劉 琳，胡婷婷，王夢(mèng)靈，聶 耀，張惟杰，王 琛，鄒秉杰，2*，宋沁馨**，周國(guó)華

（1中國(guó)藥科大學(xué)藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009；2南京大學(xué)生命分析化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210093；3東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院臨床藥學(xué)科，南京 210002）

生物發(fā)光（bioluminescence，BL）現(xiàn)象是一種普遍存在于自然界中的現(xiàn)象，是由生物體在體內(nèi)進(jìn)行生物發(fā)光反應(yīng)，產(chǎn)生可見(jiàn)光的現(xiàn)象。在大多數(shù)情況下，BL被認(rèn)為是求偶、阻止捕食者和吸引獵物的一種行為[1]。它的反應(yīng)底物是各種熒光素，即氧化后易于發(fā)光的小分子，是通過(guò)各種生化途徑進(jìn)化而來(lái)的。這些小分子的氧化是由非同源熒光素酶進(jìn)行催化的，從而產(chǎn)生一系列不同顏色、不同催化速率、不同細(xì)胞定位以及對(duì)三磷酸腺苷（ATP）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADH）等依賴的發(fā)光反應(yīng)[2]。由于該反應(yīng)具有高靈敏度、高選擇性和高信噪比等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于各種生物技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。一般，生物體首先通過(guò)在細(xì)胞內(nèi)合成具備發(fā)光能力的物質(zhì)，即熒光素。然后在細(xì)胞中特定酶的催化下，將熒光素中的化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能，從而產(chǎn)生光信號(hào)。具備發(fā)光能力的有機(jī)體在自然界中有很多。由體內(nèi)熒光素和熒光素酶之間的化學(xué)反應(yīng)而發(fā)生的自然發(fā)光現(xiàn)象，是大多數(shù)陸地發(fā)光生物的遺傳特征。還有一部分發(fā)光生物是通過(guò)其他各種途徑來(lái)獲取發(fā)光共生體，從而在海洋中產(chǎn)生光。例如，腔腸素是一種眾所周知的熒光素，主要來(lái)源于櫛水母、十足動(dòng)物和橈足類動(dòng)物等。而刺胞動(dòng)物、甲殼類動(dòng)物和深海魚(yú)類通過(guò)多層食物鏈來(lái)捕獲櫛水母、十足動(dòng)物和橈足類動(dòng)物等，使自身獲取熒光素。另外，一些不發(fā)光的弧菌通過(guò)水平基因轉(zhuǎn)移從發(fā)光的弧菌物種中獲得lux基因，從而使自己具備生物發(fā)光特性[3]。距今，大約10 000多個(gè)物種具備了在黑暗中發(fā)光的能力。

盡管BL 反應(yīng)在分子水平上并未得到充分的研究，但由于其易于檢測(cè)以及結(jié)果可視化的特點(diǎn)，已經(jīng)成為現(xiàn)代檢測(cè)技術(shù)的重要組成部分之一。其中，熒光素作為生物發(fā)光反應(yīng)的關(guān)鍵底物，關(guān)于它的人工合成也一直在被研究和探索著。直至1905年，諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)?lì)C給了合成熒光素的研究者，從此人工合成熒光素時(shí)代拉開(kāi)序幕。此后熒光染色技術(shù)被開(kāi)發(fā)出來(lái)，用于特異性地標(biāo)記細(xì)胞中不同的細(xì)胞器。再到2008 年，有學(xué)者從發(fā)光水母中獲得綠色熒光蛋白，再次被授予諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。在此基礎(chǔ)上，活體成像技術(shù)得到巨大發(fā)展。接下來(lái)在2014 年，超分辨率熒光顯微技術(shù)獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，在生物發(fā)光熒光分子的作用下，通過(guò)光學(xué)顯微鏡技術(shù)可以觀測(cè)到納米級(jí)別的物體。

近年來(lái)，熒光素和熒光素酶的結(jié)構(gòu)以及生物發(fā)光反應(yīng)的作用不斷被研究和改進(jìn)著。因此，許多檢測(cè)方法應(yīng)運(yùn)而生，并被廣泛應(yīng)用于體內(nèi)外的各項(xiàng)研究，包括環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品檢測(cè)、分子診斷、藥物篩選以及各種生物醫(yī)學(xué)研究。本文簡(jiǎn)要概述了熒光素和熒光素酶發(fā)光反應(yīng)的原理，以及它們?cè)趯?shí)際檢測(cè)中的各種應(yīng)用。

1 生物發(fā)光系統(tǒng)

BL 是生物體通過(guò)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生光的能力，屬于化學(xué)發(fā)光的范疇，是自然界令人驚奇的現(xiàn)象之一，存在于一些特定的細(xì)菌、真菌、昆蟲(chóng)、植物和海洋生物等種屬中。常見(jiàn)的生物發(fā)光系統(tǒng)一般分為以下4種，見(jiàn)表1。

表1 4種常見(jiàn)生物發(fā)光系統(tǒng)的介紹

1.1 螢火蟲(chóng)熒光素系統(tǒng)

螢火蟲(chóng)熒光素系統(tǒng)是一組重要的生物發(fā)光反應(yīng)系統(tǒng)，也是目前研究最徹底的一種。蟲(chóng)熒光素經(jīng)過(guò)氧化、熱解、發(fā)射光、再生成熒光素、儲(chǔ)存、釋放等一系列反應(yīng)，形成循環(huán)。該過(guò)程不僅實(shí)現(xiàn)了發(fā)光底物的生成與儲(chǔ)存，也在反應(yīng)過(guò)程中輸出了光信號(hào)。大部分反應(yīng)利用的是一種稱為D-熒光素的穩(wěn)定且無(wú)毒的化合物發(fā)出黃色、橙色或者紅色的光。圖1 是螢火蟲(chóng)生物發(fā)光周期的6 個(gè)階段。該系統(tǒng)已經(jīng)在幾種甲蟲(chóng)譜系中進(jìn)化，包括螢火蟲(chóng)、點(diǎn)擊甲蟲(chóng)和鐵路蠕蟲(chóng)。

圖1 螢火蟲(chóng)生物發(fā)光周期的6個(gè)階段[4]

1.2 腔腸素依賴系統(tǒng)

海洋生態(tài)系統(tǒng)中存在著許多發(fā)光生物。腔腸素是一種廣泛存在于海洋生物中的化學(xué)發(fā)光單分子[5]，是許多獨(dú)立進(jìn)化的海洋生物細(xì)胞內(nèi)熒光素酶作用的底物。但是大多數(shù)海洋生物本身并不合成腔腸素，而是從食物中獲取。這可能就是海洋生態(tài)系統(tǒng)中的生物不斷趨向于發(fā)光生物進(jìn)化的原因。自然界中所有依賴腔腸素的發(fā)光系統(tǒng)都會(huì)發(fā)出藍(lán)光，圖2 是各種腔腸素依賴性的生物發(fā)光系統(tǒng)，通常不需要除氧氣外的任何其他輔助因子，其發(fā)射最大值在450 ～ 500 nm之間。在某些情況下，與熒光素酶相互作用的熒光蛋白會(huì)改變生物發(fā)光的顏色。其他特性，如相對(duì)分子質(zhì)量、pH 敏感性、熱穩(wěn)定性和熒光素酶的催化速率在腔腸素依賴系統(tǒng)之間變化也很大。

圖2 各種腔腸素依賴性生物發(fā)光系統(tǒng)[6]

1.3 細(xì)菌生物發(fā)光系統(tǒng)

作為分布最廣的發(fā)光生物，發(fā)光細(xì)菌在正常生理?xiàng)l件下發(fā)出藍(lán)綠色光。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了30 多種發(fā)光細(xì)菌，但只有5 種被詳細(xì)研究過(guò)。這5 種發(fā)光細(xì)菌通過(guò)相同的熒光素酶催化機(jī)制（圖3-A）產(chǎn)生生物發(fā)光。詳細(xì)過(guò)程如圖3-B 所示。首先，還原的黃素單核苷酸陰離子（FMNH，- R）與氧氣反應(yīng)生成4α-過(guò)氧羥基-5-氫黃素單核苷酸（HFOOH*, IM-1）。隨后，HFOOH*與長(zhǎng)鏈脂肪醛（RCHO，體內(nèi)十四醛）反應(yīng)得到中間體。然后，HFOOCH(OH)R 解離產(chǎn)生第一個(gè)單重激發(fā)態(tài)（S1態(tài)）4α- 羥基-5- 氫-FMN（HFOH*）和羧酸（RCOOH）。隨即，生物發(fā)光體HFOH*去激發(fā)為HFOH 并發(fā)射光。最后，HFOH 轉(zhuǎn)化為黃素單核苷酸（FMN）和水。該發(fā)光系統(tǒng)可以在沒(méi)有外部熒光素的情況下在活細(xì)胞中產(chǎn)生光。由于其發(fā)光水平相對(duì)較低，進(jìn)一步限制了生物發(fā)光成像的許多應(yīng)用[7]。

圖3 細(xì)菌生物發(fā)光反應(yīng)過(guò)程[8]

1.4 真菌系統(tǒng)

生物發(fā)光真菌的最早記錄可以追溯到兩千年前。距今，已發(fā)現(xiàn)約100 多種發(fā)光真菌，分布在9個(gè)種屬中。所有報(bào)道的發(fā)光真菌都發(fā)出綠光，最大強(qiáng)度在520 ～ 530 nm，并且可能共享一個(gè)單一的生物發(fā)光系統(tǒng)。2018 年，有學(xué)者完整描述了一種在真菌中產(chǎn)生生物發(fā)光的生化途徑，提供了第1個(gè)來(lái)自真核生物的基因可編碼途徑。真菌利用一種簡(jiǎn)單的化合物（α-吡喃酮）作為熒光素，在反應(yīng)中被不溶性的熒光素酶氧化，只需要氧氣就能使反應(yīng)發(fā)出綠光。真菌熒光素生物合成和回收的途徑如圖4 所示，咖啡酸通過(guò)咖啡豆素合酶（HispS）轉(zhuǎn)化為牛奶樹(shù)堿，并被牛奶樹(shù)堿3-羥基化酶（H3H）羥基化，產(chǎn)生3-羥基牛奶樹(shù)堿，即真菌熒光素。接著熒光素酶（Luz）聯(lián)合分子氧，將真菌熒光素氧化為內(nèi)過(guò)氧化物，并以高能中間體的形式存在。最后，高能中間體分解為氧化熒光素（咖啡酰丙酮酸）并發(fā)射光。而氧化熒光素可通過(guò)咖啡酰丙酮酸水解酶（CPH）循環(huán)生成咖啡酸。有研究表明來(lái)自真菌生物發(fā)光系統(tǒng)最少3 個(gè)基因的表達(dá)就足以改造其他不發(fā)光的真核生物。Mitiouchkina 等[9]在重組真菌生物發(fā)光系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，對(duì)煙草進(jìn)行改造，將咖啡酸轉(zhuǎn)化為熒光素，轉(zhuǎn)化后的植株可在活體生長(zhǎng)狀態(tài)下發(fā)出肉眼可見(jiàn)的光，即可視光。

圖4 真菌熒光素生物合成和回收的途徑[10]

2 熒光素酶種類

熒光素酶不是一種具有特定結(jié)構(gòu)的特定分子，凡是可以催化生物發(fā)光反應(yīng)的酶都可以稱為熒光素酶，可以是天然的，即來(lái)自生物體內(nèi)的，也可以是在實(shí)驗(yàn)室中用基因工程的方法生成。雖然從類型上來(lái)說(shuō)各不相同，但本質(zhì)上都是生物發(fā)光反應(yīng)的催化劑，用于催化不同的發(fā)光反應(yīng)。常見(jiàn)的幾種熒光素酶有以下4種。

2.1 蟲(chóng)熒光素酶

螢火蟲(chóng)熒光素酶和點(diǎn)擊甲蟲(chóng)熒光素酶是被廣泛應(yīng)用的兩大蟲(chóng)熒光素酶。

螢火蟲(chóng)熒光素酶：已經(jīng)克隆、測(cè)序和表征了幾種螢火蟲(chóng)熒光素酶，它們具有不同的動(dòng)力學(xué)特性并在黃綠色光譜范圍內(nèi)引起光發(fā)射。其中一些被用作生物成像和生物傳感器的分析試劑和報(bào)告基因，還有被用作細(xì)胞內(nèi)pH 和有毒金屬顏色調(diào)節(jié)的指示劑[11]。

點(diǎn)擊甲蟲(chóng)熒光素酶：第二大流行的D-熒光素依賴性熒光素酶來(lái)源于點(diǎn)擊甲蟲(chóng)。該物種使用4 種類型的熒光素酶發(fā)光，發(fā)射光最大波長(zhǎng)在綠色（540 nm）到橙紅色（593 nm）之間。其顏色可變性、對(duì)各種pH 的耐受性以及工程變體的可用性使點(diǎn)擊甲蟲(chóng)熒光素酶在眾多實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)用廣泛[12]。

2.2 高斯熒光素酶

高斯熒光素酶主要來(lái)自海洋橈足類——高斯氏菌，這是一類具有生物發(fā)光性質(zhì)的海洋生物。該酶本質(zhì)上是一種蛋白質(zhì)，相對(duì)分子質(zhì)量大約為20 kD，通常會(huì)從哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中分泌出來(lái)。在氧氣的作用下，該酶能將腔腸素催化氧化，然后發(fā)出光信號(hào)。它由帶有分泌信號(hào)肽的N 末端可變部分和包含10 個(gè)高度保守的Cys 殘基的C 末端催化結(jié)構(gòu)域組成，存在多達(dá)5個(gè)二硫鍵。在生物醫(yī)學(xué)研究中得到了廣泛應(yīng)用。

2.3 海腎熒光素酶

廣泛使用的腔腸素驅(qū)動(dòng)的海腎熒光素酶是在40 多年前發(fā)現(xiàn)的，是來(lái)自珊瑚的中等大小（36 kD）胞質(zhì)蛋白。在生物發(fā)光反應(yīng)中可產(chǎn)生穩(wěn)定的發(fā)光信號(hào)。但就目前來(lái)說(shuō)，它通過(guò)氧化產(chǎn)生藍(lán)色光子的機(jī)制仍不清楚[13]。綠色海腎（Green Renilla）熒光素酶是一種在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的蛋白。在血清中等復(fù)雜樣品中，綠色海腎熒光素酶與天然的海腎熒光素酶相比具有更高的穩(wěn)定性和更好的發(fā)光強(qiáng)度。故選擇綠色海腎熒光素酶作為報(bào)告基因進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)時(shí)比天然海腎熒光素酶能獲得更高的靈敏度。

2.4 海螢熒光素酶

海螢（Cypridina）熒光素酶的相對(duì)分子質(zhì)量在62 kD 左右。同高斯熒光素酶相似，也是一種分泌型蛋白。絕大部分熒光素酶將分泌到細(xì)胞外。在此基礎(chǔ)上，可通過(guò)對(duì)熒光素酶的檢測(cè)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)活細(xì)胞的持續(xù)監(jiān)測(cè)，簡(jiǎn)單便捷。由于熒光素酶能使反應(yīng)產(chǎn)生高信號(hào)，所以當(dāng)細(xì)胞內(nèi)存在未分泌的熒光素酶時(shí)，便可以通過(guò)常規(guī)的裂解方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。其次，海螢熒光素酶還可以和紅色螢火蟲(chóng)熒光素酶組合為雙色檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)。

3 基于熒光素酶生物發(fā)光的檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用

3.1 基于蟲(chóng)螢光素酶和D-熒光素的ATP生物發(fā)光法

ATP 生物發(fā)光檢測(cè)的反應(yīng)底物有ATP 和D-熒光素。在底物量充足的情況下，當(dāng)Mg2+和O2存在時(shí)，熒光素酶會(huì)催化D-熒光素氧化，從而產(chǎn)生熒光，熒光信號(hào)的強(qiáng)度與ATP 的含量在一定范圍內(nèi)成正比，進(jìn)而可以使用光度計(jì)以超高靈敏度進(jìn)行量化。ATP 生物發(fā)光檢測(cè)法因其快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高的優(yōu)勢(shì)，已被廣泛用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)中。目前主要應(yīng)用于以下幾方面。

3.1.1 微生物數(shù)量檢測(cè) ATP 是生物的主要能量來(lái)源，普遍存在于所有活的生物體中，測(cè)量 ATP是所有微生物存在與否的實(shí)時(shí)指標(biāo)[14]。大部分細(xì)胞內(nèi)的ATP 含量基本上是恒定的，所以ATP 的濃度便與細(xì)胞的數(shù)量成正比。理論情況下細(xì)胞的數(shù)目越多，ATP 含量就會(huì)越高，發(fā)光信號(hào)也就越高。當(dāng)細(xì)胞處于凋亡、壞死或毒性狀態(tài)時(shí)，ATP 水平會(huì)迅速下降。因此，細(xì)胞內(nèi)ATP 的濃度，反映了微生物的活性和活細(xì)胞的數(shù)量。當(dāng)ATP 濃度較低無(wú)法用于檢測(cè)時(shí)，可以對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增[15]后再檢測(cè)。

Ishimaru 等[16]通過(guò)比較ATP 檢測(cè)法和平板計(jì)數(shù)法，發(fā)現(xiàn)它們基本呈正相關(guān)。但在很多方面，ATP 生物發(fā)光檢測(cè)法是優(yōu)于平板計(jì)數(shù)法的。就細(xì)胞可檢測(cè)的狀態(tài)而言，ATP法可檢測(cè)具有胞內(nèi)ATP的細(xì)胞，包括可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)的細(xì)胞以及受損的細(xì)胞；而平板計(jì)數(shù)法僅能檢測(cè)在瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞，即可培養(yǎng)的活細(xì)胞。在這種情況下，ATP檢測(cè)方法的對(duì)數(shù)減少可能低于平板計(jì)數(shù)方法，即ATP生物發(fā)光法比平板計(jì)數(shù)法準(zhǔn)確度更高。

3.1.2 藥敏試驗(yàn) 傳統(tǒng)的基于蟲(chóng)熒光素酶和D-熒光素檢測(cè)ATP 并用于藥敏試驗(yàn)的方法，都是檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ATP。但有研究者認(rèn)為只測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ATP，準(zhǔn)確度有待商榷，便將細(xì)胞內(nèi)ATP 與其在600 nm 處的吸收度（A600）結(jié)合起來(lái)。Heller 等[17]開(kāi)發(fā)了一種藥敏試驗(yàn)，通過(guò)利用生物發(fā)光法確定細(xì)菌釋放的ATP 以及測(cè)定細(xì)菌溶液的A600來(lái)表明抗生素的抗菌效果。當(dāng)細(xì)菌在生長(zhǎng)期或在抗生素存在時(shí)會(huì)被溶解從而釋放ATP，所以培養(yǎng)基中ATP含量增加。雖然吸收度會(huì)在生長(zhǎng)期增加，但在細(xì)菌裂解過(guò)程中并不改變。所以用細(xì)菌達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后的吸收度與釋放的ATP 的比值即可表明抗生素的功效。隨著研究的不斷進(jìn)步，也可以通過(guò)監(jiān)測(cè)給藥過(guò)程中細(xì)胞外ATP 的釋放來(lái)對(duì)耐藥菌進(jìn)行篩選。Ihssen 等[18]構(gòu)建了一種工程化的耐熱熒光素酶用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)菌培養(yǎng)物中的細(xì)胞外ATP。該方法能夠快速檢測(cè)抗生素對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)物的影響。因?yàn)橛忙?內(nèi)酰胺抗生素攻擊氨芐青霉素敏感菌株時(shí)，即使在細(xì)菌沒(méi)有生長(zhǎng)的情況下，也表現(xiàn)出強(qiáng)烈的胞外ATP 的積累。由此可得，基于蟲(chóng)熒光素酶和D-熒光素的ATP 生物發(fā)光法在藥敏試驗(yàn)中發(fā)揮著重要作用，其操作簡(jiǎn)單、結(jié)果快速的優(yōu)勢(shì)使其有望在日后與傳統(tǒng)檢測(cè)方法并駕齊驅(qū)。

3.1.3 潔凈度檢測(cè) 食品、藥品等重點(diǎn)產(chǎn)品在生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)環(huán)境的潔凈程度要求很高。只有對(duì)生產(chǎn)環(huán)境進(jìn)行嚴(yán)格的監(jiān)督和管理，才能提供潔凈的環(huán)境以及生產(chǎn)出安全、高質(zhì)量的產(chǎn)品?；跓晒馑孛傅纳锇l(fā)光檢測(cè)ATP 的方法由于其簡(jiǎn)單快速的特點(diǎn)已經(jīng)被廣泛用于潔凈度的檢測(cè)中。Tr?an等[19]在醫(yī)院藥房的潔凈室中評(píng)估了ATP 生物發(fā)光方法對(duì)監(jiān)測(cè)表面衛(wèi)生的有用性。他們發(fā)現(xiàn)該方法的靈敏度適合用于評(píng)估清潔和消毒的效率，并優(yōu)于傳統(tǒng)的基于微生物培養(yǎng)的表面潔凈度檢測(cè)方法。Buczinski 等[20]使用ATP 發(fā)光法評(píng)估奶牛場(chǎng)用于收集和喂養(yǎng)初乳設(shè)備的清潔度，給出了ATP 發(fā)光法在小牛飼養(yǎng)過(guò)程中的相關(guān)設(shè)備潔凈度檢測(cè)方面具有潛在應(yīng)用的結(jié)論。還有一些通過(guò)結(jié)合納米探針和ATP 生物發(fā)光技術(shù)來(lái)快速檢測(cè)食品中大腸埃希菌的方法[21]。這些研究都表明，基于熒光素酶的ATP 生物發(fā)光法能很好地用于潔凈度檢測(cè)中，包括食品、環(huán)境以及一些機(jī)械設(shè)備等。

3.1.4 焦磷酸測(cè)序 傳統(tǒng)的焦磷酸測(cè)序方法，使用了4種酶。它們是用于延伸DNA 鏈的DNA 聚合酶、用于在腺苷5'磷酸硫酸鹽（APS）存在下將PPi轉(zhuǎn)化為ATP 的ATP 硫酸化酶、用于通過(guò)消耗ATP將熒光素轉(zhuǎn)化為氧化熒光素而產(chǎn)生可見(jiàn)光的熒光素酶以及用于降解ATP 和未摻入的dNTPs 的腺苷三磷酸雙磷酸酶。當(dāng)添加的dNTP 與測(cè)序引物雜交的模板鏈中的堿基互補(bǔ)時(shí)，就會(huì)發(fā)生鏈延伸反應(yīng)。隨后ATP 生成并和熒光素酶發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生光信號(hào)。光信號(hào)被檢測(cè)為熱解圖中的峰值。每個(gè)峰的相對(duì)強(qiáng)度與摻入的核苷酸數(shù)量成正比。最后，核苷酸序列由摻入的核苷酸種類和熱解圖中的峰高確定。在以APS 為底物的熒光素酶測(cè)定中，很難檢測(cè)核苷酸摻入反應(yīng)期間產(chǎn)生的少量PPi，因?yàn)闀?huì)產(chǎn)生很高的背景信號(hào)。從PPi 產(chǎn)生ATP 的另一種方法是使用PPDK和AMP，這種改進(jìn)大大降低了背景信號(hào)。使用了熒光素-熒光素酶的焦磷酸測(cè)序，在準(zhǔn)確性、系統(tǒng)靈活性和整個(gè)測(cè)序過(guò)程的自動(dòng)化方面與其他新測(cè)序方法相比具有較多優(yōu)勢(shì)，使其在測(cè)序界榜上有名。

3.2 熒光酶-熒光素探針

熒光探針是一種小分子傳感器，可在特定刺激時(shí)暴露出明亮的熒光，是化學(xué)、生物學(xué)領(lǐng)域里的強(qiáng)大工具。基于封閉策略，許多生物發(fā)光探針得到了很好的開(kāi)發(fā)。在各種生物發(fā)光系統(tǒng)中，應(yīng)用最廣泛的生物發(fā)光系統(tǒng)是螢火蟲(chóng)熒光素系統(tǒng)。螢火蟲(chóng)熒光素系統(tǒng)探針已成功應(yīng)用于生理過(guò)程分析、環(huán)境監(jiān)測(cè)、疾病診斷、篩選候選藥物，評(píng)估治療效果等方面[22]。

3.2.1 測(cè)定細(xì)胞信號(hào) G 蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）處G 蛋白依賴性信號(hào)級(jí)聯(lián)的激活越早，對(duì)測(cè)量信號(hào)的放大效應(yīng)就越小。這在精確量化激動(dòng)劑功效的情況下特別有用，并且在確定與β-arrestin 途徑相關(guān)的激動(dòng)劑偏倚時(shí)至關(guān)重要。Littmann 等[23]開(kāi)發(fā)了一種具有近端讀數(shù)和足夠高通量的技術(shù)，可用于檢測(cè)活細(xì)胞的信號(hào)。主要是通過(guò)分裂熒光素酶互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)（SLC）來(lái)評(píng)估Gαq蛋白及其效應(yīng)物磷脂酶C-β3的相互作用。該方法具有近端讀數(shù)和足夠的高通量，并且可用于活細(xì)胞的檢測(cè)。Nazari等[24]將來(lái)海腎熒光素酶（RLuc）與膜蛋白V 相連，開(kāi)發(fā)了一類新的基于膜蛋白V 的細(xì)胞凋亡探針，以可溶的形式在大腸埃希菌BL21(DE3)中成功表達(dá)，并對(duì)純化后的探針Rluc/AnnexinV，進(jìn)行了功能檢測(cè)，最后用于檢測(cè)放線菌素D 誘導(dǎo)的Jurkat 細(xì)胞凋亡。結(jié)果表明，Rluc/Annexin V 可以與凋亡細(xì)胞結(jié)合，并且可以通過(guò)光度測(cè)量來(lái)檢測(cè)海腎熒光素酶的信號(hào)。該探針可能對(duì)改善當(dāng)前細(xì)胞凋亡的檢測(cè)具有潛在的商業(yè)意義。以上可以看出熒光素酶在探測(cè)細(xì)胞信號(hào)中發(fā)揮著極大作用。

3.2.2 檢測(cè)核酸 核酸檢測(cè)方法以熒光定量PCR 最為常見(jiàn)，也是實(shí)驗(yàn)室的金標(biāo)準(zhǔn)，然而熒光素酶在核酸檢測(cè)中也有一席之位。Endoh 等[25]構(gòu)建了一種分子內(nèi)熒光素酶互補(bǔ)探針，用于檢測(cè)除蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用之外的目標(biāo)生物分子。它由插入肽的螢火蟲(chóng)熒光素酶（PI-FLuc）組成，在內(nèi)部分開(kāi)的螢火蟲(chóng)熒光素酶之間含有短肽。插入的短肽通過(guò)其誘導(dǎo)的構(gòu)象變化觸發(fā)其與FLuc 互補(bǔ)，并隨后重新激活或滅活FLuc 的活性。將RNA 與含有ARM、Rev 或Tat 的精氨酸相結(jié)合，用于模型肽插入，并使用沒(méi)有小麥生殖細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)表達(dá)PI-FLuc 探針變體。當(dāng)結(jié)合特定的RNA 靶標(biāo)后，會(huì)顯示FLuc 活性發(fā)生變化，重新激活或失活。Joda 等[26]基于高斯熒光素酶的生物發(fā)光設(shè)計(jì)了一種莖環(huán)狀的探針，用于檢測(cè)HIV-1核酸。檢測(cè)過(guò)程中顯示出對(duì)單個(gè)和雙重錯(cuò)配核酸靶標(biāo)的極佳選擇性，低檢測(cè)限以及檢測(cè)人血清基質(zhì)中HIV-1RNA 的能力。以及來(lái)自大腸埃希氏菌O157 的實(shí)際基因組DNA 樣本也可以利用熒光素酶進(jìn)行檢測(cè)。

3.2.3 檢測(cè)蛋白 Ozawa 等[27]基于蛋白質(zhì)剪接過(guò)程設(shè)計(jì)了與螢火蟲(chóng)熒光素酶互補(bǔ)的片段，開(kāi)發(fā)了一種檢測(cè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的新方法。在這種方法中，蛋白質(zhì)之間相互作用會(huì)觸發(fā)DnaE 內(nèi)含肽的折疊，發(fā)生蛋白質(zhì)剪接，從而使連接的熒光素酶的外泌蛋白恢復(fù)其酶活性。這為研究蛋白質(zhì)的磷酸化和整合膜蛋白之間的相互作用提供了一種簡(jiǎn)便的方法。

3.2.4 細(xì)胞成像 生物發(fā)光成像（BLI）是新開(kāi)發(fā)的非侵入性的可視化的方法，其特點(diǎn)為靈敏度高，分辨率和選擇性高，背景信號(hào)低以及不需要外部光激發(fā)[28]?；谖灮鹣x(chóng)熒光素-熒光素酶系統(tǒng)的BLI已被廣泛用于腫瘤特異性酶的活性評(píng)估，包括與疾病相關(guān)的生物活性小分子和金屬離子的檢測(cè)以及疾病的診斷和治療，也包括藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的研究，生理病理過(guò)程中[29]免疫反應(yīng)的研究以及對(duì)藥物效力和組織分布的評(píng)估。

3.3 熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)

第1個(gè)報(bào)告基因系統(tǒng)是在20世紀(jì)80年代初期開(kāi)發(fā)的，其最初目的是為了測(cè)量酶的活性（作為啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄活性的替代指標(biāo)）以及分析特定啟動(dòng)子的活性（即，在與報(bào)告基因相連的特定啟動(dòng)子的調(diào)控下的基因表達(dá)）。該系統(tǒng)可以高度敏感地可視化特定啟動(dòng)子的活性。通常，有兩類報(bào)告系統(tǒng)：用于細(xì)胞跟蹤的組成型表達(dá)報(bào)告構(gòu)系統(tǒng)，以及用于表征特定的組織，腫瘤或信號(hào)通路的內(nèi)源信號(hào)分子和轉(zhuǎn)錄因子的誘導(dǎo)型報(bào)告系統(tǒng)。基于熒光素酶的報(bào)告基因系統(tǒng)是生物醫(yī)學(xué)研究中的重要工具。在熒光素酶中，黃素依賴酶的使用最常見(jiàn)。

3.3.1 研究基因表達(dá) Goodman 等[30]早在1999年就利用螢火蟲(chóng)熒光素酶作為報(bào)告基因，研究變形鏈球菌中的基因表達(dá)。在變形鏈球菌中測(cè)試了螢火蟲(chóng)熒光素酶作為報(bào)告基因的效用。在內(nèi)源性啟動(dòng)子的控制下，熒光素酶編碼序列被強(qiáng)烈表達(dá)，而無(wú)啟動(dòng)子的版本與背景是無(wú)法區(qū)分的。熒光素酶在研究基因表達(dá)的方向上，一直在不斷發(fā)展。在2019 年的時(shí)候，Shan 等[31]建立了DGKθ 內(nèi)源性啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因HepG2 細(xì)胞系，用于研究DGKθ 基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。2020 年時(shí)開(kāi)發(fā)出檢測(cè)Sox9轉(zhuǎn)錄因子的熒光素酶報(bào)告基因[32]，能定量檢測(cè)活細(xì)胞中的Sox9-SUMOylation水平。

3.3.2 藥物的篩選 熒光素酶報(bào)告基因具有高敏感性、特異性靶點(diǎn)、高通量的特點(diǎn)，能夠進(jìn)行先導(dǎo)化合物的篩選，使小分子有機(jī)化合物替代生物大分子作為藥物成為可能，包括糖皮質(zhì)激素、增值抑制劑、抗瘧藥物等的篩選。在新型冠狀病毒大流行中，熒光素酶作為報(bào)告基因也貢獻(xiàn)出自己的一份力量，在高通量篩選血清學(xué)檢測(cè)方法和藥物開(kāi)發(fā)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[33]。

3.3.3 蛋白研究 近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)與基因組學(xué)的發(fā)展，出現(xiàn)了很多新型的基于不同水平的蛋白質(zhì)的研究方法，其中熒光素酶報(bào)告基因也在這一方面逐漸發(fā)揮作用。Naylor 等[34]使用Tol2轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)生成了一個(gè)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)系，該系使用fabp10a 肝臟特異性啟動(dòng)子過(guò)度表達(dá)與受體相關(guān)蛋白的D3 域融合的納米熒光素酶分子。使用光度計(jì)，通過(guò)測(cè)量胚胎培養(yǎng)基中的發(fā)光強(qiáng)度來(lái)量化NL-D3 斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)中的蛋白尿，以此進(jìn)行腎功能的評(píng)估。

3.3.4 檢測(cè)熱原 Wang 等[35]用含有熒光素酶基因的NF-κB-RE 質(zhì)粒去轉(zhuǎn)染HL60 細(xì)胞，開(kāi)發(fā)了一種新型熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)熱原的方法。通過(guò)用熱原刺激，獲得與熱原濃度呈劑量依賴性的信號(hào)。由于其檢測(cè)速度快、靈敏度高、操作方式方便、熱原譜檢測(cè)范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，有望成為檢測(cè)熱原的一種補(bǔ)充方法。

3.4 熒光素酶生物傳感器

生物傳感器是利用電子組件（換能器）和生物組件來(lái)研究生物體的設(shè)備。它們通常用于檢查生物結(jié)構(gòu)，是有前途的、值得選擇性的檢測(cè)設(shè)備，具備作為即時(shí)檢測(cè)工具的巨大潛力。其與分子探針聯(lián)用使人們能夠在分子水平上研究生命系統(tǒng)中的生物學(xué)和病理學(xué)過(guò)程，從而將化學(xué)和生物學(xué)與醫(yī)學(xué)聯(lián)系起來(lái)。熒光素酶作為一種生物傳感器，逐漸用于各方各面，并發(fā)揮著不可或缺的作用。

3.4.1 評(píng)估蛋白酶活性 Zhou等[36]研究了4種基于熒光素酶的生物傳感器，其中包含被HAV 3Cpro或點(diǎn)狀DnaE內(nèi)含肽切割的NEMO序列（PVLKAQ↓ADIYKA），以監(jiān)測(cè)人胚腎細(xì)胞（HEK）中HAV 3Cpro的活性。數(shù)據(jù)表明，開(kāi)發(fā)的熒光素酶生物傳感器可快速、靈敏和有效的評(píng)估HAV 3Cpro的活性。

3.4.2 檢測(cè)金屬離子 將生物發(fā)光用于重金屬檢測(cè)的生物傳感器并不常見(jiàn)。多數(shù)通過(guò)發(fā)光用于重金屬檢測(cè)的生物傳感器都是發(fā)射熒光的，并且依賴于發(fā)光的強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)量；少數(shù)是比率型的，需要依賴于光譜變化來(lái)產(chǎn)生信號(hào)。但螢火蟲(chóng)熒光素酶可以與汞和砷等金屬離子偶聯(lián)形成響應(yīng)性啟動(dòng)子[37]，并在生物傳感器上作為光發(fā)射器。其發(fā)光光譜對(duì)重金屬陽(yáng)離子（例如鋅和汞）和pH 非常敏感。結(jié)果表明該生物傳感器可檢測(cè)出對(duì)低至0.1 mmol/L的重金屬，這表明了螢火蟲(chóng)熒光素酶生物傳感器作為細(xì)胞內(nèi)金屬檢測(cè)的潛在適用性。

3.4.3 作為示蹤劑 de la Fuente等[38]描述了一種來(lái)自橈足類動(dòng)物Metridia lucens的新型熒光素酶（MlLuc），并開(kāi)發(fā)了一種新型生物發(fā)光的重組親和體（MlLuc-aff），MlLuc-aff能夠作為示蹤劑準(zhǔn)確檢測(cè)乳腺腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的HER2受體，有助于乳腺癌患者的早期診斷和治療效果的評(píng)估。White等[39]開(kāi)發(fā)了一種納米熒光素酶生物傳感器，用于研究?jī)?nèi)源性趨化因子的分泌以及和受體的結(jié)合，以便更好了解它們之間的功能和相互作用。利用CRISPR/Cas9 基因組編輯納米熒光素酶片段HiBiT，用來(lái)標(biāo)記趨化因子CXCL12。隨后通過(guò)輸出的光信號(hào)來(lái)定量監(jiān)測(cè)CXCL12 的分泌。由于納米熒光素酶互補(bǔ)的空間限制，可以監(jiān)測(cè)標(biāo)記的CXCL12與趨化因子受體或膜糖胺聚糖的結(jié)合。這些活細(xì)胞檢測(cè)方法結(jié)合了納米熒光素酶的敏感性和CRISPR/Cas9 基因組編輯功能，可實(shí)時(shí)、定量和監(jiān)測(cè)低水平的天然分泌蛋白。

4 總結(jié)和展望

不同的發(fā)光反應(yīng)在現(xiàn)代檢測(cè)技術(shù)中占據(jù)了不同位置，沒(méi)有任何一種生物發(fā)光系統(tǒng)能完全適用于所有檢測(cè)和應(yīng)用。在生物成像中，生物發(fā)光和基于熒光的方法的應(yīng)用重疊，前者主要用于需要高動(dòng)態(tài)范圍、背景低或深層組織成像的實(shí)驗(yàn)。在細(xì)菌生物學(xué)的毒性測(cè)定和研究中，通常選擇細(xì)菌生物發(fā)光系統(tǒng)。而藥物篩選又通常采用 D-熒光素依賴性或腔腸素依賴性系統(tǒng)。并且在為特定應(yīng)用選擇熒光素-熒光素酶時(shí)，必須考慮熱穩(wěn)定性、最佳pH、蛋白質(zhì)大小、細(xì)胞或細(xì)胞外位置、聚集特性、發(fā)射波長(zhǎng)、強(qiáng)度等因素?；跓晒馑孛傅牟煌瑱z測(cè)方法之間的比較見(jiàn)表2。

表2 基于熒光素酶的不同檢測(cè)方法的比較

目前，基于熒光素酶生物發(fā)光的檢測(cè)工具在合成生物學(xué)中的潛力只有很少一部分被挖掘出來(lái)。就發(fā)光生物體的普遍分布、發(fā)光反應(yīng)在實(shí)際應(yīng)用中的重要性以及其在有機(jī)化學(xué)、代謝組學(xué)和遺傳學(xué)中使用的范圍來(lái)看，生物發(fā)光可探索的領(lǐng)域還有很多。與此同時(shí)，隨著每年對(duì)生物發(fā)光的光物理學(xué)、遺傳學(xué)和生態(tài)學(xué)的研究，新的發(fā)光生物和光通信系統(tǒng)以及新的檢測(cè)方法也變得更有可能。