安東賢，姚文兵，高向東，田 浤

（中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 江蘇省生物藥物成藥性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 211198）

GLP-1 由小腸L 細(xì)胞分泌產(chǎn)生，經(jīng)GLP-1R 介導(dǎo)，以葡萄糖依賴的方式作用于胰島β 細(xì)胞，促進(jìn)胰島素分泌[1]，刺激β細(xì)胞的增殖和分化，抑制β細(xì)胞的凋亡，從而增加胰島β 細(xì)胞的數(shù)量[2]，抑制胰島α 細(xì)胞分泌胰高血糖素[3]，降低肝臟糖異生[4]和肝臟脂肪貯存量[5]，還能減少腸蠕動(dòng)、抑制胃排空[6]、降低食欲，有助于控制攝食，減輕體重[7]。GIP由小腸K 細(xì)胞合成和分泌，與GIPR 結(jié)合后發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[8]。GIP 既可以在高血糖條件下促進(jìn)胰島素分泌，也可以在低血糖條件下促進(jìn)胰高血糖素分泌，因此可作為雙功能多肽對(duì)血糖水平進(jìn)行調(diào)控，防止血糖過(guò)度波動(dòng)[9]。GIP 還能促進(jìn)糖尿病模型鼠的胰島β 細(xì)胞生長(zhǎng)分化與存活[10]。長(zhǎng)期使用GIP 受體激動(dòng)劑或者過(guò)表達(dá)GIP 的小鼠糖代謝得到改善，且無(wú)體重增加的不良反應(yīng)[11-12]。GLP-1 和GIP 也被稱為腸促胰島素分泌肽，簡(jiǎn)稱腸促肽[13]。目前認(rèn)為，GLP-1 和GIP 這兩種內(nèi)源性多肽發(fā)揮了餐后促胰島素分泌的大部分作用[14]，使得GLP-1R和GIPR成為了治療2型糖尿病的良好靶點(diǎn)。

在目前的糖尿病治療中，腸促肽類(lèi)降糖藥物占據(jù)了重要地位，其中以GLP-1R 激動(dòng)劑為主[15]。由于糖尿病是一種復(fù)雜的綜合代謝性疾病，針對(duì)單一靶點(diǎn)的治療藥物往往具有局限性，而能夠靶向多種靶點(diǎn)以實(shí)現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)的治療藥物不僅能使療效最大化，還能降低不良反應(yīng)[16]。禮來(lái)制藥公司研發(fā)的Tirzepatide(LY3298176)是1 周注射1 次的GLP-1R/GIPR 雙激動(dòng)劑，已經(jīng)獲得FDA 批準(zhǔn)上市，用于治療2 型糖尿病。在與索馬魯肽頭對(duì)頭的臨床試驗(yàn)比較中，高、中、低劑量組Tirzepatide 的降糖效果均優(yōu)于索馬魯肽[17]。在減重方面，高劑量的Tirzepatide 效果優(yōu)于索馬魯肽[18]。然而Tirzepatide和市場(chǎng)上絕大多數(shù)治療2 型糖尿病的受體激動(dòng)劑藥物一樣，通過(guò)皮下注射給藥，降低了患者的依從性[19]。目前，丹麥諾和諾德公司研制的口服索馬魯肽（oral semaglutide，Rybelsus?）是市面上唯一一款可口服的GLP-1R 激動(dòng)劑，但是其在人體內(nèi)的絕對(duì)生物利用度只有1%[20]，因此開(kāi)發(fā)患者依從性較高的口服腸促肽受體激動(dòng)劑具有良好的應(yīng)用前景。

本實(shí)驗(yàn)室前期基于GLP-1R 激動(dòng)劑Exendin-4的結(jié)構(gòu)特征，利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)得到了具有降糖活性的口服GLP-1R 激動(dòng)劑OHP2[21]。與口服索馬魯肽不同，OHP2 無(wú)促吸收劑單獨(dú)給藥即可被口服吸收，在糖尿病小鼠模型中表現(xiàn)出了良好的藥效，如降低血糖、減少體質(zhì)量和緩解高血脂等[22]。本研究為進(jìn)一步優(yōu)化OHP2的治療潛力，在保留了其降糖活性和口服吸收能力的基礎(chǔ)上，引入了GIP的活性位點(diǎn)，以期為臨床提供更多的可口服降糖多肽候選分子。

1 材 料

1.1 試 劑

DMEM 高糖培養(yǎng)基、DMEM/F-12 培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco 公司）；胰蛋白酶、G418（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）；胎牛血清（FBS，美國(guó)CLARK Bioscience 公司）；Exendin-4（上海吉爾生化有限公司）；OHP2（南京金斯瑞生物科技有限公司）；ODA（合肥森爾生物科技有限公司）；異硫氰酸熒光素(異構(gòu)體Ⅰ，F(xiàn)ITC，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；Pierce BCA 法蛋白測(cè)定試劑盒（美國(guó)Thermo Scientific 公司）；牛血清白蛋白（BSA，廣州賽國(guó)生物科技有限責(zé)任公司）；氨芐青霉素、鏈霉素、潮霉素（上海生工生物工程有限公司）；Steady-Glo?Luciferase Assay System（美國(guó)Promega 公司）；RIPA（強(qiáng)）裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。其他試劑均為市售分析純。

1.2 動(dòng) 物

C57BL/6JGpt 雄性小鼠（5 周齡），SPF 級(jí)，購(gòu)自杭州子源實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，合格證號(hào)：SCXK（浙）2019-0004。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合中國(guó)藥科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 細(xì)胞株

CHO-GLP-1R-Luc（A11A）細(xì)胞株、人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞株Caco-2 由中國(guó)藥科大學(xué)江蘇省生物藥物成藥性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.4 儀 器

AccuriC6 Plus 流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司）；Infinite 200Pro多功能熒光酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；ERS-2 細(xì)胞電阻儀（美國(guó)Merck Millipore 公司）；血糖儀（三諾生物傳感股份有限公司）。

2 方 法

2.1 ODA序列設(shè)計(jì)和結(jié)構(gòu)特征

2.1.1 ODA 序列設(shè)計(jì) 基于OHP2 的結(jié)構(gòu)，引入GIP 活性位點(diǎn)，同時(shí)OHP2 耐酶解位點(diǎn)保持穩(wěn)定，得到增強(qiáng)GIP 激動(dòng)活性的ODA 序列（由合肥森爾生物科技合成）。從RCSB PDB 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www. rcsb. org）獲取Exendin-4 和GLP-1 受體胞外結(jié)構(gòu)域的PDB 文件（5OTT）、GIP 和GIP 受體胞外結(jié)構(gòu)域的PDB 文件（2QKH），利用MOE（Molecular Operating Environment）分子操作系統(tǒng)和Rosetta Design 在線設(shè)計(jì)服務(wù)系統(tǒng)（http://rosettadesign.med.unc.edu）進(jìn)行親和力打分計(jì)算。

2.1.2 圓二色光譜（CD）檢測(cè)ODA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)使用去離子水溶解樣品至0.5 mg/mL，用圓二色光譜儀Jasco J-810，在室溫下以1 nm 分辨率，50 nm/min的掃描速度在190 ～ 250 nm 范圍內(nèi)對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。

2.1.3 SWISS-MODEL 模擬ODA 的三級(jí)結(jié)構(gòu) 利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)服務(wù)器SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org）進(jìn)行同源建模，ODA 和OHP2 均以Exendin-4 為模板序列，選擇全球性模型質(zhì)量估測(cè)（GMQE）值最高的建模結(jié)果。

2.2 ODA的入胞能力研究

2.2.1 流式細(xì)胞術(shù)法檢測(cè)ODA 在Caco-2 細(xì)胞中的入胞能力 細(xì)胞鋪板：Caco-2 細(xì)胞密度為每毫升1 × 105個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞給藥：每孔加入FITC 標(biāo)記的ODA 5 μg，孵育2 h。細(xì)胞清洗：獲取細(xì)胞并清洗后用200目細(xì)胞過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)：經(jīng)陰性對(duì)照管確定細(xì)胞群所在位置后，檢測(cè)陰性對(duì)照管的熒光強(qiáng)度，并據(jù)此設(shè)立FITC 陰性門(mén)和FITC陽(yáng)性門(mén)。

2.2.2 熒光酶標(biāo)儀法檢測(cè)ODA 在Caco-2 細(xì)胞中的入胞能力 細(xì)胞培養(yǎng)鋪板和給藥方法同“2.2.1”項(xiàng)。細(xì)胞裂解：每孔加入RIPA 細(xì)胞裂解液30 μL，室溫置于搖板機(jī)上350 r/min 裂解5 min。FITC 標(biāo)記ODA 含量測(cè)定：使用多功能熒光酶標(biāo)儀測(cè)定FITC 標(biāo)記的ODA 熒光強(qiáng)度，條件為激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm。細(xì)胞總蛋白含量測(cè)定：BCA 試劑盒檢測(cè)每孔內(nèi)總蛋白濃度。計(jì)算每孔FITC 標(biāo)記的ODA 的含量與細(xì)胞總蛋白含量的比值。

2.3 ODA的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力研究

2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞鋪板：Caco-2 細(xì)胞密度為每毫升1 × 105個(gè)細(xì)胞，每孔接種單細(xì)胞懸液250 μL于Transwell上室，下室加完全培養(yǎng)基1.5 mL，培養(yǎng)21 d。細(xì)胞給藥：使用細(xì)胞電阻儀測(cè)定細(xì)胞跨膜電阻，選取跨膜電阻在200 ～ 1 000 Ω/cm2的孔[23]，在上室加入FITC 標(biāo)記的ODA（0.2 mg/mL）。孵育8 h，每隔1 小時(shí)從下室取樣100 μL，然后向下室補(bǔ)充HBSS緩沖液100 μL。

2.3.2 跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)量測(cè)定 使用多功能熒光酶標(biāo)儀測(cè)定下室中FITC 標(biāo)記的ODA 熒光強(qiáng)度，檢測(cè)條件為激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm。

2.4 ODA的體外生物活性研究

2.4.1 熒光素酶報(bào)告基因法評(píng)價(jià)ODA 對(duì)GLP-1R的激活能力 細(xì)胞培養(yǎng)：使用含10%胎牛血清、潮霉素B、G418 的DMEM/F12 培養(yǎng)基培養(yǎng)A11A 細(xì)胞。細(xì)胞鋪板：A11A 細(xì)胞密度為每毫升2 × 105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)4 h。細(xì)胞給藥：ODA 初始濃度為4 800nmol/L，按4倍倍比梯度稀釋得到9個(gè)濃度，每孔加入藥物20 μL，孵育4 h。化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度測(cè)定：每孔加入Steady-Glo 100 μL，350 r/min 振蕩15 min。振蕩結(jié)束后每孔吸取樣品180 μL 轉(zhuǎn)移至全白酶標(biāo)板，使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。

2.4.2 分子對(duì)接模擬ODA 與GIPR 結(jié)合能力 靶標(biāo)分子預(yù)處理：從RCSB PDB 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www. rcsb. org）下載GIP 和GIP 受體胞外結(jié)構(gòu)域的PDB文件（2QKH），選擇Quick Prepare 對(duì)分子進(jìn)行加氫去水并賦予電荷，修正PDB 結(jié)構(gòu)缺陷。定義活性位點(diǎn)（site）以確定配體分子結(jié)合部位。配體分子預(yù)處理：通過(guò)MOE 同源建模獲得配體分子的PDB 文件，加氫去水并賦予電荷。分子對(duì)接：選擇蛋白-蛋白對(duì)接以半柔性對(duì)接方法計(jì)算結(jié)果。

2.5 ODA在小鼠體內(nèi)的降糖活性研究

2.5.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取5 周齡的C57BL/6J 雄性小鼠飼養(yǎng)一個(gè)星期適應(yīng)環(huán)境。正式實(shí)驗(yàn)前小鼠需禁食16 h，并將小鼠隨機(jī)分組并稱重標(biāo)記。

2.5.2 藥物配制 3%碳酸氫鈉溶液，Exendin-4溶液（0.02 mg/mL），葡萄糖溶液（0.2 g/mL），OHP2溶液（0.424 mg/mL），ODA 溶液（0.848 mg/mL，0.424 mg/mL，0.212 mg/mL）。

2.5.3 給藥測(cè)定 陽(yáng)性對(duì)照組皮下注射給藥Exendin-4 溶液（0.10 mg/kg），實(shí)驗(yàn)組OHP2 溶液（0.424 mg/mL）和ODA 溶液（0.848 mg/mL，0.424mg/mL，0.212 mg/mL）用3% NaHCO3溶液稀釋4 倍，口服灌胃給藥。每組小鼠給藥時(shí)刻記為-30 min，0 min 時(shí)按2 g/kg 的劑量給每組小鼠腹腔注射葡萄糖溶液，用血糖儀測(cè)量小鼠血糖值。

3 結(jié) 果

3.1 ODA序列設(shè)計(jì)和結(jié)構(gòu)特征

基于GLP-1（HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG）、GIP（YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQ） 、 Exendin-4（HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSS -GAPPPS）和OHP2（HGEGTFTSDLSSQMEEEAVKEFIEWLVNGGPSSGAPPPSC）的分子結(jié)構(gòu)，在保留OHP2 良好的抗酶解活性以及口服GLP-1R 激動(dòng)活性的前提下，通過(guò)進(jìn)一步引入GIP 的活性位點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了一條新型口服降糖多肽——ODA。通過(guò)Rosetta Design 評(píng)估其對(duì)GLP-1 和GIP 兩個(gè)受體的親和力，親和力強(qiáng)度與打分絕對(duì)值呈正相關(guān)。打分結(jié)果顯示，與OHP2 相比，ODA 保留了GLP 結(jié)合能力，同時(shí)提高了GIP受體親和力。（表1）。

為了得到ODA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息，本實(shí)驗(yàn)對(duì)ODA 的CD 譜進(jìn)行分析。如圖1-A 所示，與Exendin-4 和OHP2 的譜線相似，ODA 的譜線在193 nm附近處出現(xiàn)明顯的正峰，在208 nm 和222 nm 處出現(xiàn)2 個(gè)負(fù)峰，表明這3 種分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)以α 螺旋為主。此外，ODA 的譜線向短波長(zhǎng)方向移動(dòng)，即發(fā)生藍(lán)移，表明ODA 的疏水性增加，親水性降低。提示ODA 有較好的親脂性，能夠較容易地與細(xì)胞膜產(chǎn)生接觸。

Table 1 Affinity values of ODA and related peptides for GLP-1R and GIPR

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)SWISS-MODEL 模擬預(yù)測(cè)ODA 的三級(jí)結(jié)構(gòu)，由于序列的同源相似性，ODA 和OHP2的三級(jí)結(jié)構(gòu)模擬均以Exendin-4 為模板序列。Exendin-4，OHP2 和ODA 的GMQE 分別為0.71，0.73 和0.68。如圖1-B 所示，ODA 的三級(jí)結(jié)構(gòu)在突變位點(diǎn)處與Exendin-4，OHP2均有一定差異。

Figure 1 Determination of Exendin-4, OHP2 and ODA

3.2 ODA的胞吞能力優(yōu)于OHP2

為了評(píng)價(jià)ODA 的胞吞能力，對(duì)ODA 進(jìn)行了流式細(xì)胞術(shù)和熒光酶標(biāo)儀法分析。如圖2-A 所示，與陰性對(duì)照Exendin-4 相比，ODA 組的FITC+細(xì)胞率顯著提高（P< 0.01）。熒光酶標(biāo)儀結(jié)果顯示，孵育2 h 后每毫克細(xì)胞總蛋白中FITC 標(biāo)記的ODA 含量（5 055.0 ± 1 299.1 ng/mg)顯著高于OHP2 組（2 836.4 ± 471.1 ng/mg)（P< 0.01）（圖2-B）。這些結(jié)果表明，在Caco-2 細(xì)胞中，ODA 比OHP2 的入胞能力更強(qiáng)。

3.3 ODA的轉(zhuǎn)胞吞能力優(yōu)于OHP2

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Transwell法考察ODA在單層細(xì)胞模型上的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)水平。結(jié)果如圖3-A所示，在1、2、3、4和8 h的5個(gè)采樣點(diǎn)，ODA組在下室中的濃度明顯高于Exendin-4 組和OHP2 組。孵育8 h 后，下室中ODA 的質(zhì)量濃度為（96.7 ± 6.3 ng/mL），顯著高于Exendin-4 組（53.6 ± 2.5 ng/mL）（P< 0.0001）和OHP2組（76.6 ± 4.3 ng/mL）（P< 0.01）（圖3-B）。這些結(jié)果顯示，在Caco-2 細(xì)胞的Transwell 單層細(xì)胞模型中，ODA具有更強(qiáng)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力。

Figure 2 Endocytosis of Exendin-4, OHP2 and ODA in Caco-2 cells

Figure 3 Transcytosis of Exendin-4, OHP2 and ODA in Caco-2 cells (± s, n = 3)

3.4 ODA保留了GLP-1R激動(dòng)活性并可結(jié)合GIPR

本實(shí)驗(yàn)采用熒光素酶報(bào)告基因法評(píng)估了ODA對(duì)GLP-1R 的激活能力，結(jié)果如圖4-A 所示，Exendin-4、OHP2 和ODA 均呈劑量依賴性地激活GLP-1R下游信號(hào)通路，促進(jìn)了熒光素酶的表達(dá)。OHP2和ODA 激活GLP-1R 的EC50分別為4.540 和5.506 nmol/L，雖然ODA 的EC50比OHP2 略高，但和其處在同一數(shù)量級(jí)上，表明ODA 保留了對(duì)GLP-1R的激動(dòng)活性。利用MOE 將ODA 與GIPR 胞外結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分子對(duì)接模擬，預(yù)測(cè)ODA 與GIPR 的結(jié)合模式與相互作用。結(jié)果如圖4-B 所示，GIPR 分子表面以親水親脂性展示，ODA 序列中的15Asp,16Lys,19Gln,20Lys,24Gln,26Leu 與GIPR 形成了較強(qiáng)的氫鍵，穩(wěn)定了ODA 與GIPR 的結(jié)合，提示ODA 具有潛在的GIPR激動(dòng)能力。

3.5 ODA在小鼠體內(nèi)的降糖活性優(yōu)異

選取健康C57BL/6J 小鼠，通過(guò)腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn)（IPGTT）考察口服不同劑量ODA 對(duì)血糖的控制作用，以皮下注射Exendin-4 組為陽(yáng)性對(duì)照，ODA 單次口服給藥的糖耐量試驗(yàn)結(jié)果如圖5-A所示，與PBS 組相比，口服高、中、低劑量的ODA后，小鼠血糖值相對(duì)于基礎(chǔ)值的偏移顯著降低，血糖時(shí)間曲線中峰值明顯變低，曲線下面積顯著減小。各組血糖時(shí)間曲線下面積計(jì)算結(jié)果顯示，高劑量組（922.6 ± 93.7 mmol/L·min）、中劑量組（1 021.9 ± 84.8 mmol/L·min）和低劑量組（1 035.1 ± 152.0 mmol/L·min）的 AUC 同樣顯著低于PBS 組（1 322.3 ± 99.5 mmol/L·min）（P<0.000 1）（圖5-B）。另一方面，口服ODA 高、中、低劑量組與口服OHP2 組（952.1 ± 81.5 mmol/L·min）相比，曲線下面積無(wú)顯著性差異。這些結(jié)果表明，口服低劑量ODA（0.53 mg/kg）能達(dá)到與口服OHP2（1.06 mg/kg）相當(dāng)?shù)慕堤撬剑崾綩DA 具有較好的血糖控制能力。

Figure 4 ODA binding ability to GLP-1R and GIPR in vitro

Figure 5 IPGTT of ODA in healthy mice (± s, n = 8)

4 討 論

口服索馬魯肽是目前市場(chǎng)上唯一一款可口服的GLP-1R 激動(dòng)劑，依賴促吸收劑N-[8-（2-羥基苯甲?；?氨基]辛酸鈉（SNAC）才能實(shí)現(xiàn)口服吸收。SNAC 可在胃部升高局部區(qū)域的pH，通過(guò)短期局部緩沖作用保護(hù)索馬魯肽防止胃蛋白酶的降解[24]。同時(shí)SNAC 具有親脂性，能夠有效地插入到上皮細(xì)胞膜中，輕微改變細(xì)胞膜的流動(dòng)性，促進(jìn)索馬魯肽的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)[25]。因此SNAC 只能短暫地促進(jìn)吸收，口服索馬魯肽的絕對(duì)生物利用度依然較低，僅有0.4% ～ 1%[26]。本實(shí)驗(yàn)室前期工作中設(shè)計(jì)得到的OHP2 與之相比更有優(yōu)勢(shì)，單獨(dú)給藥即有1.31%的絕對(duì)生物利用度，并且結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，無(wú)非天然氨基酸引入和側(cè)鏈脂肪酸修飾等[22]。

綜合代謝性疾病如肥胖和糖尿病等通常具有異質(zhì)性和并發(fā)性等特點(diǎn)，單一靶點(diǎn)藥物治療有一定局限性[27]。因此本研究利用RCSB PDB 蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，MOE 和Rosetta Design 軟件在OHP2 的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上引入了GIP的活性位點(diǎn)，得到新型口服降糖多肽ODA。通過(guò)CD 光譜和SWISS-MODEL 研究了ODA 的分子結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)ODA 與Exendin-4 和OHP2相比，其親水性降低，親脂性增加，三級(jí)結(jié)構(gòu)也有一定差異。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和熒光酶標(biāo)儀研究ODA 的入胞能力，雖然ODA 入胞的陽(yáng)性細(xì)胞率小于OHP2組，但是入胞量即每毫克總蛋白中的ODA含量卻幾乎是OHP2 的兩倍，結(jié)果表明ODA 的胞吞作用更強(qiáng)。并且通過(guò)Caco-2 細(xì)胞構(gòu)建Transwell單層細(xì)胞腸道吸收模型研究ODA 的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)能力，與入胞能力研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，ODA 的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)量顯著高于Exendin-4 組和OHP2 組。這些結(jié)果表明ODA 的口服吸收能力顯著優(yōu)于OHP2。利用基于A11A 細(xì)胞的熒光素酶報(bào)告基因法研究ODA 對(duì)GLP-1R 的激動(dòng)活性，雖然ODA 的EC50比OHP2 略高，但仍處于同一數(shù)量級(jí)，表明ODA 較好地保留了對(duì)GLP-1R 的激活能力。利用MOE 進(jìn)行了ODA 與GIPR 的分子對(duì)接，模擬了二者結(jié)合的空間狀態(tài)和相互作用，ODA 序列中多個(gè)氨基酸位點(diǎn)與GIPR 形成了較強(qiáng)的氫鍵，表明ODA 能與GIPR結(jié)合且較為穩(wěn)定。通過(guò)IPGTT 實(shí)驗(yàn)研究ODA 在健康小鼠體內(nèi)的血糖控制能力，結(jié)果表明，口服低劑量ODA 即可發(fā)揮優(yōu)異的降糖活性，展現(xiàn)出口服ODA治療2型糖尿病的巨大潛力。

綜上所述，本研究設(shè)計(jì)得到的口服ODA 保留了OHP2 對(duì)GLP-1R 的激活能力，增強(qiáng)了與GIPR 的結(jié)合能力，從而服用小劑量ODA 即可達(dá)到降糖療效。此外，簡(jiǎn)單的分子結(jié)構(gòu)不僅更易于工業(yè)化生產(chǎn)，還能避免過(guò)度修飾帶來(lái)的生物安全隱患。未來(lái)，口服ODA 將為糖尿病患者提供更安全、更便利、更有效的用藥選擇。