丁文鋒，羅 培，孫新林，劉欽洲，觀富宜，劉子建，彭 晏，程世超，孫興歡，蔣 舟

(1 深圳市維琪科技股份有限公司，廣東 深圳 518000；2 澳門科技大學(xué)，澳門 999078)

燈盞花乙素，學(xué)名為4,5,6-三羥基黃酮-7-葡糖苷酸，是傳統(tǒng)中藥燈盞花的主要活性成分，在臨床研究中已經(jīng)展示出確切的療效，具有抗氧化、抗炎、抗纖維化、抗凝血及改善循環(huán)等廣泛的藥理活性[1-4]。但燈盞花乙素存在水溶性差，口服生物利用率低，半衰期短等缺點(diǎn)，這限制了其應(yīng)用[5-6]。因此，研究者采用結(jié)構(gòu)修飾或聯(lián)合使用等手段，以期改善燈盞花乙素的應(yīng)用缺陷[7-8]。

RGD多肽是含有精氨酸，甘氨酸，天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)的短肽。多種細(xì)胞上的整合素可以特異性與RGD三肽結(jié)構(gòu)單元結(jié)合。RGD與細(xì)胞中的天然配體蛋白特異性結(jié)合后，會對細(xì)胞附著、增殖、分化和遷移產(chǎn)生關(guān)鍵影響[9-11]。目前，研究者對RGD三肽修飾的新型分子進(jìn)行了大量研究，并取得了顯著的成果，如在抗腫瘤方面發(fā)揮靶點(diǎn)作用、對骨組織成骨細(xì)胞具有促進(jìn)作用等[12-16]。

目前，多肽的化學(xué)合成有液相法、固相法及一些困難肽序合成法[17-18]。我們調(diào)整了RGD的結(jié)構(gòu)，將其與燈盞花乙素結(jié)合，以固相法合成了一種新的肽并進(jìn)行活性研究，發(fā)現(xiàn)它在抗凝方面有著卓越的活性[19]。但在前期合成中，我們遇到了粗肽純度較低和純化效率低下的問題。因此，我們對這個新結(jié)構(gòu)肽進(jìn)行工藝方面的研究，為后續(xù)的產(chǎn)業(yè)化提供參考。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

Am樹脂(Amide Resin，1.58 mmol/g)，西安藍(lán)曉科技新料材股份有限公司；燈盞花乙素，陜西博林生物科技有限公司；Fmoc-Linker-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-HomoArg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH，上海吉爾；所用試劑如無特殊說明均為分析純，溶劑按常規(guī)方法進(jìn)行處理干燥。

所用儀器包括：U3000高效液相色譜儀，賽默飛；U3000制備液相色譜儀，江蘇漢邦；AV-400核磁共振波譜儀、ma Xis impact型高分辨電噴霧四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀，德國 Bruker；R1001-VN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州長城科工貿(mào)；FD-1C-50凍干機(jī)，北京博醫(yī)康。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肽樹脂的偶聯(lián)

稱取35 g Am樹脂，加入固相合成反應(yīng)柱中。用200 mL DMF洗滌樹脂1次，200 mL DCM溶脹樹脂30 min，抽走溶劑。200 mL DMF洗滌樹脂3次。

稱取44.7 g的Fmoc-Linker-OH，8.2 g的HOBt加入到三角燒瓶中，加入100 mL的DMF進(jìn)行攪拌溶解，置于冰箱冷藏。10 min后取出上述溶液加入10.2 mL DIC活化10 min。然后將活化完成的反應(yīng)液加入到反應(yīng)柱中，補(bǔ)加100 mL的DMF，通入氮?dú)夤呐?，室溫反?yīng)2.5 h。

加入乙酸酐(5 eq)、DIPEA(1 eq)、200 mL DMF混合液封閉2 h后，用200 mL DMF洗滌樹脂4次。抽走溶劑。

Fmoc-Linker-Amide Resin用200 mL 20%哌啶/DMF脫Fmoc兩次，每次10 min，抽干溶劑。接著加入200 mL DMF，通入氮?dú)夤呐荩瑪嚢?～2 min，抽干3 min。重復(fù)洗滌樹脂6～7次。

稱取21 g的Fmoc-Trp(Boc)-OH，11.5 g的HOBt加入三角燒瓶。加入DMF使其溶解，置于冰箱冷藏。10 min后取出上述溶液加入14.3 mL的DIC活化10 min。將活化后的氨基酸加入脫保護(hù)后的樹脂中，通入氮?dú)夤呐?，反?yīng)2 h。用Kaiser法檢測樹脂，若溶液淡黃或淺綠，樹脂透亮無色則視為反應(yīng)結(jié)束。抽走反應(yīng)液，加入200 mL DMF，通入氮?dú)夤呐?，攪拌，樹脂和溶劑均勻混合后，抽干溶劑。反?fù)上述操作6～7次。

以相同的方法依次投料反應(yīng)，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-HomoArg(Pbf)-OH、燈盞花乙素。

最終將樹脂洗滌完全后，加入200 mL甲醇，攪拌，通入氮?dú)夤呐荩? min后抽干溶劑。再次加入200 mL甲醇，重復(fù)以上操作，直至溶劑完全抽干。將樹脂倒出至托盤晾干，碾碎。得到燈盞花乙素-HomoArg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp(Boc)-Linker-Amide Resin。

1.2.2 肽樹脂的裂解

預(yù)先將三氟乙酸和異丙醚冷凍后，稱取一定量的樹脂，加入圓底燒瓶中。配制對應(yīng)裂解液混合均勻后加入裝有樹脂的圓底燒瓶中，攪拌反應(yīng)一定時間。抽濾除去樹脂，用三氟乙酸洗滌樹脂，合并濾液。旋蒸除去絕大部分的裂解液，將剩余裂解液緩慢倒入盛有冷凍異丙醚的燒杯中，靜置分層，棄去上層清液，加入異丙醚，充分?jǐn)嚢柘礈旌筮M(jìn)行離心。重復(fù)多次，烘干，得到燈盞花乙素-HomoArg-Gly-Asp-Trp-NH2粗肽。

1.2.3 粗肽純化和凍干

利用分析型高效液相色譜儀對獲得的粗肽進(jìn)行檢測分析，利用制備型高效液相色譜儀進(jìn)行純化。使用醋酸和水將多肽樣品溶解，使用0.45 μm的濾膜進(jìn)行過濾。

分析型高效液相色譜儀采用C18反相柱(5.0 mm×150 mm，5 μm)，流動相A為0.1%的TFA水溶液，流動相B為乙腈，流速為1 mL/min，檢測波長設(shè)置為215 nm。根據(jù)分析型高效液相色譜儀檢測目標(biāo)多肽的出峰時間，調(diào)整制備型高效液相色譜儀的洗脫梯度。

收集餾分，利用高效液相色譜儀進(jìn)行檢測，將合格餾分合并，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮除去乙腈和絕大部分水，得到濃縮液。

然后將濃縮液放置于凍干盤中，置于冷凍冰箱放置24 h。待完全凝結(jié)后，放置于凍干機(jī)中凍干(機(jī)內(nèi)調(diào)整溫度-45 ℃)，得到燈盞花乙素-HomoArg-Gly-Asp-Trp-NH2。

2 結(jié) 果

2.1 裂解體系篩選

我們首先針對肽序結(jié)構(gòu)，對裂解體系進(jìn)行了篩選，裂解液的組成有三種，分別為：

A：95% TFA+2.5% Tis+2.5% H2O；

B：90% TFA+2.5% Tis+2.5% H2O+2.5% EDT+2.5%苯甲硫醚；

C：90% TFA+1% Tis+1% H2O+8% 3-巰基丙酸。

考慮到燈盞花乙素為一個多酚羥基化合物，在裂解反應(yīng)過程易被氧化產(chǎn)生氧化性雜質(zhì)，這一方面降低多肽的收率，另一方面很可能對后續(xù)的純化工作造成很大的困擾。因此，選擇合適的裂解體系尤為重要。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)表明，C裂解體系即90% TFA+1% Tis+1% H2O+8% 3-巰基丙酸是最合適的。在此基礎(chǔ)上，繼續(xù)對裂解溫度和反應(yīng)時間進(jìn)行篩選。結(jié)果表明，長期保持低溫會明顯影響裂解的進(jìn)程，導(dǎo)致粗肽沒有完全從肽樹脂上剪切下來；不足的反應(yīng)時間也會影響裂解的完整度，但相較于低溫的反應(yīng)條件并不明顯。所以，在選定裂解液為90% TFA+1% Tis+1% H2O+8% 3-巰基丙酸、反應(yīng)溫度為室溫、裂解時間為2.5 h，我們做了放大實(shí)驗(yàn)，也得到了良好的結(jié)果。裂解實(shí)驗(yàn)篩選結(jié)果如表1所示。

表1 肽樹脂裂解實(shí)驗(yàn)篩選結(jié)果Table 1 Screening results of peptide resin lysis experiment

2.2 純化條件的篩選

我們對制備純化的洗脫梯度也進(jìn)行了不同的嘗試，表2的洗脫梯度無法得到合格的產(chǎn)品餾分，表3的洗脫梯度能夠得到合格的產(chǎn)品餾分。

表2 洗脫梯度1Table 2 Elution gradient 1

表3 洗脫梯度2Table 3 Elution gradient 2

將裂解實(shí)驗(yàn)9的粗肽按照表3梯度進(jìn)行純化，收集合格餾分，凍干得到6.89 g、純度為98.270%的淡黃色粉末。

2.3 表征結(jié)果

燈盞花乙素-HomoArg-Gly-Asp-Trp-NH2的結(jié)構(gòu)如圖1所示?；衔锏慕Y(jié)構(gòu)通過HPLC、NMR及HRESIMS進(jìn)行表征。在1H NMR的譜圖中，δ12.72 ppm處的積分為1個H的單峰為天冬氨酸的羧酸氫位移；10.73 ppm處的積分為1個H的單峰為色氨酸吲哚環(huán)上的NH，在6.79～8.09 ppm處伴隨著的是大量的苯環(huán)的氫信號。在13C NMR的譜圖中，羰基、羧基、酰胺鍵的碳信號均分布在δ167 ppm以上，其中也有部分的苯環(huán)碳信號由于酚羥基中的氧院子或者其他吸電子集團(tuán)的存在，進(jìn)一步的向低場偏移。

圖1 燈盞花乙素-HomoArg-Gly-Asp-Trp-NH2Fig.1 Scutellarin-HomoArg-Gly-Asp-Trp-NH21H NMR (400 MHz，DMSO)δ：12.72 (s，1H，-COOH)，10.73 (s，1H，色氨酸吲哚環(huán)-NH)，9.27 (s，1H，4-Ph-OH)，8.53 (d，J=5.2 Hz，1H)，8.45 (d，J=7.9 Hz，1H)，8.09 (dd，J=14.4，8.2 Hz，1H)，7.93 (d，J=8.8 Hz，2H)，7.73 (d，J=7.9 Hz，1H)，7.52 (d，J=7.8 Hz，1H)，7.39 (s，1H)，7.28 (d，J=8.1 Hz，1H)，7.09 (d，J=1.9 Hz，1H)，7.07 (s，1H)，7.02 (dd，J=14.7，7.0 Hz，2H)，6.92 (t，J=8.5 Hz，4H)，6.79 (s，1H)，5.16～5.77 (m，3H)，4.97 (d，J=7.4 Hz，1H)，4.22～4.40 (m，3H)，4.03 (d，J=9.7 Hz，1H)，3.97 (dd，J=16.6，6.7 Hz，1H)，3.49 (dt，J=16.5，6.7 Hz，3H)，3.20 (dd，J=14.7，4.5 Hz，1H)，2.97 (dd，J=14.8，8.7 Hz，1H)，2.84 (d，J=26.9 Hz，2H)，2.54 (dd，J=15.9，5.6 Hz，1H)，2.44～2.50 (m，4H)，2.22～2.39 (m，1H)，1.46～1.84 (m，2H)，1.14～1.36 (m，4H)；13C NMR (100 MHz，DMSO)δ：182.37(-C=O)，174.93(-COOH)，173.45(-NH-CO)，172.00(-NH-CO)，171.00(-NH-CO)，168.53(-NH-CO)，167.07(-NH-CO)，164.18(O-C-Ph-)，161.77(O-Ph)，157.04(C=NH)，150.95(O-Ph-C)，148.99(O-Ph-C)，146.65(O-Ph-C)，136.02(Ph-C)，130.40(Ph-C)，128.45(Ph-C)，127.31(Ph-C)，123.26(Ph-C)，120.79(Ph-C)，118.28，118.21，116.05，111.24，110.50，105.92，102.23，101.07，94.08，75.60，75.33，72.91，70.49，53.56，52.54，50.31，42.57，31.80，27.40，26.91，22.15；HRESIMS calcd for C45H52N9O17+[M+H]+ 990.3476，found 990.3664。

3 結(jié) 論

本文以常見的9-芴基甲氧基羰基保護(hù)的氨基酸和燈盞花乙素為原料，通過固相合成法制備燈盞花乙素-HomoArg-Gly-Asp-Trp-NH2，并對合成工藝進(jìn)行了研究。相較于早期合成[19]，本文的工藝大大提高了產(chǎn)率，降低了純化制備的難度，為后續(xù)的產(chǎn)業(yè)化和產(chǎn)品推廣奠定了良好的基礎(chǔ)。同時，也為多酚羥基類小分子修飾多肽的固相合成提供了一種更良好的裂解體系及純化條件。