劉木洪，唐秋霞，覃 亮

(1 云浮市厚德中藥飲片有限公司，廣東 云浮 527300；2 肇慶學院食品與制藥工程學院，廣東 肇慶 526061)

斑禿丸為OTC-乙類藥，收錄于《中國藥典》2020年版一部[1]，此藥是由地黃、熟地黃、制何首烏、當歸、丹參、炒白芍、五味子、羌活、木瓜等九味純中藥制成，具有補益肝腎和養(yǎng)血生發(fā)、治療脫發(fā)性斑禿等功效[2]。丹參，又叫做赤參，紫丹參，紅根、血參根、大紅袍等等，在治療斑禿有其重要作用，也是本要的主要成分之一[3]。在《中國藥典》中針對斑禿丸其中的丹參成分只有薄層鑒別項，并沒有丹參的含量測定項。為更好地控制斑禿丸的內(nèi)在質量，確保臨床療效穩(wěn)定可靠，本試驗采用高效液相色譜法對斑禿丸中丹參酮ⅡA的含量進行研究，旨在為工業(yè)生產(chǎn)及其產(chǎn)品流通控制產(chǎn)品質量提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 實驗儀器

LC-20A高效液相色譜儀，日本島津公司；LC-2010CHT高效液相色譜儀，日本島津公司；XS205電子天平，瑞士梅特勒-托利多；KQ-300VDE6雙頻數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，常洲澳華儀器有限公司，UV-2450紫外分光光度計，日本島津公司。

1.2 藥品和試劑

丹參酮ⅡA對照品(110766-200619)，中國藥品生物制品檢定所；斑禿丸(S08024、S12056、S20845)，廣州白云山敬修堂藥業(yè)有限公司；乙醚，廣州化學試劑廠；甲醇，默克股份有限公司；所用水為蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱定丹參酮ⅡA對照品(批號：110766-200619)10.81 mg，倒入50 mL的容量瓶中，小心加入甲醇至刻度，密塞并進行充分搖勻，然后精密量取溶液1 mL置10 mL量瓶中，加入甲醇至刻度，密塞并進行充分搖勻，即得(每1 mL中含丹參酮ⅡA 0.02162 mg)。

2.2 供試品溶液的制備

取斑禿丸一盒，使用打粉機打粉，使用密封袋裝好，稱取斑禿丸(水蜜丸)10 g，倒入研缽中，進行研碎，加入甲醇60 mL，置于水浴鍋內(nèi)，加熱回流20 min[4]，放冷，使用濾紙進行過濾，把得到的濾液進行蒸干，加入蒸餾水20 mL使殘渣溶解，全部移入分液漏斗中，用乙醚充分提取3次，每次使用乙醚為20 mL。提取完畢后，合并乙醚液，放置，直至乙醚自然揮干，得到的殘渣再加入甲醇使充分溶解，并轉移到10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋到刻度，取續(xù)濾液，即得。

2.3 陰性溶液的制備

除丹參外的其他藥材用粉碎機打碎，依據(jù)藥典中給出處方所示的制備方法制備出陰性對照溶液，再按“2.2”項下方法制成陰性溶液。

2.4 丹參酮ⅡA的含量測定中波長的測定

用紫外分光光度計對丹參酮ⅡA對照品進行掃描，用純化水作為空白溶液，掃描范圍定為220.00～320.00 nm，掃描速度定為快速，采樣間隔定為0.2，自動采樣間隔為停用，掃描模式為單個。測定丹參酮ⅡA對照品的最大吸收峰，參考《中國藥典》2020版一部，確定丹參酮ⅡA的吸收波長為270 nm。

2.5 色譜條件

色譜柱：RP-18 endcapped(5 μm)[5]；流動相：甲醇-水(75∶25)[6]；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；測定波長：270 nm；進樣量：10 μL。

2.6 方法學考察

2.6.1 專屬性實驗

吸取斑禿丸供試品溶液、丹參酮ⅡA對照品溶液以及陰性對照品溶液各10 μL，分別注入色譜儀，按2.5項下色譜條件測定，驗證陰性是否有干擾。

經(jīng)過實驗測定(表1)，可以確定斑禿丸中丹參在擬定的色譜條件中檢測出丹參酮ⅡA峰，而缺丹參藥材的陰性溶液無干擾，滿足后續(xù)實驗要求。

2.6.2 線性關系考察

精密稱量丹參酮ⅡA對照品0.01081 g至50 mL量瓶中，加甲醇溶解至量瓶刻度，搖勻，分別精密量取1、2、3 mL至10 mL量瓶；1、3、5 mL至20 mL量瓶中，加甲醇溶解至量瓶刻度，搖勻，即得6個濃度(0.01081 μg/μL、0.02162 μg/μL、0.03243 μg/μL、0.04324 μg/μL、0.05405 μg/μL、0.06486 μg/μL)的對照品溶液，各進樣10 μL，注入液相色譜儀中按2.5項下擬訂的色譜條件測定。

以丹參酮ⅡA對照品測得的峰面積值(Y)作為縱坐標，以對照品的濃度為橫坐標，從而繪制標準曲線，得回歸方程：y=694355x-7875.2，r2=0.9999(n=6)。結果表明，丹參酮ⅡA進樣量在0.01018～0.06486 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關系，符合外標法定量測定的要求。

2.6.3 精密度試驗

取同一濃度供試品溶液，按擬定的色譜條件連續(xù)進樣6次，測得丹參酮ⅡA的峰面積，計算面積的RSD。根據(jù)中國藥典中規(guī)定含量測定方法學驗證中關于精密度試驗[7]，以及中藥現(xiàn)代質量標準研究對丹參酮ⅡA的含量測定要求，相對標準偏差RSD不得大于3%，結果本實驗關于精密度測得的RSD=0.0426%(n=6)，而且在同一色譜條件下連續(xù)6次對同供試品溶液進樣，最后的峰面積大小非常接近，顯示有良好精密度(結果見表2)。

表2 精密度試驗結果Table 2 Precision test results

2.6.4 穩(wěn)定性試驗

取同一濃度供試品溶液，從制備后，按含量測定方法吸取10 μL，每隔2 h注入液相色譜一次，測定其峰面積值，共6次，計算面積的RSD。

在擬定的同一色譜條件下對同一供試品溶液在不同的時間段，分別進樣進行含量測定，結果丹參酮ⅡA含量的相對標準偏差RSD=0.0273%(n=6)，因此可以認為在12 h內(nèi)，供試品溶液中丹參酮ⅡA含量維持基本的穩(wěn)定，即穩(wěn)定性良好(見表3)。

表3 穩(wěn)定性試驗結果Table 3 Stability test results

2.6.5 重復性試驗

取同一批號的樣品，按“2.2”項下的方法制備供試品溶液，平行地試驗6次，記錄色譜圖峰面積，計算面積的RSD。

6份同一個批號的供試品，在相同的色譜條件下分別進行同法測定，最后的實驗結果表明在取樣量相差很小的情況下，丹參酮ⅡA的平均含量是0.033442%，RSD=0.03%，相對標準偏差比較小，沒有超過藥典中規(guī)定的范圍RSD(3%)，重復性良好(見表4)。

表4 重復性試驗結果Table 4 Repeatability test results

2.6.6 加樣回收試驗

稱取已知含量的樣品(批號為S08024，0.03347 mg/g)約5 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中。精密加入丹參酮ⅡA對照品溶液(0.02162 mg/mL)5 mL與樣品混合，并按“2.2”項下的方法制備溶液，按上述方法配取6份，進樣測定，按外標法計算回收率。

對同一批相同濃度供試品進行6次回收率試驗。對照品和樣品的丹參酮ⅡA含量之和在線性范圍內(nèi)，結果表明，6次測得丹參酮ⅡA的平均回收率為97.4%，RSD=0.15%，測得結果不超過規(guī)定的平均回收率95%～105%范圍，表明該方法可行(見表5)。

表5 加樣回收試驗結果Table 5 Sample recovery test results

2.6.7 樣品含量測定

取三個批號樣品(S08024、S1205、S20845)，每個批號的供試品平行取兩份，按照“2.2”項下的方法制備供試品溶液，分別吸取三種不同批號的供試品溶液各10 μL注入液相色譜儀中按“2.5”項下擬訂的色譜條件進行測定。

取三個批號樣品(S08024、S12056、S20845)，按擬定的同一色譜條件進行含量測定，結果三個批號的斑禿丸中丹參酮ⅡA的含量略有不同，但是RSD都較小，表明該方法穩(wěn)定，且可行(見表6)。

表6 斑禿丸含量測定結果Table 6 Determination results of the content of alopecia areata

3 結 論

本實驗確立了斑禿丸中丹參成分丹參酮ⅡA的含量測定的方法。通過采用RP-18 endcapped(5 μm)色譜柱，運用甲醇和水為流動相，比例為甲醇-水(75∶25)，并以270 nm為檢測波長測定斑禿丸中丹參酮ⅡA的含量，丹參酮ⅡA濃度的線性關系良好；實驗重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、精密度結果良好。該方法為以后的生產(chǎn)及流通控制斑禿丸質量提供了參考。