos-2）中。探針16（圖9）包含1 個(gè)N-端的熒光基團(tuán)NBD，1個(gè)C-端的磷酸酪氨酸，4個(gè)亮氨酸作為自組裝片段。探針16首先由細(xì)胞膜上和細(xì)胞內(nèi)的ALP 切除磷酸基團(tuán)，觸發(fā)自組裝形成納米帶，積聚在細(xì)胞核，尤其是核仁中。納米帶擾亂肌動(dòng)蛋白和微管蛋白的動(dòng)力學(xué)平衡，破壞了細(xì)胞骨架，細(xì)胞核完整性喪失，核隆起和核起泡導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，探針16 的核靶向機(jī)制為納米帶與組蛋白H4的共組裝。

圖9 細(xì)胞核靶向的化合物結(jié)構(gòu)

Zhan 等［12］報(bào)道了一種含有10-羥基喜樹堿（10-hydroxycamptothecin， HCPT）的化合物HpYss（17，圖9），可以達(dá)到抑制肝腫瘤（HepG2 細(xì)胞）生長和轉(zhuǎn)移的目的?；衔?7 包含3 個(gè)片段，分別是抗癌活性片段HCPT、自組裝片段以及靶向整合素αVβ3的配體RGD 序列，其中自組裝片段與配體序列以二硫鍵連接。通過細(xì)胞膜上過表達(dá)ALP 的去磷酸化，首先自組裝形成納米顆粒，再經(jīng)由αVβ3介導(dǎo)的內(nèi)吞機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞，在胞內(nèi)過量GSH 的氧化還原反應(yīng)下脫去配體序列，進(jìn)一步自組裝形成直徑小于9 nm 的納米纖維，經(jīng)由核孔進(jìn)入細(xì)胞核。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，化合物17 對(duì)實(shí)體瘤有著很強(qiáng)的抑制能力，并且能夠抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。不同于其他細(xì)胞器，細(xì)胞核是腫瘤生長的關(guān)鍵，這一研究表明，EISA 策略使得HCPT 在腫瘤細(xì)胞核內(nèi)蓄積，有望成為更高效的抗腫瘤手段。

2.4 其他細(xì)胞器靶向

溶酶體是細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)降解與循環(huán)的重要細(xì)胞器，其酸性的內(nèi)部環(huán)境為多種水解酶參與內(nèi)吞、自噬和細(xì)胞凋亡等過程提供了支撐［50］。因此，溶酶體是抗腫瘤的重要靶點(diǎn)。Wu等［51］開發(fā)的化合物Py-Yp-Lyso（18，圖10）可以通過ALP 介導(dǎo)的自組裝形成納米纖維，經(jīng)HeLa細(xì)胞攝取后，分子中攜帶的嗎啉環(huán)因易被質(zhì)子化，使得化合物18 形成的納米纖維可以靶向并破壞溶酶體的膜結(jié)構(gòu)，大量溶酶體內(nèi)容物泄漏，最終殺死腫瘤細(xì)胞。Yang等［51］設(shè)計(jì)的化合物Pro-1P-NMe（19，圖10）在被細(xì)胞攝取后，在溶酶體的酸性條件下脫除二甲胺基，所釋放出的磷酸基團(tuán)又被溶酶體內(nèi)酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）降解，啟動(dòng)自組裝形成納米纖維。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)參與生物體脂質(zhì)的合成，大多數(shù)蛋白質(zhì)的折疊和修飾，干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)可能會(huì)引起程序性細(xì)胞死亡［53］。Kim 等［39］開發(fā)出了可以靶向卵巢癌OVSAHO細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的化合物Nap-ffky-GDKKKKDYK（20，圖10），富含賴氨酸的側(cè)鏈?zhǔn)且鹊鞍酌?1（trypsin-1）的良好底物，由于胰蛋白酶-1 過表達(dá)在OVSAHO 細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，所以化合物20 可以在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上原位自組裝，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞。

3 EISA在腫瘤成像中的研究進(jìn)展

由于非侵入性和可視化的特點(diǎn)，分子成像技術(shù)已經(jīng)成為研究生物分子變化過程的通用工具，同時(shí)也是腫瘤早期診斷的重要手段［54］。2021 年11 月，美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)Cytalux（pafolacianine，圖11）作為一種靶向性熒光成像劑，用于術(shù)中卵巢癌病變的可視化檢測。Pafolacianine是一種葉酸類似物，能夠靶向葉酸受體α（folate receptor alpha，F(xiàn)Rα）過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)近紅外熒光成像（near-infrared fluorescence imaging，NIRF）［55］。Pafolacianine 的Ⅲ期研究顯示，卵巢癌術(shù)中成像，33.0%（95%CI，24.3 ～ 42.7；P<0.001）的患者被發(fā)現(xiàn)在未計(jì)劃切除或未發(fā)現(xiàn)異常的組織中存在額外病變，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出10%的閾值，表明其具有良好的術(shù)中惡性腫瘤導(dǎo)航切除能力［56］。2022年12月，F(xiàn)DA又批準(zhǔn)了肺癌作為pafolacianine的新適應(yīng)證。

圖11 分子成像探針結(jié)構(gòu)

近年來，EISA 技術(shù)在分子成像領(lǐng)域的應(yīng)用引起了越來越多的關(guān)注。Wu 等［13］開發(fā)了PA 成像探針I(yè)R775-Phe-Phe-Tyr（H2PO3）-OH（21，圖11），與ALP 孵育3 h，探針21 自組裝形成納米顆粒，在814 nm 處的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度下降為未孵育時(shí)的1/27。小鼠瘤內(nèi)注射探針21 的4 h 后，實(shí)驗(yàn)組的PA 信號(hào)強(qiáng)度為對(duì)照組（提前靜脈注射ALP 抑制劑）的2.3倍。由于納米顆粒的形成，近紅外染料發(fā)生熒光猝滅，實(shí)現(xiàn)了對(duì)ALP 過表達(dá)的HeLa 細(xì)胞PA 成像。相較于單模態(tài)成像，多模態(tài)成像技術(shù)利用兩種或兩種以上成像方式，可以獲取活體目標(biāo)的互補(bǔ)信息，發(fā)揮出多種成像方式的優(yōu)勢［15］。

最近，Ye 課題組發(fā)表了一系列將EISA 應(yīng)用在腫瘤多模態(tài)成像領(lǐng)域的創(chuàng)新性研究工作，為腫瘤的早期診斷帶來了新的思路與方法［57-59］。化合物P-CyFF-Gd（22，圖12）是NIRF 和磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）雙模態(tài)探針，分別以含鹵半花菁和配體DOTA 螯合的金屬Gd 作為NIRF 和MRI 信號(hào)片段，二苯丙氨酸作為自組裝片段，而磷酸基團(tuán)的存在可以實(shí)現(xiàn)NIRF 信號(hào)的猝滅［57］。當(dāng)探針22 在HeLa 細(xì)胞膜上過表達(dá)ALP 的催化下去磷酸化，NIRF信號(hào)從“關(guān)”到“開”，并啟動(dòng)自組裝形成納米顆粒，隨后內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的雙模態(tài)成像。EISA 既能實(shí)現(xiàn)對(duì)NIRF 信號(hào)“關(guān)－開”的狀態(tài)控制，又增大成像探針的信噪比。將配體NODA 與放射性元素68Ga 螯合又構(gòu)成了NIRF和PET雙模態(tài)探針［58］。

圖12 多模態(tài)成像探針結(jié)構(gòu)以及逆電子需求的狄爾斯-阿爾德（IEDDA）反應(yīng)示意圖

隨著逆電子需求的狄爾斯-阿爾德（inverse electron demand Diels-Alder，IEDDA）反應(yīng)在分子成像領(lǐng)域的應(yīng)用［60］，Ye 課題組［59］對(duì)探針22 進(jìn)行了優(yōu)化，在自組裝片段中加入賴氨酸，以結(jié)合反式環(huán)辛烯（trans-cyclooctene，TCO），得到了探針P-FFGd-TCO（23，圖12）。探針23 可以發(fā)生類似的EISA 靶向腫瘤細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)NIRF 和MRI 雙模態(tài)成像。此時(shí)再靜脈注射含PET 信號(hào)片段的化合物Tz-68Ga（24，圖12），可以快速地與納米顆粒表面的TCO 基團(tuán)發(fā)生IEDDA 反應(yīng)（圖12），最終實(shí)現(xiàn)三模態(tài)成像。酶促自組裝相關(guān)分子的理化性質(zhì)詳情見表1。

表1 酶促自組裝相關(guān)分子的理化性質(zhì)總結(jié)

4 總 結(jié)

雖然近幾年來EISA 取得了長足的進(jìn)步，但是仍然有些難題亟待解決。（1）可供選擇的酶種類較少。借助腫瘤中高表達(dá)的酶，小分子化合物可以自組裝形成納米結(jié)構(gòu)，增大在腫瘤中的積累，但是一種酶促策略難以適用于多種腫瘤細(xì)胞，而且正常組織中的酶活性會(huì)干擾小分子的原位自組裝，因此尋找腫瘤，甚至其他疾病特異性的酶將極大促進(jìn)EISA的發(fā)展。（2）給藥劑量大，抗癌效率較低。多數(shù)研究中的給藥劑量仍然處于微摩爾級(jí)別，抗癌效率較低，這與小分子較高的CAC 相關(guān)，未來對(duì)小分子自組裝能力的優(yōu)化，將會(huì)減少帶給人體生命健康造成的隱患。伴隨著對(duì)EISA 的深入研究，其在腫瘤治療和成像方面的前景廣闊。EISA 靶向細(xì)胞器，走進(jìn)亞細(xì)胞單位，對(duì)自組裝實(shí)現(xiàn)精確調(diào)控，引發(fā)細(xì)胞器功能障礙，減少耐藥性的發(fā)生，為腫瘤的治療帶來新的策略。EISA 可以實(shí)現(xiàn)成像信號(hào)“關(guān)－開”的控制，延長成像時(shí)間，為腫瘤的成像提供新的思路。期待EISA技術(shù)能夠?yàn)槟[瘤的診斷和治療發(fā)展帶來更多可能。