秦坤良

(通標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司廣州分公司，廣東 廣州 510663)

膳食纖維包含兩類，一部分是不溶性的植物細(xì)胞壁材料，主要成分為纖維素、木質(zhì)素，另一部分是非淀粉水溶性多糖，如葡聚糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、抗性麥芽糊精和抗性淀粉等。它廣泛存在于蔬菜、谷物、水果等植物源性食物中，根據(jù)其性質(zhì)可以分為可溶性膳食纖維和不溶性膳食纖維。 它在人體中不能被消化，因此也不產(chǎn)生熱量，一度被認(rèn)為是“無營養(yǎng)物質(zhì)”，但研究發(fā)現(xiàn)膳食纖維雖然不被消化，但是其仍然發(fā)揮著重要的生理作用，食用膳食纖維有助于降低膽固醇、血糖，改善腸道功能。目前膳食纖維越來越受到人們的重視，并被營養(yǎng)學(xué)界補充認(rèn)定為是繼蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素、礦物質(zhì)和水之后的“第七類營養(yǎng)素”[1-5]。

作為一種有益的功能性食品成分，隨著人們重視以及食品工業(yè)發(fā)展，其應(yīng)用也越來越廣泛，目前市場上含有膳食纖維成分的功能性食品越來越多，迫切要求一種穩(wěn)定可靠的檢測方法用來保證產(chǎn)品質(zhì)量。

目前膳食纖維的檢測主要有酶重量法(GB5009.88-2014)和酶重量法-液相色譜法(GB/T22224-2008 第二法)來測定。酶重量法主要測定不溶性膳食纖維、可以被乙醇沉淀的可溶性高分子量膳食纖維，不能檢測可溶性低分子量膳食纖維。酶重量法-液相色譜法則適合于測試低分子量的可溶性膳食纖維，如抗性麥芽糊精、低聚果糖、低聚半乳糖、聚葡萄糖和抗性淀粉等物質(zhì)[6]。

筆者在實踐中發(fā)現(xiàn)對于配方比較簡單的產(chǎn)品，采用GB/T22224-2008第二法酶重量法-液相色譜法測低分子量可溶性膳食纖維結(jié)果比較可靠，但對于配方復(fù)雜的產(chǎn)品則很容易出現(xiàn)干擾物質(zhì)影響檢測結(jié)果，如果不能排除干擾，檢測結(jié)果和實際添加量誤差就會很大，嚴(yán)重影響對產(chǎn)品質(zhì)量的評估。

本文重點介紹GB/T22224-2008第二法酶重量法-液相色譜法檢測可溶性膳食纖維中遇到的常見的糖和糖醇干擾和排除研究。

1 實 驗

1.1 儀器和試劑

Agilent 1200系列液相色譜儀配有示差折光檢測器；液相色譜柱：凝膠色譜柱6 μm，7.8 mm×300 mm TSK-GEL G2500PWXL 兩根串聯(lián)；分析天平：精密度0.1 mg AB204-S試驗用水：一級水；玻璃柱：75 cm長，內(nèi)徑15 mm，下端1號砂芯，具聚四氟旋塞；堿性離子交換樹脂(OH型)：Alfa Aesar，Amberlite IRA-67(在一級水中溶脹1周，用一 級水洗滌至濾液pH 7～8備用)；酸性離子交換樹脂(Na型)：Amberlite 732，采用如下方法轉(zhuǎn)化H型：取500 g樹脂在一級水中溶脹1周，用一級水漂洗后加1200 mL一級水和400 mL 37%的鹽酸，不時攪拌4 h，一級水漂洗后加2 L水浸泡2 h，重復(fù)一次，漂洗后至濾液pH 4～7備用。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品

抗性麥芽糊精(Resistant maltodextrin，RMD)，CAS.9050-36-6，Sigma；葡萄糖，CAS.50-99-7 純 度>99.5%；丙三醇，CAS.56-81-5，純度>99.5%。

1.3 試驗過程

取試樣兩份平行測試，在α-淀粉酶、蛋白酶和淀粉葡萄糖苷酶依次作用下將樣品中淀粉、蛋白質(zhì)等物質(zhì)溶解為小分子狀態(tài)，酶解液經(jīng)乙醇沉淀、抽濾，用乙醇和丙酮洗滌殘值，干燥稱重后，減去由兩份殘渣測定得到的蛋白質(zhì)和灰分質(zhì)量，計算出不溶性膳食纖維(IDF)和在乙醇中沉淀的高分子量的可溶性膳食纖維(SDF)的總量(IDF+SDF)。抽濾液經(jīng)脫鹽，用高效液相色譜內(nèi)標(biāo)法測定洗脫液中低分子量可溶的膳食纖維，將兩者相加，即可得到樣品中總膳食纖維(TDF)。

1.4 低分子質(zhì)量可溶性膳食纖維溶液的制備

樣品酶解液經(jīng)乙醇沉淀、抽濾，再用20 mL 78%乙醇洗滌殘渣3次，10 mL 95%乙醇洗兩次，10 mL丙酮洗兩次。向濾液中加入10 mL 1%的丙三醇內(nèi)標(biāo)溶液，然后用78%乙醇定容500 mL。取200 mL 50 ℃下旋蒸近干，用一級水定容50 mL。

1.5 脫 鹽

在玻璃柱中加入預(yù)先溶脹好并充分混合的10 g堿性離子交換樹脂(OH型)和10 g轉(zhuǎn)化為H型的酸性離子交換樹脂，先用10 mL水洗滌，然后將上步50 mL溶液加到柱子中，用100 mL 水洗脫，流速0.8 mL/min收集150 mL溶液，50 ℃下旋蒸近干，加少量水轉(zhuǎn)移出定容25 mL，過0.45 μm水相膜，待液相色譜分析。

2 結(jié)果和討論

(1)對可溶性膳食纖維采用高效液相色譜示差折光檢測法檢測，通過凝膠色譜柱分子篩作用，將樣品溶液中目標(biāo)物按分子量大小進行分離，分子量由大到小先后出峰，其典型的色譜圖如圖1所示。

圖1 濃度1%的RMD(抗性麥芽糊精)圖譜Fig.1 RMD (resistantmaltodextrin)with 1% concentration

通過分析含量1%的抗性麥芽糊精標(biāo)準(zhǔn)品可以確認(rèn)聚合度(Degree of Polymerization)DP≥3的可溶性膳食纖維保留時間。圖1所示可溶性膳食纖維部分，其中DP-3峰為麥芽三糖，DP-2峰為麥芽糖，兩者之間峰谷處為DP≥3的積分終點，左側(cè)所有峰面積為可溶性膳食纖維。

在日常檢測工作中，樣品組成成分復(fù)雜，通過對比1% RMD標(biāo)準(zhǔn)品確定樣品中可溶性膳食纖維積分終點的時候，經(jīng)常會遇到干擾峰存在。積分終點存在干擾峰的典型圖如圖2所示。

樣品與標(biāo)準(zhǔn)品RMD疊圖確認(rèn)，該樣品的積分終點處存在一個峰起止跨二糖和三糖保留時間的干擾峰，按此種方式定量，會將一部分干擾峰峰面積計算為可溶性膳食纖維，計算含量是13%，遠(yuǎn)高于樣品理論添加的抗性麥芽糊精的含量4%。

(2)干擾峰的確認(rèn)：圖2中樣品配方發(fā)現(xiàn)除了添加抗性麥芽糊精外，還添加了大量的乳糖醇，乳糖醇的在此條件下的圖譜如圖3所示，和樣品圖譜對比，可以確定圖2中干擾峰為乳糖醇，將圖2中樣品DP≥3的積分點前移至干擾峰起峰位置，將乳糖醇排除后計算結(jié)果為3.9%和理論值4%基本一致。

圖3 乳糖醇出峰位置和RMD(抗性麥芽糊精)標(biāo)準(zhǔn)品疊加圖可以看到在麥芽二糖(DP-2)和三糖(DP-3)之間；0.5%的麥芽糖醇、異麥芽酮糖醇和1% RMD疊圖確認(rèn)麥芽糖醇和異麥芽酮糖醇也會在DP-2和DP-3 之間出峰Fig.3 The peak position of lactitol and the superposition diagram of RMD (resistant maltodextrin)standard can be seen between maltobiose (DP-2)and trisaccharide (DP-3)； 0.5% maltitol，isomalt and 1% RMD overlay confirmed that maltitol and isomalt would also peak between DP-2 and DP-3

取乳糖醇標(biāo)品配制成0.5%的溶液注入液相色譜，和1%的抗性麥芽糊精標(biāo)品疊圖如圖3所示。

(3)考慮到現(xiàn)在產(chǎn)品中經(jīng)常會添加各種糖醇、糖類物質(zhì)，研究了常見糖醇、糖在同樣條件的下圖譜，發(fā)現(xiàn)雙糖類物質(zhì)如乳糖醇，乳糖、異麥芽糖、麥芽糖醇、異麥芽酮糖醇都會存在跨二糖和三糖積分點的情況出峰，都會對積分造成干擾，而單糖或分子量更小的糖醇比如山梨糖醇、赤蘚糖醇、木糖醇、半乳糖醇則不會對積分造成干擾，這些物質(zhì)和麥芽糊精標(biāo)準(zhǔn)圖譜對比如圖4～圖6所示。

圖4 0.5%乳糖和1%RMD疊圖：乳糖會在DP-2和DP-3之間出峰Fig.4 Overlap of 0.5% lactose and 1% RMD： lactose peaks between DP-2 and DP-3

圖5 0.5%蔗糖和1% RMD疊圖：蔗糖在DP-2右側(cè)出峰Fig.5 Overlap of 0.5% sucrose and 1% RMD：Sucrose peaks on the right side of DP-2

圖6 山梨醇、木糖醇、半乳糖醇、赤蘚糖醇出峰均在DP-2右側(cè)Fig.6 The peaks of sorbitol，xylitol，galactitol and erythrose are all on the right side of DP-2

(4)對于配方中添加了會干擾膳食纖維測定的這些糖醇類物質(zhì)，積分時將積分終點前移至干擾物峰起始位置積分，這樣可以排除掉這部分干擾物質(zhì)的影響，計算得到的可溶性膳食纖維結(jié)果會比較準(zhǔn)確。

(5)除了采用積分方式排除干擾，對于含有乳糖的產(chǎn)品也可以用乳糖酶將乳糖酶解成單糖排除干擾，對含有異麥芽糖的產(chǎn)品則也可以用低聚-α-1，6-葡萄糖苷酶將異麥芽糖酶解成單糖排除干擾。但需要注意乳糖酶也可以酶解低聚半乳糖，低聚半乳糖是一種可溶性膳食纖維，如果配方中同時添加了低聚半乳糖，則無法采用乳糖酶酶解排除干擾[7]。

3 結(jié) 論

本文通過對GB/T22224-2008測定低分子量可溶性膳食纖維在實際檢測中經(jīng)常會遇到的糖和糖醇干擾性問題進行了研究和總結(jié)。GB/T22224-2008檢測方法確定可溶性膳食纖維的積分終點主要是通過分析抗性麥芽糊精標(biāo)準(zhǔn)品，依據(jù)麥芽糖(DP=2)和麥芽三糖(DP=3)的位置確定終點，從方法檢測的原理看對于聚合度大于等于3的低聚糖均計算為可溶性膳食纖維，因此對于實際樣品的定量分析，首要是確定聚合度DP≥3的積分位置。

一部分二糖類物質(zhì)可能由于空間結(jié)構(gòu)和麥芽糖(DP=2)不同，此類物質(zhì)在通過凝膠色譜柱中經(jīng)過的路徑和麥芽糖并不完全相同，致使這些物質(zhì)出峰位置會落在麥芽糖和麥芽三糖之間，按照麥芽糖、麥芽三糖兩個峰之間的峰谷確定的積分終點進行積分時，就會將這些物質(zhì)的一部分計算為DP≥3的膳食纖維，導(dǎo)致膳食纖維結(jié)果比實際偏高。

通過對常見的糖和糖醇化合物保留時間的分析，可以確定乳糖、異麥芽糖、乳糖醇，麥芽糖醇、異麥芽酮糖醇會對可溶性膳食纖維的分析造成干擾。日常檢測分析中排除這些添加物的干擾將可以提高膳食纖維測定的準(zhǔn)確度，對于從事膳食纖維檢測的分析工作者具有一定的參考意義。