杜芝霖，伍健，徐鵬，郎錦義

646000 四川 瀘州，西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 腫瘤科（杜芝霖、伍健、郎錦義）；610041 成都，四川省腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，四川省腫瘤醫(yī)院·研究所，四川省癌癥防治中心，電子科技大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療中心/放射腫瘤學(xué)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（徐鵬、郎錦義）

根據(jù)全球癌癥統(tǒng)計(jì)，2020 年有超過604 000 例食管癌新發(fā)病例和544 000 例死亡病例，全球發(fā)病率第七，死亡率第六［1］。中國是食管癌的高發(fā)地區(qū)，2015 年中國癌癥統(tǒng)計(jì)，食管癌的發(fā)病率排名第三，死亡率排名第四［2］。其中，食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是食管癌中最常見的組織學(xué)類型。

ESCC 的早期癥狀并不明顯，許多患者直到癌癥晚期才被明確診斷。盡管近幾十年出現(xiàn)了新的治療策略和方案，但食管癌的預(yù)后仍然很差，5 年生存率約為20%［3-4］。而如今，新輔助放化療（neoadjuvant chemoradiotherapy，NCRT）聯(lián)合根治性食管切除術(shù)已逐漸成為食管癌的主要治療方法［5］。然而，不同患者接受NCRT 的結(jié)果不一樣。獲得病理完全緩解（pathologic complete response，PCR）的患者比未獲得PCR 的患者有更好的生存率［6-7］。但一些臨床參數(shù)例如TNM 分期、腫瘤位置和腫瘤大小等并不能預(yù)測食管鱗癌患者對(duì)NCRT 是否敏感［8］。如何有效地預(yù)測食管鱗癌患者對(duì)NCRT 治療的敏感性是本研究的目的。

隨著高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，對(duì)腫瘤發(fā)生機(jī)制的認(rèn)識(shí)有了很大的提升［9］。有相關(guān)研究提出，一些基因水平的變化可以預(yù)測NCRT 敏感性，這有助于ESCC 患者的個(gè)體化治療［10-11］。如SOX17基因在食管鱗癌患者中的過表達(dá)對(duì)NCRT更為敏感［12］。研究人員也通過建立35 個(gè)基因突變譜的預(yù)測模型，來預(yù)測食管癌患者接受NCRT 治療的敏感性［13］。還有研究發(fā)現(xiàn)了能預(yù)測食管癌患者NCRT 治療敏感性的5 個(gè)基因［14］。因此基因的異常表達(dá)或突變會(huì)影響到患者接受NCRT 的敏感性。在本研究中，通過使用生物信息學(xué)方法，篩選出與食管鱗癌NCRT 治療敏感性相關(guān)的具有預(yù)測價(jià)值的生物標(biāo)志物，并采用免疫組化方法進(jìn)行初步驗(yàn)證，以期獲得新的治療靶點(diǎn)，為食管癌患者的個(gè)體化治療帶來希望。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)源和數(shù)據(jù)處理

從GEO 數(shù)據(jù)庫中篩選與食管鱗癌NCRT 敏感性相關(guān)的數(shù)據(jù)集，納入標(biāo)準(zhǔn)：①提供食管癌患者RNA-Seq 的數(shù)據(jù)集；②包含食管癌NCRT 后不敏感患者的組織與敏感患者的組織。最終篩選出數(shù)據(jù)集GSE45670［15］。

回顧性收集了四川省腫瘤醫(yī)院2017～2021 年食管鱗癌患者的相關(guān)信息。納入標(biāo)準(zhǔn)：① 患者在疾病確診前未進(jìn)行過任何抗腫瘤治療；② 患者年齡18～75 歲，KPS 評(píng)分 ＞ 80；③ 我院初治的中晚期胸段食管鱗癌并且無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者 （cT1b-cT2N+或cT3-cT4任何N），并于我院行NCRT 及手術(shù)治療；④ 所有患者治療前均需完善相關(guān)基線檢查，明確病灶情況。所有患者新輔助同步放化療治療后第28天復(fù)查增強(qiáng)CT 進(jìn)行初次篩選NCRT 敏感性。影像學(xué)提示腫瘤病灶沒有消退，稱之為疾病穩(wěn)定（stable disease，SD）或是腫瘤病灶較前增大，稱之為疾病進(jìn)展（progression disease，PD）的患者歸類于放化療不敏感；影像學(xué)提示腫瘤病灶完全消失，稱之為完全緩解（complete response，CR）或者腫瘤病灶較治療前緩解 ＞ 50%的患者歸類于放化療敏感。放化療后約6 周，患者接受食管鱗癌根治性手術(shù)切除原發(fā)腫瘤以及區(qū)域淋巴結(jié)。術(shù)后病理是否獲得PCR 作為最終劃分食管鱗癌患者接受NCRT 敏感性的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）的獲得及蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）分析

使用R 軟件的“l(fā)imma”包對(duì)GSE45670 數(shù)據(jù)集的NCRT 敏感組和NCRT 不敏感組的 DEGs 進(jìn)行篩選，閾值設(shè)置為P＜ 0.05 和LogFC ＞ 1，并使用“ggplot2”包進(jìn)行了熱圖和火山圖的繪制［16-17］。

將篩選出的DEGs 導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org）進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)分析。通過設(shè)置PPI 最低互作得分（0.4），去除該網(wǎng)絡(luò)中不相關(guān)的節(jié)點(diǎn)，得到初次篩選的PPI 網(wǎng)絡(luò)［18］。將其導(dǎo)入Cytoscape 軟件中將PPI 網(wǎng)絡(luò)可視化。通過Cytoscape 軟件的MCODE 插件進(jìn)一步過濾，設(shè)置MCODE 分?jǐn)?shù) ＞ 4，節(jié)點(diǎn)數(shù) ＞ 5［19］。使用該軟件中Cytohubba 和CytoNCA 兩個(gè)插件，運(yùn)用Degree 算法，篩選出核心差異基因［20-21］。

1.3 構(gòu)建加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）

利用WGCNA 分析方法對(duì)數(shù)據(jù)集GSE45670構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)［22］。首先，篩選出方差前25%的5 837 個(gè)基因。其次，計(jì)算每對(duì)基因之間的皮爾遜相關(guān)性，得到一個(gè)相似性矩陣。第三，使用“pick Soft Threshold”函數(shù)來選擇理想的軟閾值（β = 5）。第四，利用冪函數(shù)將相似度矩陣轉(zhuǎn)換為鄰接矩陣。然后，將鄰接矩陣轉(zhuǎn)換為拓?fù)渲丿B矩陣（topoligical overlap matrix，TOM）。最后，建立了基于TOM 的不相似度（1-TOM）的層次聚類。每個(gè)模塊樹狀圖至少包含50 個(gè)基因，將相似表達(dá)模塊聚類為相同模塊的閾值設(shè)為0.25，最終得到模塊。

1.4 篩選候選基因進(jìn)行基因富集分析

使用R 軟件的“VennDiagram”包，將DEGs 和WGCNA 中相關(guān)度最高的模塊內(nèi)的基因進(jìn)行交叉重疊后，結(jié)合PPI 網(wǎng)絡(luò)中獲得核心基因和候選基因。

對(duì)候選基因進(jìn)行基因通路富集分析，使用R 包“clusterProfiler”和“enrichplot”包對(duì)其進(jìn)行注釋，對(duì)可能參與的生物過程和信號(hào)通路進(jìn)行相應(yīng)的分析［23-24］。

1.5 對(duì)候選基因進(jìn)行生存分析

從TCGA 數(shù)據(jù)庫中篩選食管鱗癌患者行Kaplan-Meier 生存分析，獲得食管鱗癌患者基因表達(dá)水平與生存時(shí)間之間的關(guān)系。在Log-rank 檢驗(yàn)中，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6 基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）9 和醛固酮還原酶（aldo-keto reductase，AKR）1C3 的免疫組化分析

對(duì)已明確診斷為ESCC 患者的活檢樣本進(jìn)行免疫組化分析。采用抗體MMP9（1∶100）和抗體AKR1C3（1∶200）進(jìn)行蘇木精染色。目標(biāo)蛋白的表達(dá)量通過使用Image-Pro Plus 圖像軟件進(jìn)行分析。MMP9 陽性蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中表達(dá)為褐色。AKR1C3 陽性蛋白表現(xiàn)出中度到較強(qiáng)的細(xì)胞質(zhì)反應(yīng)，顏色為褐色。通過測量出每張圖片的累積光密度值 （integrated option density， IOD）以及區(qū)域面積值（area），再計(jì)算出平均光密度值（mean density），即 mean density = IOD/area，此值反映了目標(biāo)蛋白的單位面積濃度。最后取每個(gè)樣本的 3 個(gè)隨機(jī)區(qū)域mean density 的平均值即為此樣本的值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用R 軟件（4.2.1）、Cytoscape 軟件（3.8.0）、ImageProPlus 軟件、String 在線網(wǎng)站（https: //string-db.org/）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用Kaplan-Meier 法進(jìn)行生存分析，并采用Log-rank 檢驗(yàn)。利用TCGA 數(shù)據(jù)集，來獲取相關(guān)候選基因的表達(dá)水平的高低與食管鱗癌患者總生存期之間的關(guān)系。并且對(duì)其進(jìn)行了相應(yīng)曲線的繪制。免疫組化的結(jié)果采用GraphPad Prism 7.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)或雙尾非配對(duì)檢驗(yàn)來確定顯著性水平。本研究中使用的所有數(shù)據(jù)均滿足統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的假設(shè)。所有定量數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差呈現(xiàn)。P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 數(shù)據(jù)收集

從GEO 數(shù)據(jù)庫中篩選得到的數(shù)據(jù)集GSE45670，包含了28 個(gè)食管鱗癌患者的樣本，其中有17 個(gè)食管鱗癌NCRT 治療不敏感的患者和11 個(gè)食管鱗癌NCRT 治療敏感的患者。而臨床樣本共收集了26 例活檢組織標(biāo)本，包括11 例NCRT 治療敏感者，也是影像學(xué)上提示腫瘤病灶CR 的患者，和15 例NCRT治療不敏感者，其中11 例患者影像學(xué)提示腫瘤病灶SD，4 例患者影像學(xué)提示腫瘤病灶PD。

2.2 DEGs 的篩選及PPI 網(wǎng)絡(luò)分析

以LogFC ＞ 1，P＜ 0.05 為閾值，共篩選得到350個(gè)差異基因，其中上調(diào)基因166 個(gè)，下調(diào)基因184 個(gè)（圖1）。

圖1 差異基因篩選結(jié)果Figure 1. Volcano Plot of DEGs

運(yùn)用String 在線數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了350 個(gè)DEGs 的PPI 網(wǎng)絡(luò)，再導(dǎo)入Cytoscape 軟件中，運(yùn)用MCODE 插件進(jìn)行篩選，再使用Degree 算法，運(yùn)用該軟件中的CytoHubba 和CytoNCA 插件最終確定MMP9是該網(wǎng)絡(luò)的核心基因（圖2）。

圖2 由差異基因構(gòu)成的PPI 網(wǎng)絡(luò)Figure 2. Protein-Protein Interaction Networks Composed of Differentially Expressed Genes

2.3 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

WGCNA 是近年來廣泛使用的一種技術(shù)，旨在避免僅僅分析DGEs 而造成忽視核心基因的可能性［25-26］。通過選取相關(guān)系數(shù)為0.85 時(shí)對(duì)應(yīng)的軟閾值為 5（圖3A）構(gòu)建無尺度網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行 WGCNA，再通過動(dòng)態(tài)雜化剪切合并相似的模塊，獲得13 個(gè)模塊（圖3B）。其中沒有被分配到任何集群中的灰色模塊，在本研究中沒有進(jìn)行進(jìn)一步的分析。結(jié)果顯示，紫色模塊與食管鱗癌患者接受NCRT 敏感性的相關(guān)性最高，共159個(gè)基因，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.03；圖3C）。

圖3 構(gòu)建WGCNA 模塊Figure 3. Construction of WGCNA Modules

2.4 獲得候選基因

將紫色模塊中的159 個(gè)基因與350 個(gè)DEGs 進(jìn)行交集，提取到5 個(gè)重疊基因（圖4）。將這5 個(gè)重疊基因與PPI 網(wǎng)絡(luò)中的核心基因結(jié)合，得到6 個(gè)候選基因，包括AKR1C3、GPX2、RRBP1、GSTM3、AKR1C1和MMP9。

圖4 DEGs 和紫色模塊基因的韋恩圖Figure 4．Screening of Candidate Genes: Venn Diagram of Intersections between DEGs and the Purple Module

2.5 候選基因的功能富集分析

這些候選基因共得到335 個(gè)相關(guān)的GO 條目。選出其中10 個(gè)GO 條目（圖5A）。同時(shí)，分別從生物過程、細(xì)胞組分和分子功能這三個(gè)方面選取了相關(guān)的條目（圖5B）?；蚝突蚪M的KEGG 信號(hào)通路分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些基因主要富集于“氧化應(yīng)激反應(yīng)”中，也可能與“細(xì)胞解毒”“細(xì)胞間橋”等途徑有關(guān)（圖5C）。

圖5 候選基因的功能富集分析Figure 5. Functional Enrichment Analysis of the Candidate Genes

2.6 候選基因的生存分析

從TCGA 的食管癌數(shù)據(jù)庫中篩選出81 個(gè)食管鱗癌患者的臨床數(shù)據(jù)來對(duì)這6 個(gè)候選基因進(jìn)行生存分析，通過生成最佳截止點(diǎn)，形成基因高表達(dá)和低表達(dá)兩組。從圖6 可知，AKR1C3和AKR1C1基因高表達(dá)組患者與低表達(dá)組患者相比，總生存率（overall survival，OS）明顯較差，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.011，P= 0.035），而食管鱗癌患者的OS 并不受其它4 個(gè)基因的表達(dá)影響，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞ 0.05）。

圖6 TCGA 數(shù)據(jù)庫中ESCC 中候選基因的Kaplan-Meier 生存曲線Figure 6. Kaplan-Meier Survival Curves of Candidate Genes in ESCC from TCGA Database

2.7 通過免疫組化檢測食管鱗癌標(biāo)本中AKR1C3和MMP9 的表達(dá)

對(duì)GSE45670 數(shù)據(jù)集中6 個(gè)基因的表達(dá)進(jìn)一步分析，P＜ 0.01 被認(rèn)為是基因表達(dá)的顯著性差異，發(fā)現(xiàn)AKR1C3、AKR1C1、MMP9和RRBP1在NCRT 不敏感的組織和NCRT 敏感組織中的表達(dá)差異更為顯著（圖7）。通過對(duì)本研究收集的活檢標(biāo)本進(jìn)行免疫組化分析，與NCRT 敏感的組織相比，NCRT 不敏感組織中AKR1C3 蛋白表達(dá)上調(diào)（圖8）；MMP9 蛋白則在NCRT 敏感組織中表達(dá)上調(diào)（圖9）。

圖7 GSE45670 數(shù)據(jù)集中6 個(gè)候選基因的接受NCRT 食管鱗癌不敏感組織和接受NCRT 食管鱗癌敏感組織之間的基因表達(dá)差異Figure 7．Expressions of 6 Candidate Genes in Non-responder and Responder to NCRT in GSE45670 Dataset

圖8 AKR1C3 在NCRT 敏感組織和 NCRT 不敏感組織表達(dá)水平的比較（DAB 法，×20）Figure 8．Expression Levels of AKR1C3 in Responder and Non-responder to NCRT (DAB, ×20)***P ＜ 0.001.

圖9 MMP9 在 NCRT 敏感組織和 NCRT 不敏感組織表達(dá)水平的比較（DAB 法，×20）Figure 9．Expression Levels of MMP9 in Responder and Non-responder to NCRT（DAB，×20）

3 討 論

本研究利用生物信息學(xué)對(duì)基因集GSE45670 進(jìn)行分析。首先通過DEGs 分析篩選出 350 個(gè)差異基因。其次，基于WGCNA 生物信息學(xué)方法，得出與食管鱗癌放化療治療中異質(zhì)性顯著相關(guān)的159 個(gè)基因，與350 個(gè)DEGs 進(jìn)行交叉，獲得了5 個(gè)重疊基因（AKR1C1、AKR1C3、GPX2、GSTM3、RRBP1）。 同時(shí)，基于350 個(gè)DEGs，生成了相應(yīng)的PPIs 網(wǎng)絡(luò)。利用MCODE、CytoHubba 和CytoNCA 這三個(gè)插件，將其導(dǎo)入Cytoscape 軟件進(jìn)行可視化，得到了1 個(gè)核心基因（MMP9）。最后，得到了6 個(gè)候選基因，包括AKR1C1、AKR1C3、GPX2、GSTM3、RRBP1和MMP9。通過進(jìn)一步對(duì)這6 個(gè)候選基因進(jìn)行功能富集分析發(fā)現(xiàn)，“氧化應(yīng)激反應(yīng)”途徑在其中起著非常重要的作用。放射治療通過多種方式誘發(fā)腫瘤細(xì)胞的死亡，例如產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）、DNA損傷和亞細(xì)胞細(xì)胞器中的應(yīng)激反應(yīng)。ROS 是由電離輻射所誘發(fā)的，不僅與蛋白質(zhì)、DNA 損傷、細(xì)胞膜表面酶和基因組不穩(wěn)定相關(guān)，還引發(fā)損傷修復(fù)，可以破壞氧化還原穩(wěn)態(tài)，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［27-29］。并且化療會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的ROS，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡。該通路對(duì)于癌癥的發(fā)展、治療的耐藥性和基因組的不穩(wěn)定性等方面都有著不可忽視的作用。

同時(shí)，通過設(shè)置P＜ 0.01 為閾值，得出AKR1C3/1、MMP9和RRBP1在GSE45670 數(shù)據(jù)集中NCRT 敏感組和NCRT 不敏感組的表達(dá)差異更為顯著。

RRBP1 是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白，在核糖體結(jié)合、新生蛋白易位以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)中起重要作用。對(duì)于新生蛋白核糖體的結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)，RRBP1 是必不可少［30］。許多研究證實(shí)，RRBP1 在許多惡性腫瘤中過表達(dá)，例如宮頸癌、肺癌、膀胱癌和結(jié)直腸癌，并且影響患者的預(yù)后［31-34］。同時(shí)，也有研究證實(shí)，RRBP1 可能通過調(diào)節(jié)YAP1 的表達(dá)而成為順鉑耐藥的主要驅(qū)動(dòng)因素［35］。這些證據(jù)都說明，RRBP1基因水平的變化與癌癥的發(fā)生發(fā)展具有一定的相關(guān)性。

MMP9 是一種參與多種生物活性的基質(zhì)蛋白酶，是金屬蛋白酶類中分子量最大的一種。MMP9在作用于細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的構(gòu)成和膜蛋白裂解中扮演著重要的角色，它可以切割多種ECM 蛋白來使得ECM 重構(gòu)。MMP9 對(duì)基底膜的降解過程也起著非常重要的作用，基底膜中含有膠原，包括IV 型膠原，而這些膠原可被MMP9 降解，而基底膜破裂通常是腫瘤形成過程中腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵階段［36-37］。目前，有部分研究已經(jīng)證實(shí)，MMP9 在一些惡性腫瘤中過表達(dá)，例如非小細(xì)胞肺癌、宮頸癌和胰腺癌［38-40］。同時(shí)，一些研究提出，MMP9 與放射治療有關(guān)，部分原因是ROS 的形成可以破壞鋅離子和Cys99 之間的相互作用，從而激活MMP9，增加MMP9 的表達(dá)，影響放射治療效果［41-42］。血漿MMP9 水平在肺癌、乳腺癌和肝癌放療期間會(huì)升高［43-44］。在晚期非小細(xì)胞肺癌患者中，血清MMP9 水平在放射治療后顯著降低，但在SD和PD 的患者中，放射治療后的血清MMP9 水平?jīng)]有變化［45］。ESCC 患者NCRT 后，健康食管組織近端甚至遠(yuǎn)端MMP9 水平升高［46］。在最近的一項(xiàng)研究中，研究發(fā)現(xiàn)MMP9 的表達(dá)與小細(xì)胞肺癌患者的順鉑耐藥有關(guān)［47］。因此，MMP9 與癌癥病理廣泛相關(guān)，不僅在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成中發(fā)揮作用，同時(shí)還介導(dǎo)了腫瘤的微環(huán)境。

AKR1C3 是細(xì)胞內(nèi)的一種多功能酶，是AKRs的一員。AKR1C1/3基因具有較高的序列同源性。AKR1C3 主要在內(nèi)分泌器官中表達(dá)，參與腎上腺和腫瘤中類固醇的新生物合成，通過調(diào)節(jié)各種激素的合成以及其與相應(yīng)受體結(jié)合的量，影響了腫瘤的發(fā)生發(fā)展［48］。AKR1C3 表達(dá)也會(huì)影響到與上 皮 間 充 質(zhì)轉(zhuǎn) 化 （epithelial-mesenchymal transitions， EMT）相關(guān)的許多轉(zhuǎn)錄因子，而EMT 也是促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤侵襲的主要作用機(jī)制之一［49］。有相關(guān)研究提出，基因AKR1C3 在乳腺癌和前列腺癌中表達(dá)上調(diào)，是其預(yù)后不良的標(biāo)志［50-51］。在惡性腫瘤細(xì)胞中，AKR1C3基因表達(dá)上調(diào)可消除ROS，積累PGF2，進(jìn)一步刺激MAPK 信號(hào)，防止G2/M 期阻滯或減少凋亡，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，而導(dǎo)致其抗輻射［52-53］。AKR1C3 在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)較高，而在小細(xì)胞肺癌中表達(dá)則相反。而小細(xì)胞肺癌在臨床中通常對(duì)放射治療非常敏感［54］。同時(shí)，AKR1C3 表達(dá)上調(diào)可維持腫瘤細(xì)胞內(nèi)的還原環(huán)境，不僅導(dǎo)致ROS 濃度降低，還可能與多西他賽耐藥和蒽環(huán)類藥物耐藥有關(guān)［55-56］。因此，AKR1C3 不僅與多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，并且與多種抗腫瘤治療也有一定的聯(lián)系。

同時(shí)，本研究通過在食管鱗癌組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組化分析，發(fā)現(xiàn)MMP9 和AKR1C3 蛋白表達(dá)水平差異與ESCC 患者對(duì)NCRT 敏感性具有一定的相關(guān)性。AKR1C3 陽性蛋白在食管鱗癌接受NCRT治療不敏感的組織中有著中度到較強(qiáng)的細(xì)胞質(zhì)反應(yīng)，如圖8 所示。MMP9 陽性蛋白在食管鱗癌接受NCRT 敏感的組織中的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中有著更高的表達(dá)，如圖9 所示。生存分析顯示，AKR1C1 和AKR1C3 高表達(dá)的食管癌患者的OS 低于AKR1C1和AKR1C3 低表達(dá)的食管癌患者。但是，我們的研究也有相應(yīng)的缺陷。首先，與ESCC 患者NCRT 敏感性相關(guān)的樣本數(shù)量是有限的，需要在更大的隊(duì)列中評(píng)估這些基因的疾病預(yù)測效用。其次，本研究提出的生物標(biāo)志物應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以明確其確切的生物學(xué)行為。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，基因MMP9和AKR1C3的異常表達(dá)與ESCC 患者接受NCRT 敏感性的生物學(xué)特性有著密切的關(guān)系，這為實(shí)現(xiàn)食管癌患者個(gè)體化治療提供了線索。

作者聲明：本文全部作者對(duì)于研究和撰寫的論文出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)相應(yīng)責(zé)任；并承諾論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)資料等已按照有關(guān)規(guī)定保存，可接受核查。

學(xué)術(shù)不端：本文在初審、返修及出版前均通過中國知網(wǎng)（CNKI）科技期刊學(xué)術(shù)不端文獻(xiàn)檢測系統(tǒng)的學(xué)術(shù)不端檢測。

同行評(píng)議：經(jīng)同行專家雙盲外審，達(dá)到刊發(fā)要求。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

文章版權(quán)：本文出版前已與全體作者簽署了論文授權(quán)書等協(xié)議。