李春燕，張婭楠，薛金濤

(1 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院生物與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，河南 新鄉(xiāng) 453000；2 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453002)

心腦血管疾病指由于高脂血癥、血液黏稠、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓等引起的心臟、腦及全身組織發(fā)生的缺血性或出血性疾病，心腦血管疾病是一類威脅人類健康的常見(jiàn)病[1-4]。課題組前期研究表明參藻籽膠囊對(duì)心腦血管疾病具有良好的預(yù)防和治療作用。參藻籽膠囊是由人參、紅球藻和葡萄籽三味中藥組成的中藥復(fù)方制劑，其中人參的主要活性成分為人參皂苷類，具有增強(qiáng)免疫力、抗衰老和治療心血管疾病等作用[5-6]；紅球藻是一種淡水單胞綠藻，主要藥效成分為蝦青素，具有抗氧化、抗炎、增強(qiáng)免疫力等藥理作用[7-9]；葡萄籽的主要藥效成分為白藜蘆醇，具有抗自由基損傷、保護(hù)心腦血管、降低膽固醇、防止動(dòng)脈粥樣硬化等作用[10-11]。本研究采用正交實(shí)驗(yàn)法分別對(duì)人參、紅球藻和葡萄籽的活性成分提取工藝進(jìn)行優(yōu)選，并篩選最佳輔料和制粒工藝，所制備的顆粒劑穩(wěn)定可行，成藥性良好。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海申生科技有限公司；UV-2700型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司；萬(wàn)分之一電子分析天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：110754-200822)和白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：111535-200502)，中國(guó)食品藥品檢定研究院；蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：A26M7L11981)，上海源葉生物科技有限公司；無(wú)水乙醇(分析純，批號(hào)20150907)，天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；可溶性淀粉、γ-氨基丁酸、羧甲基纖維素鈉和β-環(huán)糊精等，北京索萊寶科技有限公司；腸溶明膠空心膠囊(批號(hào)1387912)，安徽黃山膠囊股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取工藝

人參采用回流提取法，按L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，以人參皂苷含量和干膏重為指標(biāo)，考察乙醇濃度、料液比和提取次數(shù)對(duì)提取效果的影響。紅球藻采用乙醇浸提法，以蝦青素含量和干膏量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按L9(34)正交實(shí)驗(yàn)考察乙醇濃度、提取溫度和提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響。葡萄籽采用乙醇加熱回流法，以白藜蘆醇含量干膏重為指標(biāo)，采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)研究乙醇濃度、料液比和提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響。

1.2.2 人參皂苷含量測(cè)定

取人參皂苷對(duì)照品約16 mg，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解，定容，搖勻，作為對(duì)照品母液備用。精密量取對(duì)照品溶液2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL的對(duì)照品溶液置于100 mL容量瓶中，并用50%乙醇溶液進(jìn)行定容，搖勻。以50%乙醇溶液做空白對(duì)照，在230 nm處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密量取人參皂苷提取液0.5 mL至100 mL量瓶中，50%乙醇溶液定容，搖勻，測(cè)定吸光度，代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算人參皂苷含量。

1.2.3 蝦青素含量測(cè)定

取蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品約10 mg，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，加入無(wú)水乙醇振搖溶解，定容，搖勻，作為對(duì)照品母液備用。精密吸取0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL的對(duì)照品溶液，分別置于10 mL量瓶中，并且用80%乙醇溶液定容至刻度線，搖勻。以80%乙醇溶液做空白對(duì)照，在481 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密量取提取液2.0 mL于10 mL容量瓶中，80%乙醇溶液定容，搖勻，測(cè)定吸光度，代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算蝦青素含量。

1.2.4 白藜蘆醇含量測(cè)定

精密稱取白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品約10.0 mg，置于100 mL容量瓶中，加入無(wú)水乙醇振搖溶解，定容，搖勻，作為對(duì)照品母液備用。精密吸取0.1 mL、0.15 mL、0.45 mL、0.55 mL、0.65 mL對(duì)照品溶液，分別置于10 mL容量瓶中，并用90%乙醇溶液定容至刻度，搖勻。以90%乙醇溶液做空白對(duì)照，在306 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密吸取提取液1 mL于100 mL容量瓶中，用90% 乙醇定容，搖勻，測(cè)定吸光度，代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算白藜蘆醇含量。

1.2.5 干膏的制備

將藥液攪拌均勻，精密量取一定體積(人參-10 mL，紅球藻-15 mL，葡萄籽-15 mL)置已干燥并恒重的坩堝中，在105 ℃下干燥，測(cè)定干膏重量。

1.2.6 制粒工藝及裝膠囊

將不同種類的輔料(CMC-Na、β-環(huán)糊精和可溶性淀粉)分別與提取物干膏以不同比例(1∶1.5、1∶3和1∶6)研磨均勻，用不同比例的乙醇(60%、70%、85%和95%)做潤(rùn)濕劑，擠壓顆粒，在60～70 ℃下干燥，干燥后用不同型號(hào)膠囊殼(0號(hào)、1號(hào)和2號(hào))進(jìn)行填裝。

2 結(jié)果和討論

2.1 人參提取工藝的篩選

取人參皂苷線性溶液，在230 nm處測(cè)定吸光度，以溶液濃度與紫外吸收繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為y= 0.0847x-0.0796，r2=0.9993。結(jié)果表明人參皂苷在3.20～9.61 μg/mL范圍內(nèi)線性良好。

以人參皂苷含量(60%)和干膏重(40%)兩個(gè)指標(biāo)加權(quán)分析，如表1所示。根據(jù)極性(R)大小判斷各因素對(duì)提取工藝的影響大小，極差越大，影響越大，故提取工藝各因素影響大小次序?yàn)橐掖紳舛?提取次數(shù)>料液比。每個(gè)因素下，各水平的比較主要參考均值(K)的大小，均值越大，該因素相應(yīng)的水平提取效果越好，故水提的最佳工藝為使用50%濃度的乙醇，加入10倍量的乙醇，回流提取3次。在大生產(chǎn)中，綜合考慮表1實(shí)驗(yàn)結(jié)果與大生產(chǎn)中的時(shí)間成本和能源消耗，料液比6倍、8倍和10倍間差別不大，故定為6倍料液比更利于實(shí)際生產(chǎn)。

表1 人參提取工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Orthogonal experimental results of extraction process for radix ginseng

2.2 紅球藻提取工藝的篩選

取蝦青素線性溶液，在481 nm處測(cè)定吸光度，以溶液濃度與吸收度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為y=0.0304x+0.2716，r2=0.9993。結(jié)果表明蝦青素在6.24～14.56 μg/mL范圍內(nèi)線性良好。以蝦青素含量(60%)和干膏重(40%)兩個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)兩個(gè)指標(biāo)加權(quán)分析，如表2所示。由極性(R)大小可知，各因素影響大小依次為乙醇濃度>提取溫度>提取時(shí)間，結(jié)合均值(K)綜合分析，最佳提取工藝為乙醇濃度70%，提取溫度65 ℃，提取時(shí)間4.0 h。

表2 紅球藻提取工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental results of extraction process for red algae

2.3 葡萄籽提取工藝的篩選

取白藜蘆醇線性溶液，在306 nm處測(cè)定吸光度，以溶液濃度與吸收度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為y=0.1108x+0.0997，r2=0.9992。結(jié)果表明白藜蘆醇在1.01～6.57 μg/mL范圍內(nèi)線性良好。以白藜蘆醇含量(60%)和干膏重(40%)兩個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)兩個(gè)指標(biāo)加權(quán)分析，如表3所示。由極性(R)大小可知，各因素影響大小依次為乙醇濃度>提取時(shí)間>料液比，結(jié)合均值(K)綜合分析，最佳提取工藝為乙醇濃度80%，加入10倍量的乙醇，回流提取時(shí)間1.5 h。

表3 葡萄籽提取工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal experimental results of extraction process for grape seed

2.4 制粒工藝及膠囊填裝

通過(guò)對(duì)輔料種類(CMC-Na、β-環(huán)糊精和可溶性淀粉)、輔料與藥材干膏比例(1∶1.5，1∶3和1∶6)和潤(rùn)濕劑-乙醇濃度(60%，70%，85%和95%)等工藝的篩選，研究發(fā)現(xiàn)最佳制粒藝為以CMC-Na做為輔料，輔料與藥材干膏比例為1∶6，70%乙醇做潤(rùn)濕劑。將制備好的顆粒分別填裝不同型號(hào)膠囊(0號(hào)、1號(hào)和2號(hào))，0號(hào)膠囊裝量為(0.41±0.01)g，1號(hào)膠囊裝量為(0.31±0.04)g，2號(hào)膠囊裝量為(0.23±0.01)g。參照本處方的臨床用量，用0號(hào)膠囊殼進(jìn)行填裝最合適，劑量為每日3次，每次4粒。

3 結(jié) 論

心腦血管疾病是心血管疾病和腦血管疾病的統(tǒng)稱，一般表現(xiàn)為心臟、大腦以及全身組織發(fā)生缺血性或出血性病變等特征。心腦血管疾病對(duì)人們的生命健康造成重大威脅，特別是對(duì)50歲以上中老年人健康造成嚴(yán)重威脅，其具有高患病率、高致殘率和高死亡率的特點(diǎn)，居各種死因首位，是居民健康的頭號(hào)殺手。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)和社會(huì)的快速發(fā)展以及人口老齡化加劇，心腦血管疾病已成為影響我國(guó)公民健康的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，當(dāng)前即使應(yīng)用先進(jìn)和完善的治療手段，仍可有50%以上的腦血管意外幸存者生活不能完全自理。國(guó)內(nèi)外的經(jīng)驗(yàn)表明，心腦血管疾病高危人群的早期發(fā)現(xiàn)、有效預(yù)防和干預(yù)具有良好的效果，成本效益較好[1-4]。課題組前期研究表明參藻籽膠囊對(duì)心腦血管疾病具有良好的預(yù)防和治療作用。

參藻籽膠囊是由人參、紅球藻和葡萄籽三味中藥組成的中藥復(fù)方制劑，本研究以干膏重及人參皂苷、蝦青素和白藜蘆醇含量為指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)對(duì)各藥材的提取工藝研究，并根據(jù)活性成分的極性、溶解性和穩(wěn)定性及藥材質(zhì)地，選擇不同的提取方法，對(duì)人參采用乙醇回流提取法，紅球藻采用乙醇浸提法，葡萄籽采用乙醇加熱回流法。制劑工藝采用濕法擠壓制粒法分析不同輔料和不同濃度潤(rùn)濕劑的制粒效果。本制劑工藝可行性較強(qiáng)，科學(xué)合理，顆粒成藥性良好。上述工藝制劑方法可進(jìn)一步推廣到中藥其他生產(chǎn)過(guò)程和制劑工藝中，對(duì)于發(fā)展中藥現(xiàn)代化制劑方法，提高中藥制藥行業(yè)的技術(shù)水平具有重要意義。