汪 恒，孫 浩，廖 紅

（中國藥科大學(xué)新藥篩選中心 江蘇省藥效研究與評價服務(wù)中心，南京 210009）

缺血性腦卒中（ischemia）是全球范圍內(nèi)致殘率和致死率最高的疾病之一[1]。在缺血性腦卒中發(fā)生后，由于氧氣和血液的供給受阻，會造成腦組織的梗死，同時，也會造成梗死周圍（半暗帶）以及遠(yuǎn)離梗死區(qū)域神經(jīng)元的延遲死亡和神經(jīng)連接的受損[2]，最終導(dǎo)致機(jī)體的運(yùn)動感覺和認(rèn)知功能障礙。當(dāng)前最為有效的救治措施是在缺血后的一定時間窗內(nèi)，對患者進(jìn)行靜脈注射重組人組織型纖溶酶原激活物（rt-PA）溶栓以及血管內(nèi)介入取栓治療，盡快恢復(fù)其腦血流[3]。然而，依然有大量的患者無法在最佳的時間窗內(nèi)接受到溶栓或取栓治療，出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)損傷和功能障礙。因此，如何減少缺血造成的神經(jīng)損傷并促進(jìn)患者的神經(jīng)功能康復(fù)成為一個亟需解決的問題。

眾所周知，小膠質(zhì)細(xì)胞作為大腦內(nèi)駐留的免疫細(xì)胞，在腦實(shí)質(zhì)中發(fā)揮免疫監(jiān)視作用[4]。在發(fā)育階段，小膠質(zhì)細(xì)胞可以對多余突觸進(jìn)行修剪，確保有效神經(jīng)環(huán)路的建立[5-6]。成年后，腦實(shí)質(zhì)的小膠質(zhì)細(xì)胞起著“清道夫”的作用，時刻監(jiān)視腦內(nèi)環(huán)境的變化，一旦出現(xiàn)病原體、異常蛋白（Aβ斑塊、α-突觸核蛋白、TDP43 等）、細(xì)胞碎片等，小膠質(zhì)細(xì)胞會被激活并遷移到損傷處，發(fā)揮吞噬作用[7-9]。缺血腦卒中后，梗死中心以及半暗帶會出現(xiàn)大量的神經(jīng)元死亡，小膠質(zhì)細(xì)胞可以通過吞噬作用清除死亡細(xì)胞的碎片，有益于減少神經(jīng)炎癥。同時，小膠質(zhì)細(xì)胞也可以吞噬那些應(yīng)激性的神經(jīng)元和突觸，導(dǎo)致更多的神經(jīng)元死亡和突觸丟失，因此，如果能減少小膠質(zhì)細(xì)胞對可應(yīng)激神經(jīng)元和突觸的吞噬，就可以減輕腦缺血造成的功能障礙，并促進(jìn)腦缺血后的功能康復(fù)。所以小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬功能在缺血性腦卒中后所發(fā)揮的作用及機(jī)制非常復(fù)雜，可能與缺血的時相和所處的大腦環(huán)境密切相關(guān)。如果能夠闡明小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬作用的機(jī)制，找到關(guān)鍵的靶標(biāo)，對今后研發(fā)治療缺血性腦卒中的神經(jīng)保護(hù)藥物具有重要的意義。本文將首先簡述小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬作用的一般機(jī)制，其次綜述缺血性腦卒中與小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬作用之間關(guān)系的研究進(jìn)展，最后，簡述針對小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬作用進(jìn)行的藥物研發(fā)。總之，期望通過該綜述為缺血性卒中的治療和康復(fù)提供新的思路。

1 小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬識別信號

小膠質(zhì)細(xì)胞是大腦內(nèi)的吞噬細(xì)胞，它可通過其突起不斷監(jiān)視附近區(qū)域的腦實(shí)質(zhì)，當(dāng)腦內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變，如出現(xiàn)病原物、細(xì)胞碎片或應(yīng)激神經(jīng)元等，它們就會釋放出某種Find-me 信號，這些信號將吸引小膠質(zhì)細(xì)胞靠近，同時，遷移到損傷處小膠質(zhì)細(xì)胞通過表面相應(yīng)的受體與細(xì)胞碎片、神經(jīng)元等表面暴露出的Eat-me 或Don’t eat-me 信號結(jié)合，如果與Eat-me 信號結(jié)合將引發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬作用，而與Don’t eat-me 信號結(jié)合則發(fā)揮抑制吞噬活性的作用（圖1）?？傊現(xiàn)ind-me、Eat-me 和 Don’t eat-me 信號三者共同影響了小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬活性，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)復(fù)雜的生理或病理過程。

圖1 參與小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬作用的相關(guān)信號分子示意圖

1.1 Find-me信號

小膠質(zhì)細(xì)胞要發(fā)揮吞噬作用，首先需要靠近被吞噬的對象，這就需要Find-me 信號的參與。目前研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ind-me 信號有核苷酸、趨化因子CX3CL1（Fractalkine)和1-磷酸鞘氨醇（S1P)等，這些物質(zhì)分別作用于小膠質(zhì)細(xì)胞上的腺苷（或嘌呤）受體、CX3CR1 受體和S1P2 受體，吸引小膠質(zhì)細(xì)胞的接近。神經(jīng)元在受到損傷或應(yīng)激后，會釋放核苷酸，如三磷酸腺苷（ATP)、二磷酸腺苷（ADP)或三磷酸尿苷（UTP)這些物質(zhì)，它們可以作為Find-me信號引導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞向這些神經(jīng)元所在的位置移動[10]。Puigdellivol 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，將β 淀粉樣蛋白注射進(jìn)入大腦中后，會引發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)元的吞噬，而敲除小膠質(zhì)細(xì)胞上的嘌呤受體P2Y6后，被吞噬的神經(jīng)元數(shù)量顯著減少。同時，在體外神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，作者發(fā)現(xiàn)敲除小膠質(zhì)細(xì)胞的P2Y6受體可以顯著減少由β淀粉樣蛋白和UTP 所引起的神經(jīng)元丟失。說明受到β 淀粉樣蛋白刺激的神經(jīng)元可以釋放出UTP，激活了小膠質(zhì)細(xì)胞上的P2Y6 受體，從而誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)元的吞噬作用。同時，嘌呤核苷酸作為Find-me 信號在神經(jīng)發(fā)育過程中也發(fā)揮重要作用。在小鼠發(fā)育階段，神經(jīng)元可以釋放嘌呤核苷酸激活小膠質(zhì)細(xì)胞上的嘌呤受體P2Y12，使得小膠質(zhì)細(xì)胞能夠快速感知神經(jīng)元的活性并向神經(jīng)元移動，參與對視覺皮層神經(jīng)環(huán)路的突觸修剪[12]。Diaz-Aparicio等[13]報道，嘌呤受體P2Y12在小鼠成年后也發(fā)揮重要作用。在成年階段小鼠的海馬當(dāng)中，P2Y12受體介導(dǎo)了小膠質(zhì)細(xì)胞對凋亡細(xì)胞以及細(xì)胞碎片的吞噬作用，這可能有利于海馬中的神經(jīng)發(fā)生。

趨化因子CX3CL1 是另外一種Find-me 信號[14]。CX3CL1-CX3CR1信號軸是神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞之間crosstalk 的一條重要信號通路，參與了包括神經(jīng)元遷移和小膠質(zhì)細(xì)胞趨化等過程[15-16]。Paolicelli 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)發(fā)育過程中對小鼠進(jìn)行感覺剝奪后，神經(jīng)元的CX3CL1 表達(dá)增加，同時小膠質(zhì)細(xì)胞對感覺皮層的突觸吞噬作用增強(qiáng)。而基因敲除CX3CL1后，小鼠的突觸修剪功能出現(xiàn)缺陷，導(dǎo)致海馬腦區(qū)突觸過多以及神經(jīng)環(huán)路功能異常。這說明CX3CL1-CX3CR1 信號所介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬作用是突觸修剪所必需的。S1P 也是可能的Find-me 信號之一[14]。在小鼠缺血性卒中模型中，S1P 吸引小膠質(zhì)細(xì)胞向凋亡神經(jīng)元靠近，阻斷S1P2 受體可以阻止小膠質(zhì)細(xì)胞的招募和激活，不利于對損傷后產(chǎn)生的凋亡細(xì)胞及細(xì)胞碎片的清除，加大了小鼠的腦梗死體積[18]?？傊現(xiàn)indme信號的釋放和識別是小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮吞噬作用的重要環(huán)節(jié)。

1.2 Eat-me信號

當(dāng)小膠質(zhì)細(xì)胞接受到Find-me 信號后，可以向細(xì)胞碎片等被吞噬物質(zhì)趨化靠近，但小膠質(zhì)細(xì)胞如何精確地識別并吞噬這些物質(zhì)？這就需要Eat-me信號的參與。Eat-me 信號包括了磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）、補(bǔ)體成分C1q 和C3 等。PS 廣泛表達(dá)在真核細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)面，是研究最為廣泛的Eat-me 信號之一[19]。PS 外翻暴露到細(xì)胞膜外側(cè)后，可以直接與小膠質(zhì)細(xì)胞的TIM 受體、BAI1 受體以及Stabilin2 受體結(jié)合，也可以間接地通過MFG-E8、GAS6/Protein s 橋接后分別與小膠質(zhì)細(xì)胞上的VNR 和MerTK 家族受體結(jié)合，使小膠質(zhì)細(xì)胞對PS 標(biāo)記的細(xì)胞或細(xì)胞組分進(jìn)行吞噬清除[20]。雖然外翻的PS 被認(rèn)為是一個細(xì)胞凋亡的標(biāo)志物，但Scott-Hewitt等[21]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)育階段小鼠的海馬和視網(wǎng)膜膝狀體環(huán)路的突觸上都存在PS 的標(biāo)記，并且小膠質(zhì)細(xì)胞對這些PS 標(biāo)記的突觸進(jìn)行了吞噬，說明在發(fā)育階段PS也參與了小膠質(zhì)細(xì)胞對突觸的修剪作用。值得注意的是，當(dāng)神經(jīng)元受到谷氨酸刺激或氧化應(yīng)激后也會出現(xiàn)PS 外翻的現(xiàn)象，繼而被小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬清除，造成損傷后神經(jīng)元的繼發(fā)性死亡[8]。這些研究結(jié)果都提示PS 也可以作為一個挽救缺血后受損神經(jīng)元的重要靶點(diǎn)。

另外，補(bǔ)體系統(tǒng)中的C1q 也是一個重要的Eatme 信號[22]。一方面，C1q 可以與外翻的PS 結(jié)合來加強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞對吞噬信號的識別[23]，另一方面，C1q 可以直接與小膠質(zhì)細(xì)胞表面的補(bǔ)體受體CR3（CD11b）結(jié)合，以誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞對C1q 標(biāo)記的細(xì)胞或突觸進(jìn)行吞噬[24]。研究表明，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，C1q 可以標(biāo)記在突觸上，在發(fā)育階段小膠質(zhì)細(xì)胞通過C1q對多余突觸進(jìn)行修剪，確保正常神經(jīng)環(huán)路的構(gòu)建。而在阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）病理過程中，小膠質(zhì)細(xì)胞通過C1q 對突觸進(jìn)行吞噬，造成突觸的大量丟失，導(dǎo)致AD 模型小鼠的認(rèn)知功能障礙[25-26]。在J20模型小鼠中，C1q的表達(dá)顯著上調(diào)并大量沉積在突觸上，通過與小膠質(zhì)細(xì)胞的補(bǔ)體受體CR3 結(jié)合介導(dǎo)了小膠質(zhì)細(xì)胞對突觸的過度吞噬，導(dǎo)致突觸密度降低[27]。

1.3 Don’t eat-me信號

神經(jīng)系統(tǒng)不僅有Eat-me 信號，也存在Don’t eat-me 信號。有些免疫抑制信號可以作為Don’t eat-me信號對小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，如CD47 和CD22 等[28]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，CD47 主要表達(dá)在神經(jīng)元上，可以作為Don’t eat-me 信號與小膠質(zhì)細(xì)胞上的信號調(diào)節(jié)蛋白α（SIRPα）結(jié)合，介導(dǎo)免疫抑制效應(yīng)，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬活性[29]。而且研究發(fā)現(xiàn)，CD47 在發(fā)育階段的視覺環(huán)路中高表達(dá)，與突觸結(jié)構(gòu)共定位，可以防止小膠質(zhì)細(xì)胞對突觸的過度修剪[30]。另外，Ding等[31]報道，在AD 患者的大腦組織中，小膠質(zhì)細(xì)胞SIRPα 表達(dá)隨著病情的進(jìn)展而降低。在APP/PS1 AD 模型小鼠中敲除小膠質(zhì)細(xì)胞的SIRPα 后，小膠質(zhì)細(xì)胞對突觸的吞噬作用增強(qiáng)，突觸丟失和認(rèn)知功能障礙加劇。

健康神經(jīng)元的表面有唾液酸殘基，整合成糖蛋白和糖脂。細(xì)胞表面的唾液酸通過與小膠質(zhì)細(xì)胞表面的唾液酸結(jié)合性免疫球蛋白樣凝集素（SIGLECs)受體相互作用來抑制吞噬作用[32]。Pluvinage 等[33]研究表明，CD22（SIGLEC2）介導(dǎo)了α-2，6 連接唾液酸的抗吞噬作用。在老年小鼠模型中，阻斷CD22 可顯著提高小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬活性，促進(jìn)髓鞘碎片和Aβ 斑塊的清除。此外，神經(jīng)元表面的唾液酸化可能促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞上的CR3與補(bǔ)體成分C1q和C3b結(jié)合，從而導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)元樹突結(jié)構(gòu)的吞噬[34]。

2 缺血性腦卒中與小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬作用

在缺血損傷發(fā)生后，小膠質(zhì)細(xì)胞作為腦內(nèi)的免疫細(xì)胞被迅速激活、增殖，向損傷區(qū)域遷移，這一過程與Find-me 信號的釋放和識別有關(guān)。當(dāng)小膠質(zhì)細(xì)胞達(dá)到損傷區(qū)域后，可以識別細(xì)胞碎片、應(yīng)激神經(jīng)元、突觸、髓鞘等組分上暴露的Eat-me 信號，開始發(fā)揮吞噬作用（圖2）。但在不同病理階段，介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞對不同組分吞噬的機(jī)制以及所發(fā)揮的作用不盡相同。

2.1 對細(xì)胞碎片的吞噬作用

腦缺血損傷后，細(xì)胞死亡產(chǎn)生的大量細(xì)胞碎片是神經(jīng)炎癥產(chǎn)生的一個重要因素[35]，而小膠質(zhì)細(xì)胞，特別是M2 表型的小膠質(zhì)細(xì)胞在缺血性卒中后能夠通過吞噬作用清除細(xì)胞碎片，從而減輕炎癥[36]，即腦缺血損傷后的早期，小膠質(zhì)細(xì)胞對細(xì)胞碎片的吞噬是非常重要的。如果抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬，則可能會加重神經(jīng)損傷。有研究顯示，在小鼠MCAO（middle cerebral artery occlusion）造模后的3 d 內(nèi)，即缺血損傷的早期，使用P2Y6 受體的抑制劑MRS2578 抑制小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬功能后，腦萎縮和腦水腫體積擴(kuò)大，同時神經(jīng)功能損傷加重[37]。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠腦缺血后，在遠(yuǎn)離梗死核心的海馬DG 區(qū)中，海馬腦區(qū)的炎癥反應(yīng)較高并且神經(jīng)發(fā)生減少，作者認(rèn)為這可能與該區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞對凋亡細(xì)胞的吞噬能力降低有關(guān)[38]。

總之，腦缺血損傷后的早期，缺血腦組織有大量細(xì)胞碎片，具有高吞噬活性的小膠質(zhì)細(xì)胞迅速清除組織細(xì)胞碎片是非常必要的。

2.2 對應(yīng)激神經(jīng)元的吞噬作用

在缺血性腦卒中發(fā)生后，小膠質(zhì)細(xì)胞在缺血核心區(qū)以及周圍大量聚集[39]，吞噬死亡或?yàn)l臨死亡的神經(jīng)元，這在一定程度上有益于減少卒中之后炎癥反應(yīng)，促進(jìn)功能的康復(fù)[7]。然而，缺血受損后依然存活的神經(jīng)元也會釋放出Find-me 信號，表面出現(xiàn)Eat-me 的信號，如：CX3CL1、PS 等，導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞對其進(jìn)行吞噬，造成不必要的神經(jīng)元丟失[8,40-41]。有研究表明，神經(jīng)元應(yīng)激后會呈現(xiàn)類凋亡樣的狀態(tài)，比如出現(xiàn)PS的外翻，介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞對其進(jìn)行吞噬[42]。同時，神經(jīng)元會釋放趨化因子CX3CL1，誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的C3aR 識別神經(jīng)元表面Eat-me 信號，導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞對這些可挽救神經(jīng)元的繼發(fā)性吞噬。而阻斷C3aR 的激活則可以減少神經(jīng)元的死亡[43]。另外，在小鼠全腦缺血后的2 ～ 7 d 內(nèi)，海馬腦區(qū)中神經(jīng)節(jié)苷酯GD3 及其合成酶GD3S 的表達(dá)上調(diào)。GD3 能夠增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬活性，而GD3S-KO 小鼠在全腦缺血后的神經(jīng)元丟失明顯減少[44]。小鼠局灶性腦缺血后，小膠質(zhì)細(xì)胞的兩種吞噬相關(guān)蛋白MerTK 和MFG-E8 的表達(dá)顯著上調(diào)。缺乏這兩種蛋白的小鼠腦缺血后的長期運(yùn)動功能顯著改善，并顯著減輕了由于神經(jīng)元被吞噬而導(dǎo)致的腦萎縮[45]。小膠質(zhì)細(xì)胞P2Y6受體可能也參與了腦缺血后對存活神經(jīng)元的吞噬。有研究表明，在短暫局灶性腦缺血模型中，P2Y6受體基因敲除的小鼠在梗死周圍腦區(qū)沒有明顯的神經(jīng)元丟失[46]。此外，Yang 等[47]研究發(fā)現(xiàn)，存活神經(jīng)元本身也存在保護(hù)機(jī)制來避免小膠質(zhì)細(xì)胞對其進(jìn)行吞噬。在受到缺血損傷后，神經(jīng)元可以通過細(xì)胞外囊泡分泌將microRNA-98 轉(zhuǎn)移到小膠質(zhì)細(xì)胞，過表達(dá)microRNA-98可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞對應(yīng)激但依然存活神經(jīng)元的吞噬作用，減少神經(jīng)元的死亡。

保護(hù)存活的神經(jīng)元免受繼發(fā)性損傷是避免神經(jīng)功能惡化的關(guān)鍵。以上這些研究都表明，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞對應(yīng)激神經(jīng)元的吞噬能有效減少腦缺血后的神經(jīng)元丟失，有益于損傷后的功能康復(fù)。

2.3 對髓鞘的吞噬作用

小膠質(zhì)細(xì)胞對髓鞘碎片的正常吞噬有助于髓鞘的再生和修復(fù)，而髓鞘的過度吞噬則可能加劇脫髓鞘[48-49]。Zhang 等[50]研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠雙側(cè)頸總動脈閉塞/雙側(cè)頸總動脈狹窄（BCCAO/BCAS)慢性腦缺血模型中，存在廣泛的白質(zhì)損傷。此外，腦缺血后少突膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量明顯減少。在缺血后的第14天，大量的小膠質(zhì)細(xì)胞包圍和接觸髓鞘，并出現(xiàn)過度吞噬髓鞘的現(xiàn)象。在缺血后的第28 天，出現(xiàn)了明顯的脫髓鞘現(xiàn)象和大量非磷酸化神經(jīng)細(xì)絲的暴露，以及SMI32/髓鞘堿性蛋白（MBP)免疫熒光比率增加。

相反地，小膠質(zhì)細(xì)胞對髓鞘碎片的吞噬可能有益于髓鞘的再生。在擬人參皂苷-F11（pseudoginsenoside-F11，PF11）對腦缺血模型神經(jīng)保護(hù)作用的研究中，作者發(fā)現(xiàn)PF11 可以促進(jìn)OGD 后小膠質(zhì)細(xì)胞對髓鞘碎片的吞噬作用，同時這種作用能夠被抗CD11b mAb 顯著抑制，說明PF11 主要通過CR3 加速小膠質(zhì)細(xì)胞對髓鞘碎片的清除，對腦缺血后的神經(jīng)功能發(fā)揮保護(hù)作用[51]。另外，Zheng等[52]發(fā)現(xiàn)己酮可可堿可以上調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞MerTK的表達(dá)水平，增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞對髓鞘碎片吞噬能力，有助于減輕腦缺血造成的白質(zhì)損傷。

綜上所述，調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬活性是減輕腦缺血后髓鞘損傷或促進(jìn)髓鞘再生的一個潛在途徑。

2.4 對突觸的吞噬作用

小膠質(zhì)細(xì)胞對于突觸的吞噬作用在發(fā)育階段以及AD、多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）和精神分裂癥等疾病模型中得到了大量的研究，證據(jù)表明小膠質(zhì)細(xì)胞對突觸的吞噬作用參與了發(fā)育階段的突觸修剪，也是上述疾病模型中導(dǎo)致突觸丟失的一個關(guān)鍵因素[10,53]。在缺血性腦卒中后，梗死核心區(qū)以及半暗帶都會出現(xiàn)大量的突觸丟失，這并不僅僅是神經(jīng)元死亡后神經(jīng)元數(shù)量減少造成的，因?yàn)槿毖Ｋ乐車婊钌窠?jīng)元的樹突棘密度也顯著降低[54]，而且在缺血損傷后，梗死周圍區(qū)域神經(jīng)元的電生理出現(xiàn)異常，說明梗死周圍區(qū)域的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接和突觸可塑性受到了損傷[2]。Alawieh 等[55]研究表明，在缺血性卒中的急性期，有大量的補(bǔ)體成分沉積在突觸上，包括C1q 和C3d。利用補(bǔ)體抑制劑B4crry 治療可以顯著減少補(bǔ)體成分C3d在損傷區(qū)周圍的沉積，抑制了小膠質(zhì)細(xì)胞對突觸的吞噬，減少了突觸的丟失，并且改善了卒中后的認(rèn)知功能障礙。另外，Zhang 等[56]的研究結(jié)果顯示，小鼠MCAO 造模后第14 天，小膠質(zhì)細(xì)胞的MEGF-10 和MerTK 表達(dá)顯著升高，并介導(dǎo)了該時期小膠質(zhì)細(xì)胞對突觸的吞噬。特異性敲除小膠質(zhì)細(xì)胞MEGF-10 或MerTK 則可以阻止突觸的丟失，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。

除此以外，在缺血性腦卒中損傷后，神經(jīng)元所處的微環(huán)境類似于發(fā)育階段，在新的突觸發(fā)生之后，要經(jīng)歷修剪精煉才能整合進(jìn)入功能環(huán)路發(fā)揮作用，這對于損傷之后的功能重建是至關(guān)重要的[2]。大量的文獻(xiàn)已經(jīng)證明，發(fā)育階段中小膠質(zhì)細(xì)胞在突觸修剪過程中發(fā)揮主要作用。所以，在缺血性卒中后，小膠質(zhì)細(xì)胞對突觸的吞噬作用是否對神經(jīng)功能網(wǎng)絡(luò)的重建具有積極的意義值得進(jìn)一步研究。

2.5 外周來源的巨噬細(xì)胞在缺血性腦卒中后的吞噬作用

在缺血性腦卒中后，除了大腦內(nèi)駐留的小膠質(zhì)細(xì)胞會被激活，由于缺血損傷造成血腦屏障BBB 的損傷，外周來源的巨噬細(xì)胞也會浸潤到腦實(shí)質(zhì)中，參與到缺血性腦卒中的病理過程中[57]。研究表明，在腦缺血后的急性期，小膠質(zhì)細(xì)胞首先被激活和招募到損傷區(qū)域，是損傷區(qū)域主要的免疫細(xì)胞。缺血損傷后的第2天開始，小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量減少，外周浸潤的單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞的數(shù)量增加，并在缺血損傷后的第3 天達(dá)到高峰。然而，從損傷后的第4 天，單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞數(shù)量開始減少，同時小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量再次增加并維持穩(wěn)定[57]。Ju 等[58]的研究發(fā)現(xiàn)，在缺血性腦卒中的急性期和亞急性期，外周浸潤的單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞可以轉(zhuǎn)化為小膠質(zhì)細(xì)胞樣表型，并且具有更強(qiáng)的吞噬活性。在小鼠pMCAO（permanent middle cerebral artery occlusion）模型中，Zhang 等[59]發(fā)現(xiàn)腦缺血后大腦中巨噬細(xì)胞中的MerTK、CX3CR1 等吞噬相關(guān)受體的基因表達(dá)顯著上調(diào)，同時Iba1（小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞標(biāo)記物）陽性細(xì)胞對死亡神經(jīng)元進(jìn)行吞噬。Cai等[41]的研究表明，STAT6/Arg1 信號軸有利于小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞對缺血后死亡神經(jīng)元的吞噬清除，加快炎癥的消退。

另外，外周浸潤的巨噬細(xì)胞還會對腦內(nèi)駐留的小膠質(zhì)細(xì)胞的激活產(chǎn)生影響，包括小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài)[60]。通過氯膦酸鹽脂質(zhì)體清除巨噬細(xì)胞可以減少腦梗死后皮層和紋狀體中小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。相比于對照組大腦中的小膠質(zhì)細(xì)胞，氯膦酸鹽脂質(zhì)體處理小鼠的大腦具有小的圓形細(xì)胞體和分枝形態(tài)[61]。脾切除術(shù)后，梗死灶小膠質(zhì)細(xì)胞的激活僅限于皮質(zhì)和紋狀體的較小區(qū)域，同時腦組織中活化的小膠質(zhì)細(xì)胞也減少[62]。

值得注意的是，大量缺血性腦卒中的研究對于小膠質(zhì)細(xì)胞和外周來源巨噬細(xì)胞的作用并沒有進(jìn)行區(qū)分，可能的原因是兩種細(xì)胞類型具有高度相似的標(biāo)志物蛋白表達(dá)。雖然在大部分研究中，研究者可以通過小膠質(zhì)細(xì)胞分支狀的形態(tài)特征對小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分，但在腦缺血后的早期小膠質(zhì)細(xì)胞高度激活，利用Iba1 蛋白染色并不能區(qū)分染色陽性細(xì)胞是高度激活的小膠質(zhì)細(xì)胞還是外周浸潤的巨噬細(xì)胞。有研究顯示TMEM119可以作為小膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物與巨噬細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分[63]，但也有其他研究表明TMEM119 在小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)并不穩(wěn)定，并且在外周的濾泡樹突狀細(xì)胞等細(xì)胞類型中也有表達(dá)[64]。因此，在后續(xù)的研究中有必要進(jìn)一步探究TMEM119在腦缺血模型中作為小膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物蛋白的可行性。總之，使用更高特異性的小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物蛋白或利用流式細(xì)胞術(shù)對小膠質(zhì)細(xì)胞和外周來源的巨噬細(xì)胞的吞噬作用進(jìn)行區(qū)分研究是很有必要的。

3 調(diào)節(jié)腦缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬活性的潛在藥物靶點(diǎn)

眾多的研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬作用在多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理過程中都發(fā)揮重要作用，因此，以調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬活性作為靶點(diǎn)的藥物研發(fā)一直是備受關(guān)注的方向。現(xiàn)階段該類藥物的研發(fā)依然處于臨床前實(shí)驗(yàn)或臨床試驗(yàn)階段，尤其是用于調(diào)節(jié)腦缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬活性的藥物依然處于空白狀態(tài)。下文將綜述部分有可能成為缺血性腦卒中后調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬活性的藥物靶點(diǎn)（表1），以期望對治療缺血性腦卒中的藥物研發(fā)提供新的思路。

表1 缺血性腦卒中后調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬活性的潛在靶點(diǎn)

3.1 以補(bǔ)體系統(tǒng)為治療靶點(diǎn)的研究

用于阻斷補(bǔ)體成分C1q 的抗體藥物已經(jīng)被證明在多種疾病模型中具有良好的作用，如Annexon公司的C1q單克隆抗體藥物ANX-M1。在野生型小鼠側(cè)腦室中注射寡聚Aβ造成的小鼠AD模型中，存在明顯的突觸丟失現(xiàn)象，并且大量的突觸與C1q共定位。而同時注射ANX-M1后，小鼠的突觸丟失現(xiàn)象明顯改善[27]。目前，該藥物針對AD 適應(yīng)證的研究已經(jīng)進(jìn)入到臨床前研究階段。同類型的藥物ANX-005用于治療肌萎縮側(cè)索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）(NCT04569435)和亨廷頓?。℉untington’s disease，HD）(NCT04514367)的研究則已經(jīng)在進(jìn)行Ⅱ期臨床試驗(yàn)。雖然現(xiàn)階段依然沒有用于缺血性腦卒中治療的抗小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬藥物進(jìn)入到臨床前研究階段，但值得注意的是，C1q作為經(jīng)典的Eat-me 信號，已經(jīng)被證明在缺血后的梗死核心及周圍表達(dá)升高，并且與這些區(qū)域的突觸丟失相關(guān)[65-66]。此外，C1q 的下游C3 也是抑制小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬活性的重要靶標(biāo)。研究表明，C3 抑制劑B4Crry 可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞對缺血半暗帶應(yīng)激存活神經(jīng)元的吞噬作用而不影響細(xì)胞碎片的清除，并且明顯改善腦缺血小鼠的認(rèn)知功能和運(yùn)動功能[66]。同時，無論是再灌注和非再灌注的情況下給予B4Crry 治療都可以顯著減少C3d 在損傷區(qū)域的沉積，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞對突觸的吞噬[55]。因此，抑制補(bǔ)體系統(tǒng)的激活是一個腦缺血后抑制小膠質(zhì)細(xì)胞對存活神經(jīng)元和突觸過度吞噬的潛在治療策略。

3.2 以小膠質(zhì)細(xì)胞MerTK受體為治療靶點(diǎn)的研究

在發(fā)育階段，小膠質(zhì)細(xì)胞通過MerTK 受體識別神經(jīng)元上暴露的PS，參與到神經(jīng)環(huán)路的突觸修剪過程中[67]。MerTK 也介導(dǎo)了腦缺血后的突觸丟失。Shi 等[56]的研究表明，在MCAO 模型小鼠中，MerTK 的表達(dá)在缺血后第14 天明顯升高，同時小膠質(zhì)細(xì)胞依然會吞噬大量的突觸結(jié)構(gòu)，而條件性敲除小膠質(zhì)細(xì)胞MerTK 后，小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)突觸結(jié)構(gòu)數(shù)量明顯減少，樹突棘數(shù)量增多。對小鼠注射內(nèi)皮素-1造成局部腦缺血后第3天，存活神經(jīng)元上暴露的PS 明顯增多，同時小膠質(zhì)細(xì)胞上識別PS 的MerTK 的表達(dá)也顯著提高。與野生型小鼠相比，MerTK 基因敲除小鼠腦缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞對存活神經(jīng)元的吞噬減少，腦萎縮體積減小。值得注意的是，敲除MerTK 后，缺血損傷造成的細(xì)胞碎片并沒有增多，說明MerTK 的缺失不影響細(xì)胞碎片的吞噬清除過程[40]。但MerTK 表達(dá)的時間動力學(xué)和介導(dǎo)的效應(yīng)似乎受到不同動物模型的影響，比如在MCAO模型中，MerTK的高表達(dá)時間點(diǎn)為缺血后14 d，主要介導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞對突觸的過度吞噬；而在內(nèi)皮素造成的局部缺血模型中，MerTK 則在缺血后第3天的表達(dá)最高，介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞對存活神經(jīng)元的過度吞噬。因此，如果能夠確定MerTK 在腦缺血后的表達(dá)特征，在特定的時間窗抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的MerTK 受體將會是一個減輕神經(jīng)功能損傷的潛在藥物靶點(diǎn)。

3.3 以核苷酸和嘌呤受體為治療靶點(diǎn)的研究

研究報道，在小鼠MCAO 后，小膠質(zhì)細(xì)胞中P2Y6 受體的表達(dá)增加，給予P2Y6 受體拮抗劑MRS2578 治療后，抑制了小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞碎片，從而加重神經(jīng)功能損傷，說明P2Y6 受體介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬活性增強(qiáng)是有益于細(xì)胞碎片的清除的[37]。雖然有其他的研究表明，在腦缺血后的第3 天，相比于野生型小鼠，P2Y6 受體基因敲除小鼠梗死周圍的NeuN（神經(jīng)元標(biāo)記物）陽性細(xì)胞數(shù)增加，提示P2Y6 受體可能參與了小膠質(zhì)細(xì)胞對存活神經(jīng)元的吞噬，導(dǎo)致神經(jīng)元的丟失[46]。值得注意的是，凋亡神經(jīng)元也是NeuN 染色陽性的，而該研究并沒有涉及敲除P2Y6 受體對凋亡神經(jīng)元數(shù)量的影響。所以NeuN 陽性細(xì)胞數(shù)目的增加可能是由于凋亡神經(jīng)元的清除受阻。綜上所述，P2Y6受體介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬功能有益于腦缺血后對細(xì)胞碎片的清除，在缺血性卒中急性期發(fā)揮有利作用，有希望成為缺血性卒中的治療靶點(diǎn)。

3.4 以S1P為治療靶點(diǎn)的研究

據(jù)最新研究報道，S1P 可以作為TREM2 受體的內(nèi)源性配體，促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬作用。FTY-720 是S1P 的類似物，在大鼠MCAO 模型中，F(xiàn)TY-720 表現(xiàn)出了良好的治療作用。在腦缺血損傷后的兩天內(nèi)給予FTY-720治療，可以顯著增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)元碎片的吞噬作用，減小腦梗死的體積[68]。因此，在缺血性腦卒中后的早期給予S1P 類似物促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬作用是一個極具潛力治療策略。雖然該藥物在腦卒中疾病中的應(yīng)用仍然處在動物實(shí)驗(yàn)研究階段，但用于ALS 和MS治療的FTY-720及其修飾物也已進(jìn)入了臨床前研究階段。

3.5 米諾環(huán)素

米諾環(huán)素（minocycline）是四環(huán)素家族的一種抗菌藥物，具有較好的血腦屏障通透性及抗炎效果。早期大量的基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)已經(jīng)表明，米諾環(huán)素可通過其抗炎、抗氧化和抗細(xì)胞凋亡的特性，改善神經(jīng)預(yù)后，預(yù)防腦缺血引起的神經(jīng)元損傷[69]。同時，米諾環(huán)素也是一種有效的小膠質(zhì)細(xì)胞激活抑制劑，在AD、自閉癥和抑郁癥等疾病模型的研究中被作為抑制小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬活性的工具藥[70-72]。但米諾環(huán)素抑制小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬活性的作用在腦缺血中卻沒有得到充分研究。在前期臨床試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，米諾環(huán)素對缺血性腦卒中的治療作用與小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬活性之間的關(guān)系值得進(jìn)一步探究。

3.6 其 他

缺血性腦卒中后，受損腦區(qū)存在嚴(yán)重的突觸丟失現(xiàn)象，而小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬作用是突觸丟失的重要因素[56]。抑制小膠質(zhì)細(xì)胞對突觸的吞噬作用對于腦缺血后的功能康復(fù)治療具有重要意義。本課題組在腦卒中后有關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬作用方面的研究也做了一些工作，如：本課題組以往的研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠腦缺血后激活CD200-CD200R信號軸能夠明顯提高感覺運(yùn)動皮層的突觸可塑性水平[54]，而突觸可塑性的改變可能與CD200-CD200R信號激活后抑制小膠質(zhì)細(xì)胞對突觸的吞噬有關(guān)，因?yàn)樵隗w外的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，敲低BV2 細(xì)胞的CD200R 表達(dá)后，BV2 細(xì)胞對熒光微球的吞噬活性顯著增強(qiáng)（結(jié)果未發(fā)表），提示CD200-CD200R信號軸可能是腦缺血后調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞突觸吞噬作用的靶標(biāo)之一。而且我們的研究還發(fā)現(xiàn)，在腦缺血后增強(qiáng)神經(jīng)元的活性可以通過抑制由C1q 介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞突觸吞噬作用，促進(jìn)小鼠的運(yùn)動功能康復(fù)（結(jié)果未發(fā)表），說明C1q介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞突觸吞噬作用在腦缺血后突觸丟失和功能障礙的病理過程中發(fā)揮重要作用，并且受到神經(jīng)元活性的調(diào)控。因此，C1q也是一個促進(jìn)腦缺血后功能康復(fù)的極具潛力的藥物靶點(diǎn)。

4 結(jié) 語

綜上所述，在缺血卒中后，小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬作用具有兩面性。一方面，小膠質(zhì)細(xì)胞可以吞噬凋亡細(xì)胞、細(xì)胞碎片和髓鞘碎片，以限制炎癥的產(chǎn)生，有益于減少缺血造成的損傷。另一方面，應(yīng)激但仍然存活的神經(jīng)元、突觸和髓鞘等也會遭到小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬，而這會加重神經(jīng)功能的損傷，不利于功能的康復(fù)。雖然小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬作用是神經(jīng)發(fā)育過程以及各類中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病病理機(jī)制的一個研究熱點(diǎn)，但是依然沒有能用于臨床治療的相關(guān)藥物上市。特別是現(xiàn)階段的研究對小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬作用在缺血性卒中病理過程以及功能康復(fù)中的作用和機(jī)制仍未清楚，因此迫切地需要闡明小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬作用在腦缺血后不同階段、不同腦區(qū)、對不同吞噬對象的吞噬作用的異質(zhì)性，以及不同吞噬相關(guān)信號分子之間的關(guān)系，期望找到調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬活性的關(guān)鍵靶標(biāo)，為今后的藥物研發(fā)提供新的思路。