楊 青

（武威市藥品檢驗檢測中心，甘肅 武威 733000）

藥品作為一種特殊的商品，關乎人民的身體健康，甚至生命安全，藥品檢驗是藥品質量控制的重要內容，檢驗結果的準確性是藥品檢驗工作的核心內容。傳統(tǒng)的藥品檢驗手段已不能滿足人民的需求，隨著科技水平的日益提升，應運而生了許多新技術新設備，PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈式反應）技術就是其中之一。目前，針對PCR技術在藥品檢驗中的應用進行了許多研究，藥品檢驗法定標準也已收載PCR技術。

Korana于1971年最早提出核酸體外擴增設想，他認為DNA（脫氧核糖核酸）經過變性后與合適的引物雜交，再用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復這個過程就可以克隆tRNA（轉運RNA）基因。Kary Mullis于1985年利用DNA變性、復性原理，發(fā)明了PCR技術。后來，由于Keohanog發(fā)現了耐熱的Taq DNA 多聚酶而使PCR技術被廣泛應用。經過30多年的發(fā)展，PCR技術被多次改進，使其從一種定性的分析方法發(fā)展到定量測定，發(fā)展出了RT-PCR（逆轉錄-聚合酶鏈式反應）、FQ-PCR（實時熒光定量-聚合酶鏈式反應）等十幾種PCR技術。

1 PCR技術原理

PCR技術是一種模擬DNA天然復制過程的體外核酸擴增技術，由變性-退火-延伸3個基本步驟構成，通過變性-退火-延伸過程的不斷重復循環(huán)，短時間內將特定DNA擴增幾百萬倍甚至幾十億倍，使實驗所需要的遺傳物質不再受限于活的生物體。

2 基于PCR技術的分子生物學技術

2.1 FQ-PCR

FQ-PCR（Real-time Fluorescence Quantittative PCR，實時熒光定量PCR），利用熒光能量傳遞技術在PCR反應中加入熒光報告基團或熒光基團，根據熒光信號的累積實時監(jiān)測整個PCR反應進程[1]。FQPCR技術可用于檢測禽源性生物制品和藥品中的微生物檢驗。

2.2 RFLP

RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性內切酶長度多態(tài)性方法），利用限制性內切酶特異性切割待測的DNA片段，通過片段的多樣性比對不同來源基因型差異。RFLP技術可以鑒別中藥材和飲片種屬，也可對摻偽程度進行半定量檢測。

2.3 AP-PCR或RAPD

AP-PCR或RAPD（Arbitrarilyprimed Polymerase Chain Reaction or Random Amplified Polymorphic DNA，隨機擴增多態(tài)性DNA標記），基于PCR技術建立的可對整個序列的基因組進行分析的分子技術，可用于中藥材和飲片真?zhèn)舞b定和親緣關系研究。

2.4 ISSR

ISSR（Inter-simple Sequence Repeat，簡單重復序列間擴增），以錨定的微衛(wèi)星DNA為引物，加入非重復的錨定堿基后進行的PCR擴增。ISSR技術可用于中藥材和飲片鑒別、親緣關系分析和遺傳多樣性研究[2]。

3 PCR技術在藥品檢驗領域中的應用

3.1 PCR技術在中藥鑒定中的應用

傳統(tǒng)的中藥鑒別主要依靠外觀性狀特征，但由于中藥材、飲片及復方中藥制劑等因為成分復雜，產地分散，不同產地的中藥材成分存在很大差異，所以傳統(tǒng)鑒別方法不能夠達到精準鑒別的要求。隨著科學技術日新月異的發(fā)展，PCR技術以其特異性、靈敏性、重復性等優(yōu)點，在藥品檢驗領域占據一席之地，特別是在中藥材和飲片鑒定、生物制品中毒菌種的鑒別及藥品中微生物的快速檢驗等方面發(fā)揮著日益重要的作用，部分方法已被收載入相關標準，這為完善中藥質量評價體系，保證中藥安全、有效、可控提供了新思路新方法。

3.1.1 中藥材和飲片真?zhèn)舞b定

2020年版《中國藥典》就收載了川貝母、石斛、烏梢蛇、金錢白花蛇、蘄蛇5個品種（其中前2個品種用RFLP法，其余品種用PCR法）的PCR技術分子生物學鑒別方法，并把中藥材DNA條形碼分子鑒定法列入指導原則。研究還發(fā)現各類PCR技術均可用于動物類和植物類中藥材和飲片的鑒別，其中：基于正確的引物設計和合適的PCR反應體系建立的特異性PCR技術可用于鑒別平貝母[3]、區(qū)分梅花鹿茸和馬鹿茸[4]等；通過優(yōu)化PCR反應時間的退火溫度、變性溫度、退火時間、變性時間、循環(huán)次數等建立的快速PCR技術可鑒別蛇類中藥烏梢蛇、金錢白花蛇、蘄蛇的真?zhèn)蝃5]；FQ-PCR技術用于鑒別西紅花和紅花源性成分[6]、小活絡丸中的小麥粉摻偽[7]等；RFLP技術可用于鑒別川貝母[8]、西洋參和人參[9]等；RAPD技術可用于鑒別牛蒡子及其混淆品[10]、厚樸正偽品[11]等；ISSR技術可用于鑒別射干及其混偽品鑒別[12]、黃精和卷葉黃精[13]等。

3.1.2 中藥材和飲片遺傳關系和親緣關系

首先是在植物類中藥材中的應用，已有研究發(fā)現利用RAPD技術可對4種10個中韓牛膝類樣品進行遺傳關系研究[14]；ISSR技術可用于研究貴州不同產地的粗毛淫羊藿植物的遺傳多樣性和親緣關系[15]、不同生長環(huán)境中的錦燈籠遺傳多樣性分析[16]，通過研究植物類中藥材遺傳關系和親緣關系，為植物類中藥材和飲片育種選種提供一定的技術指導。其次是在動物類中藥材中的應用，由于動物類中藥材在使用時常常磨成粉末，傳統(tǒng)的鑒別方法不能很好地進行種屬區(qū)分，PCR技術通過親緣關系研究，為動物類中藥材和飲片質量控制提供依據，王自強等[17]就通過常規(guī)PCR和FQ-PCR技術進行親緣關系研究，達到對豬、牛、羊源性成分的鑒定。

3.2 PCR技術在生物制品檢驗中的應用

《中國藥典》2020年版中FQ-PCR檢查法用于禽源性生物制品（即禽源性疫苗）的病毒檢測，特別是流感全病毒滅活疫苗、流感病毒裂解疫苗種子批毒種的外源性禽病毒檢測，使得病毒檢測的方法靈敏度更高、專屬性更強、適用性更廣、可靠性顯著提升，是新版藥典對藥品質量控制手段的進一步補充和完善。

除了《中國藥典》收載的方法，其他PCR技術在藥品檢驗中也被廣泛用于生物制品毒種的遺傳穩(wěn)定性研究。例如，韓劍鋒等[18]采用FQ-PCR技術快速鑒別禽流感滅活疫苗H5、H9、H7亞型，為有針對性地選擇適宜的禽流感滅活疫苗提供了技術支持。劉黎紅等[19]采用相似的RT-PCR法進行毒種基因遺傳穩(wěn)定性研究，發(fā)現對流感減毒活疫苗的生產用工作毒種A擴增10代后獲得與原始種子代次的同源性大于99%的毒株，說明PCR技術可研究毒種的遺傳穩(wěn)定性，在選擇疫苗毒種的傳代次數方面發(fā)揮作用，選擇毒力較小、遺傳穩(wěn)定性好的毒株用于生產減毒活疫苗。閆明科[20]通過利用PCR技術測定維酶素片中是否存在阿氏假囊酵母菌的特異性DNA分子片段，進而達到檢驗維酶素片質量的目的。

3.3 PCR技術在藥品微生物檢驗中的應用

與2020年版《中國藥典》微生物檢驗的傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比，PCR技術具有直觀檢測微生物，重復性好、特異性與敏感性高的優(yōu)點，其在藥品病毒毒種鑒定和菌種鑒定中也有研究，且多采用的是FQ-PCR技術。例如，李秀珍等[21]采用PCR-焦磷酸測序法對藥品中5種致病菌進行快速鑒定，劉婷婷等[22-23]基于FQPCR法快速檢驗藥品中沙門菌和金黃色葡萄球菌，楊飛[24]基于FQ-PCR法快速檢測60批次藥品中的金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌。

4 小結

藥品檢驗是藥品質量控制、監(jiān)督的重要技術手段，更是確保用藥安全的重要環(huán)節(jié)。目前，我國藥品檢驗依據的是《中國藥典》、局頒或部頒以及地方標準，多采用性狀和理化鑒別，利用PCR技術可提高藥品鑒別的準確性。基于PCR技術的分子生物學方法在藥品檢驗中的用途如圖1所示，主要有：①中藥材和飲片鑒定，現有文獻表明，FQ-PCR、RFLP、RAPD、ISSR技術均可作此用途；②植物類和動物類中藥材和飲片遺傳關系研究；③禽源性生物制品的外源性病毒污染檢查，已被《中國》藥典收載的是FQ-PCR；④研究毒種的遺傳穩(wěn)定性，選擇毒力較小、與原始種子同源性高、遺傳穩(wěn)定性好的傳代毒株用于生產減毒活疫苗；⑤利用藥物中含有的特異性DNA分子片段進行藥物質量鑒定；⑥藥品中的菌毒種鑒別。這一方面有效補充了傳統(tǒng)中藥材和飲片形態(tài)鑒別方法的盲區(qū)，另一方面為中藥材育種栽培和減毒活疫苗傳代毒株的選擇提供了有力的技術指導，且實現了菌毒種的快速鑒別。

圖1 PCR技術在藥品檢驗中的應用

同時發(fā)現，基于PCR技術的分子生物學方法在藥品檢驗領域的應用還存在不少問題：①用于中藥材和飲片的PCR鑒別引物有限，導致目前藥品檢驗法定標準收載的可用于PCR鑒別的品種較少；②除《中國藥典》收載的PCR方法外，盡管各類PCR技術在中藥材和飲片鑒別中的研究很多，但如何建立引物及選擇合適的PCR方法研究較少，不同PCR技術在藥品檢驗中的優(yōu)劣勢不明顯；③中藥材種植產地、方法栽培變異等因素不同，中藥材遺傳關系存在差異，導致中藥材和飲片的質量差別較大，影響PCR方法的重現性與穩(wěn)定性；④中藥材和飲片中容易帶有細菌、真菌和寄生蟲等，在PCR擴增過程中如何排除非目標微生物和死菌的干擾的研究較少，而干擾微生物對利用PCR技術進行中藥材和飲片鑒別的準確性影響較大；⑤目前，對藥品中含有的特異性DNA分子片段研究較少，PCR技術不能廣泛用于藥品質量的鑒定；⑥減活疫苗毒種遺傳穩(wěn)定性研究中采用的方法均為RT-PCR法，其他PCR技術研究較少；⑦一般的分子標記鑒別仍需經過DNA的提取、PCR擴增、電泳檢測3個步驟，不能達到中藥材和飲片現場快速鑒別的目的。

文章總結概括了基于PCR技術的分子生物學方法在藥品檢驗領域的主要應用，同時，也提出了PCR技術在藥品檢驗中存在的瓶頸，盡管很多PCR技術方法還未被藥典收錄，但大量的研究已為其在藥品檢驗中的廣泛應用奠定了良好的基礎，具備良好的應用前景，有潛力發(fā)展成為快速、準確、穩(wěn)定的藥品檢驗技術，將在藥品檢驗領域發(fā)揮不可替代的作用。