張 鵬, 楊一帆, 王 輝, 涂宗財, , 沙小梅, 胡月明*

1. 南昌大學食品科學與技術(shù)國家重點實驗室, 江西 南昌 330047

2. 江西師范大學國家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心和江西省淡水魚高值化利用工程技術(shù)研究中心, 江西 南昌 330022

3. 江西福美泰生物技術(shù)有限公司, 江西 九江 332100

引 言

蛋白質(zhì)是人體的必需營養(yǎng)素之一, 可為人體提供大量氨基酸, 是生長發(fā)育和新陳代謝的必不可缺物質(zhì)。 作為人類食品的重要組分, 蛋白質(zhì)除了提供營養(yǎng)價值外, 其乳化、 起泡、 凝膠等功能特性在食品加工過程中也發(fā)揮著重要作用, 是各類美味食品的重要支撐。 然而, 一些食品蛋白質(zhì)在營養(yǎng)、 功能特性等方面存在不足, 如抗氧化能力弱、 乳化性不強、 致敏性高、 凝膠性差等, 限制了其作為基料在食品加工中的應(yīng)用[1-3]。

多種加工手段用于改善蛋白質(zhì)的營養(yǎng)、 功能特性, 如物理法、 化學法、 生物酶法和基因工程法等。 其中, 化學法最為常用, 包括酸堿化、 酰化、 磷酸化、 去酰胺和糖基化處理等[4-6]。 糖基化處理由于其操作簡單、 改性效果明顯、 安全性高等優(yōu)點得到越來越廣泛的應(yīng)用。 大量研究表明, 糖基化反應(yīng)可以改善食品蛋白質(zhì)的乳化、 起泡、 凝膠等功能性質(zhì), 提高抗氧化性、 消化性等營養(yǎng)特性, 同時降低致敏性, 增強抑菌性和貯藏特性等[4, 7-9]。

糖基化反應(yīng)是指蛋白質(zhì)分子中的氨基與還原糖(葡萄糖、 甘露糖、 半乳糖等)的羰基以共價鍵的形式相結(jié)合的化學反應(yīng)。 美拉德式糖基化反應(yīng)包括早期、 中期和末期三個階段[7]。 糖基化反應(yīng)使得蛋白質(zhì)主鏈或者側(cè)鏈發(fā)生修飾, 改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、 靜電荷和疏水性等, 影響蛋白質(zhì)主鏈和側(cè)鏈基團的化學活性, 進而改變蛋白質(zhì)的理化功能性質(zhì)[10-11]。 目前, 大量學者就糖基化反應(yīng)對各類食品蛋白質(zhì)理化功能性質(zhì)的影響進行了廣泛研究。 為進一步揭示糖基化反應(yīng)誘導蛋白質(zhì)精細分子結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律及調(diào)控蛋白質(zhì)營養(yǎng)、 功能特性的機制, 需要綜合運用多種不同維度的表征和檢測方法進行精準分析。 本文對糖基化食品蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的表征和分析方法進行綜述, 以期為糖基化反應(yīng)及調(diào)控蛋白質(zhì)營養(yǎng)、 功能特性的機制的深入研究提供參考。

1 糖基化反應(yīng)對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響

蛋白質(zhì)是由多種不同氨基酸組成的生物大分子, 其結(jié)構(gòu)復(fù)雜, 易受多種因素影響。 研究表明其空間結(jié)構(gòu)可以分為四個連續(xù)不同的結(jié)構(gòu)水平。 其中一級結(jié)構(gòu)是由不同的氨基酸按照序列編碼組成的線性多肽鏈。 二級結(jié)構(gòu)是多肽鏈中的主鏈通過氫鍵作用彎曲折疊形成的局部空間構(gòu)象, 主要形式為α-螺旋、 β-折疊、 β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)單元。 此外, 還有超二級結(jié)構(gòu)單元, 即以上幾種二級結(jié)構(gòu)單元相互組合在一起[12]。 三級結(jié)構(gòu)則是在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進一步彎曲折疊形成的不同三維空間結(jié)構(gòu), 如球狀、 纖維狀和膜狀, 其主要是由氨基酸側(cè)鏈在疏水相互作用、 范德華力、 氫鍵和靜電相互作用下連接形成[13]。 三級結(jié)構(gòu)可以使蛋白質(zhì)形成一些結(jié)構(gòu)微區(qū), 如疏水區(qū)域和酶活性中心區(qū)域等。 四級結(jié)構(gòu)為多個具有三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈結(jié)合在一起形成的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu), 其通過次級鍵進行連接, 展現(xiàn)復(fù)雜的空間構(gòu)象[14]。 非酶糖基化反應(yīng)過程中因受到多種因素的影響, 蛋白質(zhì)的各水平結(jié)構(gòu)會發(fā)生不同的變化, 同時導致其理化、 功能性質(zhì)的改變。

當條件滿足時, 氨基酸側(cè)鏈的氨基會與還原糖上的羰基進行縮合反應(yīng), 引入糖分子, 使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)構(gòu)成、 分子量和一級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。 Liu等[15]在Co-60伽馬射線(0～25 kGy, 0～50 h)下進行固態(tài)卵清蛋白-葡萄糖混合體系的糖基化反應(yīng), 研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)中自由氨基含量顯著降低, 單體蛋白分子量增大, 表明卵清蛋白發(fā)生了糖基化反應(yīng), 其物質(zhì)分子構(gòu)成發(fā)生了改變。

糖基化反應(yīng)過程中, 尤其是在熱處理下, 蛋白質(zhì)吸收大量熱量, 蛋白質(zhì)分子之間、 蛋白質(zhì)與糖分子之間發(fā)生碰撞, 蛋白質(zhì)發(fā)生聚合、 結(jié)構(gòu)伸展等, 進而導致其空間結(jié)構(gòu)(二級、 三級、 四級結(jié)構(gòu))發(fā)生改變。 Hu等[16]使用干熱處理(60 ℃, 24 h)進行卵清蛋白-葡萄糖的糖基化反應(yīng), 研究發(fā)現(xiàn)卵清蛋白的α-螺旋和不規(guī)則卷曲含量顯著增大, β-轉(zhuǎn)角和β-折疊含量顯著降低, 更多的色氨酸和賴氨酸等被暴露出來, 蛋白質(zhì)的表面疏水性增強, 同時發(fā)生聚集反應(yīng), 表明糖基化反應(yīng)會顯著改變卵清蛋白的二級、 三級和四級結(jié)構(gòu)。 然而, 當向反應(yīng)體系中加入尿素(1～6 mol·L-1)時, 蛋白質(zhì)表面覆蓋一層尿素膜, 其二級、 三級和四級結(jié)構(gòu)的變化被一定程度的抑制。 Wang等[17-18]發(fā)現(xiàn)糖基化反應(yīng)(55 ℃, 1 h)可以使β-乳球蛋白發(fā)生結(jié)構(gòu)伸展和分子間聚集反應(yīng), 蛋白質(zhì)的致敏性降低。 而當反應(yīng)前進行超聲波預(yù)處理時, 蛋白質(zhì)的糖基化反應(yīng)程度、 結(jié)構(gòu)伸展和聚集程度被顯著提高, 蛋白質(zhì)的致敏性降低更為明顯。 Xu等[19]對肌原纖維蛋白-葡聚糖混合溶液進行溫和糖基化反應(yīng)(37 ℃, 8 h), 研究發(fā)現(xiàn)糖基化修飾后肌原纖維蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量顯著降低, 構(gòu)象結(jié)構(gòu)和微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生改變, 從而導致其流變特性和溶解性發(fā)生改變, 其中, 所用葡聚糖分子量越低, 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化越明顯。

眾多研究結(jié)果都表明蛋白質(zhì)在發(fā)生糖基化反應(yīng)后, 其結(jié)構(gòu)會根據(jù)反應(yīng)條件的不同發(fā)生復(fù)雜的變化。 因此, 需要通過多維技術(shù)手段來檢測分析其結(jié)構(gòu)變化規(guī)律, 以進一步了解完整的糖基化反應(yīng)歷程, 揭示反應(yīng)機理。

2 糖基化蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)表征

2.1 糖基化程度及一級結(jié)構(gòu)檢測分析

2.1.1 自由氨基含量測定

蛋白質(zhì)中自由氨基含量是判斷整體糖基化程度的一個重要指標, 相較于對照蛋白, 其含量下降的越多, 表明越多的自由氨基被糖分子占據(jù)。 最常用的自由氨基檢測方法是鄰苯二甲醛(OPA)法。 該法簡便、 高效, 廣泛應(yīng)用于各種加工處理后蛋白質(zhì)的自由氨基含量變化研究。 其原理是OPA中的醛基在堿性(pH 9.5)環(huán)境和強還原劑(巰基乙醇等)存在下與蛋白質(zhì)中的氨基進行反應(yīng), 生成黃色化合物, 通過用分光光度計測定其吸光度值來計算自由氨基含量的變化[20]。 由于易受蛋白質(zhì)聚集引起溶解度降低、 美拉德反應(yīng)產(chǎn)生褐變等影響, 可能導致測量結(jié)果不準確, 可適當根據(jù)樣品狀況進行方法改進或設(shè)置對照組消除干擾。

Xu等[21]研究超聲預(yù)處理對牛血清蛋白、 β-乳球蛋白和β-酪蛋白糖基化反應(yīng)的影響, 采用OPA法檢測發(fā)現(xiàn)超聲波預(yù)處理可以使蛋白質(zhì)的自由氨基含量增大, 然后再糖基化處理可以使自由氨基含量降低到更小值, 促進了蛋白質(zhì)的糖基化反應(yīng)。 Liao等[22]對卵清蛋白進行預(yù)熱處理(20～60 ℃, 1 h)后再糖基化反應(yīng), 通過OPA法檢測發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)預(yù)熱后自由氨基含量增大, 表明預(yù)熱處理可以使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生伸展, 更多的自由氨基暴露出來, 而糖基化反應(yīng)后自由氨基含量的降低程度更大, 表明更多的核糖共價結(jié)合到卵清蛋白的自由氨基上。 Hu等[16]向卵清蛋白樣品中加入尿素發(fā)現(xiàn)其自由氨基含量降低, 然后再加入葡萄糖熱處理, 其糖基化反應(yīng)被抑制。 研究結(jié)果表明尿素通過與卵清蛋白的自由氨基競爭性結(jié)合從而抑制其與葡萄糖的糖基化反應(yīng)。

2.1.2 十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)

由于SDS-PAGE可以將樣品中的蛋白質(zhì)組分根據(jù)分子量大小一一分開, 其廣泛應(yīng)用于分析各種加工處理下蛋白質(zhì)的分子量變化情況[23]。 其機理是蛋白質(zhì)和十二烷基硫酸鈉(SDS)復(fù)合后其凈電荷量的差異可以忽略不計, 此時蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移距離與蛋白質(zhì)的分子量大小呈負相關(guān)。 糖基化反應(yīng)后, 多個糖分子連接到蛋白質(zhì)上, 使蛋白質(zhì)的分子量增大。 此外, 糖基化反應(yīng)中末期常常會引起蛋白質(zhì)聚集, 其二倍體、 三倍體和多倍體聚合物也會清晰地呈現(xiàn)在電泳膠上。 因此, 通過SDS-PAGE可以直接觀察蛋白質(zhì)的糖基化反應(yīng)情況。 SDS-PAGE的缺點是不能對糖基化反應(yīng)程度進行定量。 此外, 一些大分子蛋白質(zhì)與小分子糖結(jié)合或者糖基化程度較低時, 由于糖基化蛋白分子量增加有限, 通過電泳膠不能夠清晰地判斷糖基化反應(yīng)情況, 需結(jié)合其他光譜、 質(zhì)譜等精細化鑒定手段判斷是否有糖基化反應(yīng)發(fā)生及反應(yīng)的程度[16]。

Hu等[24]對比微波和烘箱熱處理對卵清蛋白-葡萄糖糖基化反應(yīng)的影響, 通過SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)單體蛋白的電泳條帶隨著處理時間的延長逐漸上移, 且微波處理下上移更為明顯, 此外, 有大分子量蛋白條帶(>100 KDa)出現(xiàn), 且微波處理下更為濃厚和稠密。 表明隨著處理時間的延長, 蛋白質(zhì)的糖基化反應(yīng)程度逐漸加深, 且發(fā)生了蛋白質(zhì)聚集反應(yīng), 而微波促進了蛋白質(zhì)的糖基化反應(yīng)。 Liu等[25]研究乳清蛋白分別與葡萄糖、 乳糖和麥芽糊精糖基化反應(yīng)(pH 2.0, 90 ℃, 2～24 h)對乳液穩(wěn)定性的影響, 通過SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)其中α-乳白蛋白條帶變淡, β-乳球蛋白的分子量從16.0 KDa增加到接近20 kDa, 最終形成的乳液其表面疏水性和貯藏穩(wěn)定性顯著增強。

2.1.3 質(zhì)譜分析

近年來, 基質(zhì)輔助激光解吸附離子化-飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)、 液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS2)等被用于探索用于蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)分析、 糖基化肽段鑒別、 糖基化位點定位和各位點修飾程度(DSP)定量, 為研究人員揭示蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)及其結(jié)構(gòu)變化提供了強力支撐。 其中較常用的是液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS2)技術(shù)。 首先, 根據(jù)樣品保留時間的不同, 液相色譜將消化后的多肽片段分離開來, 而后樣品通過進樣系統(tǒng)依次進入質(zhì)譜分析系統(tǒng)進行一級、 二級質(zhì)譜采集, 最后通過質(zhì)譜圖分析和數(shù)據(jù)庫比對對各糖基化位點進行鑒定和分析[26]。 常用的串聯(lián)質(zhì)譜肽段碎裂模式包括碰撞誘導解離(CID)、 高能誘導解離(HCD)和電子轉(zhuǎn)移解離(ETD)等[27]。 近年來軌道離子阱質(zhì)譜(LC-Orbitrap-MS2)、 傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜(LC-FTICR-MS2)、 氫氘交換-傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜(HDX-FTICR-MS2)等技術(shù)的出現(xiàn)和成熟應(yīng)用糖基化位點研究更加深入, 可以對各位點的糖分子連接數(shù)和糖基化取代程度進行定量分析, 使揭示蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)機制變得可能[28]。然而, 現(xiàn)階段糖基化蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析仍存在重復(fù)性不高等問題, 需進一步改進分析工具和方法。 近年來出現(xiàn)的ETD和HCD聯(lián)用的質(zhì)譜碎裂技術(shù)EThcD, 可以有效提高糖蛋白質(zhì)組的鑒定通量、 覆蓋深度和位點定位準確度[29-30], 相信該技術(shù)在蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)機制的研究中也將獲得更為廣泛的應(yīng)用。

Yang等[31]研究卵清蛋白與不同種類單糖(核糖、 半乳糖、 木糖、 葡萄糖、 果糖)的糖基化反應(yīng)(37 ℃, 75%濕度, 8 d)機理, 通過LC-HRMS分析得到其糖基化位點數(shù)分別為15, 17, 15, 11和12, 主要發(fā)生在賴氨酸和精氨酸上, 其中醛糖的糖基化程度最高, Lys207為最活躍位點, 其平均DSP值最高。 Liu等[32]研究糖基化、 磷酸化和乙?；磻?yīng)對α-乳白蛋白致敏性的影響, 通過LC-HRMS分析得到其糖基化位點為K13、 K16、 K94、 K98、 K108, 磷酸化位點為Y18、 S22、 Y103、 S112, 乙?；稽c為K13、 T33、 S34、 T38、 S47、 K62、 S69、 S70、 K108、 K114。 研究表明, 通過對這些位點的修飾, 屏蔽了蛋白質(zhì)部分致敏性線性表位, 從而使α-乳白蛋白的致敏性顯著降低。 Liao等[22]研究預(yù)熱處理結(jié)合糖基化反應(yīng)對卵清蛋白IgG/IgE結(jié)合能力的影響, 通過LC-HRMS分析發(fā)現(xiàn)預(yù)熱處理(20～60 ℃, 1 h)可以使卵清蛋白的結(jié)構(gòu)伸展、 糖基化位點微環(huán)境改變, 從而導致新的糖基化位點(K229和 K323)出現(xiàn), DSP值升高, 使一些糖基化位點(K227)由原來的僅結(jié)合1個核糖分子變?yōu)榭梢越Y(jié)合2個核糖分子, 最終導致蛋白質(zhì)IgG/IgE結(jié)合能力下降程度更高。

2.2 二級結(jié)構(gòu)檢測分析

2.2.1 圓二色譜

圓二色譜法是最為廣泛蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析方法, 其原理是蛋白質(zhì)具有圓二色性, 即對組成平面偏振光的左旋和右旋圓偏振光有著不同的吸收系數(shù), 二者之間會形成差值。 以吸收波長為橫坐標, 以吸收系數(shù)差值為縱坐標即可形成圓二色譜圖。 同時, 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)單元α-螺旋、 β-折疊、 β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲在遠紫外區(qū)域有結(jié)構(gòu)特征峰, 利用遠紫外圓二色譜圖可對其二級結(jié)構(gòu)組成進行檢測, 計算出二級結(jié)構(gòu)含量的變化[33]。 圓二色譜法分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的缺點是只能夠?qū)Φ鞍兹芤哼M行檢測, 對不溶解或溶解性差的蛋白無法準確檢測。

Hu等[34]研究卵清蛋白-菊粉的糖基化反應(yīng)(60 ℃, 79%濕度, 2～10 d)及對石榴籽油乳液的理化穩(wěn)定性和氧化穩(wěn)定性的影響。 圓二色譜分析得到糖基化反應(yīng)使卵清蛋白的β-折疊含量顯著增大, α-螺旋、 β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲含量降低, 其誘因是糖基化反應(yīng)引起蛋白質(zhì)分子間氫鍵結(jié)合產(chǎn)生大量β-折疊結(jié)構(gòu)。 最終研究結(jié)果表明糖基化卵清蛋白作為乳化劑可以顯著改善石榴籽油乳液的物理穩(wěn)定性和貯藏穩(wěn)定性。 Shao等[35]研究超聲預(yù)處理(60～150 W·cm-2, 15 min)對β-乳球蛋白-半乳糖糖基化反應(yīng)(55 ℃, 65%濕度, 4 h)及蛋白質(zhì)致敏性的影響。 圓二色譜分析得到糖基化反應(yīng)使β-乳球蛋白的α-螺旋和β-折疊含量顯著增大, β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲含量降低。 二級結(jié)構(gòu)的改變破壞了蛋白質(zhì)的部分過敏性構(gòu)象表位, 使致敏性降低, 而超聲預(yù)處理使α-螺旋含量進一步增大, 無規(guī)卷曲含量進一步降低, 導致致敏性進一步降低。

大量研究結(jié)果表明, 糖基化反應(yīng)傾向于使蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)從不規(guī)則(β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲)向著規(guī)則(α-螺旋和β-折疊)轉(zhuǎn)變, 尤其是顯著增加β-折疊結(jié)構(gòu)。

2.2.2 紅外光譜

紅外光譜法蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)檢測中有著廣泛的應(yīng)用, 其原理是根據(jù)蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)單元中化學鍵的伸縮振動和彎曲振動分析測定。 其中酰胺Ⅰ帶(1 700～1 600 cm-1)可以反映α-螺旋、 β-折疊、 β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)單元的變化, 吸收峰范圍分別為1 660～1 650、 1 640～1 610、 1 700～1 660和1 650～1 640 cm-1[36]。 通過PeakFit軟件進行二階導數(shù)圖譜導出、 去卷積、 數(shù)學擬合等可以分析計算蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化[37]。 紅外光譜法既可以對蛋白溶液進行檢測, 又可以將固體蛋白粉末進行分析。

Wang等[38]研究蛋清蛋白-異麥芽寡糖糖基化產(chǎn)物熱凝膠的分子力和凝膠特性。 通過傅里葉紅外光譜對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進行分析, 研究結(jié)果表明糖基化反應(yīng)后蛋白質(zhì)的分子內(nèi)/分子間β-折疊結(jié)構(gòu)含量增多, 而310-螺旋結(jié)構(gòu)含量減少, 最終導致凝膠中氫鍵和疏水相互作用等非共價鍵增多, 二硫鍵減少, 凝膠斷裂強度和持水性增強。 任孟珂等[36]研究大豆分離蛋白-葡聚糖(2∶1)糖基化反應(yīng)(60 ℃, 1～7 d)對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的影響, 傅里葉紅外光譜檢測發(fā)現(xiàn)糖基化反應(yīng)后大豆分離蛋白的β-折疊和無規(guī)則結(jié)構(gòu)含量升高, α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角含量降低, 結(jié)合其他分析表明糖鏈的引入使蛋白質(zhì)肽鏈展開, 部分內(nèi)部基團暴露出來, 蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象發(fā)生改變, 逐漸由有序轉(zhuǎn)變?yōu)闊o序, 蛋白質(zhì)分子發(fā)生伸展, 柔韌性增強, 構(gòu)象穩(wěn)定性下降, 進而改善了大豆分離蛋白的功能特性。 反應(yīng)3 d后, 大豆分離蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性分別提高了117.53%和134.20%, 反應(yīng)4 d后, 溶解度提高了72.72%。

2.3 三級結(jié)構(gòu)檢測分析

2.3.1 紫外吸收光譜

紫外光譜對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析主要源于蛋白質(zhì)中的發(fā)色基團。 組成蛋白質(zhì)的芳香族氨基酸色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)含有共軛雙鍵, 能夠吸收紫外光, 其峰在280 nm附近, 通過檢測分析反應(yīng)前后蛋白質(zhì)紫外吸收峰的位置和強度變化可以推測糖基化反應(yīng)對蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的影響[39]。

Zhao等[40]研究蛋白質(zhì)預(yù)熱處理(98 ℃, 3～60 min)對牛血清蛋白、 β-乳球蛋白、 β-酪蛋白糖基化(90 ℃)反應(yīng)的調(diào)控影響。 紫外吸收光譜檢測表明預(yù)熱處理可以同時誘導蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)伸展和聚集反應(yīng), 結(jié)合其他檢測發(fā)現(xiàn)當預(yù)熱時間較短時(10 min), 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)伸展導致更多位點暴露, 對糖基化反應(yīng)具有促進作用。 然而, 當預(yù)熱時間較長時(40～60 min), 由于大量的聚集反應(yīng)掩蔽了一些糖基化位點, 從而抑制了蛋白質(zhì)的糖基化反應(yīng)。 Yang等[41]研究超聲預(yù)處理(200～600 W, 30 min)結(jié)合干熱糖基化對β-乳球蛋白IgG和IgE結(jié)合能力的影響, 紫外吸收光譜檢測發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)后最大紫外吸收峰值顯著升高, 表明改變了蛋白的三級結(jié)構(gòu), 引發(fā)了蛋白結(jié)構(gòu)的伸展, 超聲預(yù)處理既可以促進糖基化反應(yīng), 還可以一定程度地破壞部分蛋白質(zhì)過敏性構(gòu)象表位。

2.3.2 內(nèi)源熒光光譜

內(nèi)源熒光光譜是依據(jù)蛋白質(zhì)中色氨酸、 酪氨酸和苯丙氨酸的光學性質(zhì)進行檢測分析。 這些芳香族氨基酸殘基在一定波長的激發(fā)光激發(fā)下會產(chǎn)生熒光, 即為內(nèi)源熒光, 峰值在347 nm附近。 內(nèi)源熒光與氨基酸所處環(huán)境及其極性有密切聯(lián)系, 依據(jù)內(nèi)源熒光光譜的峰位置和強度變化可以判斷蛋白質(zhì)分子三級結(jié)構(gòu)的變化[42-43]。

Wang等[26]研究真空冷凍干燥(-50 ℃, 50 mTorr, 6～48 h)誘導卵清蛋白-核糖(1∶1)的糖基化反應(yīng), 內(nèi)源熒光光譜分析表明隨著真空冷凍干燥時間延長, 蛋白質(zhì)構(gòu)象結(jié)構(gòu)的伸展程度逐漸增大, 更多的色氨酸、 酪氨酸暴露于溶劑環(huán)境并引發(fā)熒光猝滅。 Zhang等[44]研究異槲皮素(12.20～36.59 μmol·L-1)對卵清蛋白-果糖(1∶1)糖基化反應(yīng)(55 ℃, 16 h)的影響, 采用內(nèi)源熒光光譜法測定蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化, 研究結(jié)果表明異槲皮素可以抑制糖基化反應(yīng)、 蛋白質(zhì)構(gòu)象結(jié)構(gòu)伸展以及糖基化反應(yīng)末期產(chǎn)物(AGEs)的生成, 在12.20～24.39 μmol·L-1范圍內(nèi), 其抑制效果隨著異槲皮素濃度的升高而增強。

2.3.3 表面疏水性測定

蛋白質(zhì)表面疏水性測定通常采用ANS熒光探針法, 其機理是ANS熒光探針中帶負電荷的磺酸基可與蛋白質(zhì)帶正電荷的氨基酸(賴氨酸等)結(jié)合, 熒光強度隨著溶劑極性的變化而改變。 通過測量熒光強度可計算和表征蛋白質(zhì)的表面疏水性(H0)和極性的變化, 從而推測糖基化反應(yīng)對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響[45]。 蛋白質(zhì)的表面疏水性與其溶解性、 乳化性、 起泡性等功能性質(zhì)存在密切的聯(lián)系。

Xi等[46]研究不同pH(2～10)條件下, 乳清分離蛋白與不同還原糖(葡萄糖、 乳糖、 葡聚糖)的糖基化反應(yīng)(70 ℃, 3 h)對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和乳化性質(zhì)的影響。 ANS熒光探針法檢測發(fā)現(xiàn)在pH 2～4范圍內(nèi)進行糖基化反應(yīng), 其產(chǎn)物的疏水性顯著大于在pH 6～10范圍內(nèi)。 除pH值外, 其表面疏水性還與參與反應(yīng)的糖種類和糖基化反應(yīng)程度密切相關(guān)。 Wang等[47]研究乳清蛋白-桑葚多糖(1∶1)的糖基化反應(yīng)(60 ℃, 79%濕度, 48, 72 h)對蛋白質(zhì)功能性質(zhì)和抗氧化活性的影響, 表面疏水性檢測表明糖基化反應(yīng)可以顯著降低乳清蛋白的疏水性能, 而乳化性和乳化穩(wěn)定性分別提高為處理前的1.40和1.52倍, 抗氧化能力也顯著增強。 此外, 其包埋魚油形成的乳液具有更小的液滴直徑、 更佳的貯藏穩(wěn)定性和氧化穩(wěn)定性。

2.4 官能團結(jié)構(gòu)檢測分析

有報道采用傅里葉變換紅外光譜和圓二色譜研究人血清蛋白-葡萄糖(1∶1)體系的糖基化反應(yīng)(50 ℃, 20～380 min)進程和產(chǎn)物結(jié)構(gòu)變化。 當反應(yīng)60 min時, 3 300～3 100 cm-1范圍內(nèi)吸收峰增強, 峰寬變大, 表明O—H伸縮振動和游離N—H伸縮振動增強, 這與葡萄糖和游離氨基酸胺基反應(yīng)形成席夫堿有關(guān)。 當反應(yīng)時間在100～140 min范圍, 585 cm-1處的不飽和鍵振動峰藍移至613 cm-1, 表明糖基化反應(yīng)生成了新的不飽和鍵, 其來源于Amadori產(chǎn)物(不飽和烯醇式糖胺), 即美拉德反應(yīng)初期產(chǎn)物; 當?shù)竭_140 min時, 3 300～3 100 cm-1峰強度和和峰寬都達到最大, 即糖基化反應(yīng)完全, 進入美拉德反應(yīng)中期, 此時N—H基團增多, 席夫堿形成糖胺。 在隨后的反應(yīng)中峰強度相應(yīng)減弱, 表明進入美拉德反應(yīng)中后期; 酰胺Ⅰ區(qū)1 660 cm-1處峰隨著糖基化反應(yīng)時間的延長先增大后減小再增大, 表明周圍的基團聚合數(shù)量先增多后減少再增多。 隨著熱處理時間的延長, 初期階段氨基與羥基發(fā)生脫水縮合, 經(jīng)分子重排生成果糖胺, 其酰胺吸收峰增強, 當反應(yīng)到140 min時, 峰值最大, 糖基化程度最大, 糖胺含量最多。 當反應(yīng)到220 min時, 吸收峰值減小, 到達美拉德反應(yīng)中期, 糖胺烯醇化生成醛酮類物質(zhì)。 當反應(yīng)到260 min時, 酰胺吸收帶峰強度又開始增大, 進入美拉德反應(yīng)末期, 蛋白質(zhì)氨基酸與羰基化合物發(fā)生脫羧和脫氨反應(yīng)。

2.5 其他結(jié)構(gòu)檢測分析技術(shù)

其他檢測技術(shù)可以作為補充手段對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化進行研究。 如采用分子排阻色譜(SEC)對反應(yīng)前后蛋白質(zhì)的體積分布進行研究; 采用環(huán)境掃描電鏡(SEM)、 激光共聚焦顯微鏡(CLSM)和熒光顯微鏡對糖基化反應(yīng)前后蛋白質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)變化進行觀察; 采用差示掃描量熱法(DSC)對糖基化蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性變化進行檢測, 間接分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化。

3 總結(jié)與展望

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣, 在糖基化反應(yīng)過程中受到內(nèi)外諸多因素的影響, 其結(jié)構(gòu)會發(fā)生不同的變化。 研究人員應(yīng)充分了解相關(guān)技術(shù)手段的原理, 根據(jù)蛋白質(zhì)樣品特性和研究目的選擇不同的檢測分析方法, 從多結(jié)構(gòu)層次進行全面分析, 準確掌握反應(yīng)過程中蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變過程, 探索基于糖基化反應(yīng)的蛋白質(zhì)改性機理。 此外, 一些新的技術(shù)手段仍需要探索研究蛋白質(zhì)的特定分子結(jié)構(gòu), 如同分異構(gòu)體等的變化。

隨著人們對健康飲食的重視以及對糖基化反應(yīng)研究的深入, 調(diào)控蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)進程、 抑制有害AGEs的生成已成為國內(nèi)外重點攻關(guān)的關(guān)鍵科學問題和技術(shù)問題。 添加化學抑制劑、 選擇特定的加工方法等近年來被用于降低糖基化反應(yīng)位點數(shù)和各位點糖基化反應(yīng)程度, 從而抑制糖基化反應(yīng)和AGEs的生成, 其作用機理是位點競爭和抑制蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)伸展等[16, 44]。 這些技術(shù)方法在市場化推廣應(yīng)用方面仍然存在一定的局限性, 如影響食品風味、 成本高等, 新的經(jīng)濟實用的技術(shù)方法和手段仍需探索。 此外, 糖基化反應(yīng)過程中蛋白質(zhì)精細分子結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變與AGEs生成的聯(lián)系需要深入研究。