喬羽，郭亞迪，周忠光，劉旭，董霏雪

150040 哈爾濱，黑龍江中醫(yī)藥大學 基礎醫(yī)學院（喬羽、郭亞迪、周忠光），實驗實訓中心（劉旭）；

150040 哈爾濱，黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院 眼科（董霏雪）

胃癌是臨床常見的惡性消化道腫瘤，據(jù)2020年數(shù)據(jù)顯示，我國胃癌新發(fā)病例占全球總數(shù)量的43.9%，中國已然成為全球胃癌高發(fā)地之一［1］。如何攻克此類惡疾，是當今醫(yī)學界亟待解決的重要課題。真菌入藥在我國歷史悠久，藥用真菌的抗腫瘤活性也日益受到臨床醫(yī)者青睞。樺褐孔菌作為一種珍貴的藥用真菌，現(xiàn)有研究已證實其抗腫瘤潛力巨大，對多種癌細胞均有較強的細胞毒性，可誘導癌細胞凋亡，但其抑癌作用機制尚待進一步揭示［2］。本研究通過建立胃癌荷瘤裸鼠模型，從細胞凋亡及氧化應激的角度探討樺褐孔菌醇提取物的抑瘤作用機制，以期為探尋胃癌的臨床治療新路徑提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

49 只裸鼠（由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供），雄性，實驗動物質(zhì)量合格證號：SCXK（京）

2016-0006。

樺褐孔菌提取物：按照醇提法常規(guī)操作，取樺褐孔菌1kg，加70%乙醇10 L，加蓋常溫浸泡24 小時，100℃加熱回流1 小時提取得到濾液1，殘渣再加70%乙醇，加熱回流1 小時提取得到濾液2，合并濾液1 與濾液2，水浴箱蒸干，成干膏，打粉。人胃癌細胞株BGC-823（中科院上海細胞所）、卡培他濱片（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）、GSH-PX 檢測試劑盒、SOD 檢測試劑盒及MDA 檢測試劑盒購自上海素爾生物科技有限公司、Caspase-9 抗體、P53 抗體、Bcl-2 抗體和Bax 抗體購自愛必信（上海）生物科技有限公司。

1.2 分組及制備模型

49 只裸鼠隨機分為空白組（正常裸鼠）、模型組（植瘤鼠）、陰性對照組（只灌胃溶劑）、西藥組（只灌卡培他濱）、樺褐孔菌醇提取液高劑量組、中劑量組和低劑量組，共計7 組，每組7 只。

除空白組外，在每只裸鼠腋下皮膚接種0.2 mL BGC-823 細胞 （2×107個/mL），每天觀察腫瘤形成情況，第7 日開始可于皮下觸及粟粒樣腫瘤，所有裸鼠模型均制備成功。

1.3 給藥及取材

空白組和模型組不給藥。西藥組每只裸鼠灌胃給藥卡培他濱片0.5 mg/g，按照樺褐孔菌臨床給藥量和樺褐孔菌醇提取物的濃度，經(jīng)人與小鼠換算公式確定［3］，高劑量組灌胃給藥1.56 mg/g，中劑量組灌胃給藥0.78 mg/g，低劑量組灌胃給藥0.39 mg/g，試劑體積0.1 mL/10g，陰性對照組灌胃給藥0.3 %羧甲基纖維素鈉0.4 mL/10g。植瘤后第7 日于皮下可觸及粟粒樣腫瘤時開始給藥，每天一次，連續(xù)21 天。

實驗第22 天，裸鼠摘眼球取血，3 000 rpm 離心10 min，取血清-20℃凍存。處死裸鼠，稱重，摘取瘤塊，用生理鹽水洗滌，然后用濾紙吸干稱重。部分瘤體多聚甲醛溶液固定。

1.4 觀察指標

1.4.1 抑瘤率 肉眼觀察并測量瘤體大小，稱重，根據(jù)公式計算抑瘤率：抑瘤率=（對照組平均瘤質(zhì)量-給藥組平均瘤質(zhì)量）/對照組平均瘤質(zhì)量×100%。

1.4.2 HE 染色觀察腫瘤細胞形態(tài) 取裸鼠瘤塊組織，用10%甲醛固定 1 周，通過常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片（厚度 4 μm）、HE 染色，對裸鼠瘤塊組織進行病理學觀察。

1.4.3 免疫組化法檢測蛋白表達 將腫瘤組織切片，65℃烘干2 h，脫蠟、水化，滴加H2O2，抗原修復，滴加山羊血清封閉10 min，滴加一抗［Caspase-9 抗體（1∶200）、P53 抗體（1∶100）、Bcl-2 抗體（1∶100）、Bax抗體（1∶100）］，裝入濕盒，冰箱4℃過夜，次日37℃復溫，滴加二抗，37℃孵育15 min，加DAB試劑顯色，PBS 沖洗、蘇木素復染，鏡下觀察Caspase-9、P53、Bcl-2 及Bax 的表達情況。

1.4.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測蛋白含量 將血清按照ELISA 試劑盒說明書進行操作，采用酶標儀在450 nm 處測定各孔的光密度（optical density，OD）值。以所測標準品的OD 值為橫坐標，標準品的濃度值為縱坐標，繪制標準曲線，并得到直線回歸方程，將樣品的OD 值代入方程，計算出樣品的濃度。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26.0 軟件進行統(tǒng)計學處理，多組間連續(xù)變量采用單因素方差分析 ，數(shù)據(jù)均以±s表示，以P＜ 0. 05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 樺褐孔菌醇提取物對荷瘤裸鼠腫瘤的抑制作用

通過肉眼觀察，模型組和陰性對照組瘤體最大，10 mm 左右，西藥組和高劑量組瘤體最小，約5～7 mm（圖1）。

圖1 各組瘤體照片F(xiàn)igure 1．Tumors in Different Groups

各組瘤重呈正態(tài)性分布，應用方差分析六組之間瘤重，差異有統(tǒng)計學意義（F= 14.308，P＜ 0.01）。應用最小顯著差異法進行兩兩比較（表1），與模型組瘤重相比，陰性對照組和低劑量組的瘤重差異均無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05），西藥組、高劑量組和中劑量組的瘤重差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。高劑量組的抑瘤率最高，其次是西藥組、中劑量組、陰性對照組和低劑量組。

表1 樺褐孔菌醇提取物抗BGC-823 荷瘤裸鼠的抑瘤率（N = 7）Table 1．Inhibitory Rate of Ethanol Extract of Inonotus obliquus on BGC-823 Tumor-Bearing Nude Mice（N = 7）

2.2 各組腫瘤組織HE 染色結果

HE 染色結果（圖2）可見：模型組腫瘤細胞形態(tài)正常，體積較小，呈圓形或梭形，胞漿稀少，核形態(tài)規(guī)則，濃染，未見細胞變性、壞死；陰性對照組腫瘤細胞形態(tài)正常，未見細胞變性、壞死；西藥組腫瘤組織大面積細胞凝固壞死，部分腫瘤細胞水腫明顯，有新生血管生成，可見炎癥細胞浸潤；高劑量組大量細胞水腫壞死，細胞核破碎消失，腫瘤間質(zhì)血管豐富，壞死細胞周圍可見炎細胞浸潤；中劑量組細胞壞死區(qū)域明顯，大量間質(zhì)血管分布，壞死區(qū)有炎癥浸潤；低劑量組部分區(qū)域細胞出現(xiàn)水腫壞死，有炎癥浸潤。

圖2 光學顯微鏡下各組腫瘤組織病理結構變化（HE 染色，×400）Figure 2．Pathological Changes in Tumors in Different Groups under Optical Microscope (HE Staining, ×400)

2.3 樺褐孔菌醇提取物對腫瘤相關因子的影響

免疫組化圖片可見，Caspase-9 和P53 在西藥組和高、中、低劑量組蛋白染色為棕黃色，細胞質(zhì)和細胞核著色深、表達多，但中、低劑量組蛋白表達有減弱趨勢，模型組和陰性對照組著色淺，弱陽性或陰性表達（圖3、4）；Bax 在西藥組和高、中、低劑量組蛋白染色為棕黃色，細胞質(zhì)和細胞核著色深、表達多，模型組和陰性對照組著色淺，弱陽性表達（圖5）；高、中、低劑量組和西藥組Bcl-2 蛋白表達弱陽性，模型組和陰性對照組蛋白染色深、表達多（圖6）。

圖3 免疫組化染色示樺褐孔菌醇提取物對Caspase-9 的作用（間接標記法，×400）Figure 3．Immunohistochemical Staining Showing the Effect of Ethanol Extract of Inonotus obliquus on Caspase-9(Indirect Labeling Method, ×400)

圖4 免疫組化染色示樺褐孔菌醇提取物對P53 的作用（間接標記法，×400）Figure 4．Immunohistochemical Staining Showing the Effect of Ethanol Extract of Inonotus obliquus on P53 (Indirect Labeling Method, ×400)

圖5 免疫組化染色示樺褐孔菌醇提取物對Bax 的作用（間接標記法，×400）Figure 5．Immunohistochemical Staining Showing the Effect of Ethanol Extract of Inonotus obliquus on BAX (Indirect Labeling Method, ×400)

圖6 免疫組化染色示樺褐孔菌醇提取物對Bcl-2 的作用（間接標記法，×400）Figure 6．Immunohistochemical Staining Showing the Effect of Ethanol Extract of Inonotus obliquus on Bcl-2 (Indirect Labeling Method, ×400)

從圖7 可知，Caspase-9、Bax 和P53 在西藥組和高、中、低劑量組蛋白表達上調(diào)，與模型組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），而在高、中、低劑量組中，三種蛋白表達逐漸減弱；高、中、低劑量組和西藥組Bcl-2 表達下調(diào)，與模型組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），高、中、低劑量組中Bcl-2 蛋白表達呈遞增趨勢。

圖7 免疫組織化學法測樺褐孔菌醇提取物對四種蛋白的細胞平均光密度值Figure 7．Average Optical Density of the Ethanol Extract of Inonotus obliquus on Four Proteins Measured by Immunohistochemistry

2.4 樺褐孔菌醇提取物對荷瘤裸鼠氧化相關細胞因子的影響

與空白組比較，模型組和陰性對照組血清中MDA 含量明顯升高；與模型組比較，西藥組和樺褐孔菌醇提取物各組MDA 表達下降。與空白組比較，模型組和陰性對照組血清中SOD、GSH-PX 含量顯著下降；與模型組比較，西藥組和樺褐孔菌醇提取物各組SOD、GSH-PX 含量均增加，但低劑量組SOD 含量增加的差異無統(tǒng)計學意義（表2）。

表2 樺褐孔菌醇提取物對BGC-823 荷瘤裸鼠氧化相關細胞因子的影響（X ±S，N = 6）Table 2．Effects of Inonotus obliquus on Oxidation-Related Cytokines in BGC-823 Tumor-Bearing Nude Mice（X ±S，N = 6）

3 討 論

樺褐孔菌為多孔菌科褐色臥孔菌屬，是一種多寄生于寒冷地區(qū)白樺樹上的藥食兩用型真菌［4］。自16 世紀，東歐部分國家就將其視為民間珍藥，至今仍廣泛應用于胃癌、腸癌、心臟病、糖尿病等疾病的治療［5］，在俄羅斯更是有“西伯利亞靈芝”的美譽?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌醇提取物可抑制胃癌BGC-823、MGC-803 細胞的增殖及荷瘤裸鼠腫瘤的生長速度［6］。此外，樺褐孔菌乙酸乙酯部位的化學成分對人胃癌 SGC-7901 細胞也有較好的抑制作用［7］。本研究以此為基礎建立BGC-823 胃癌荷瘤裸鼠模型，探究樺褐孔菌醇提取物的抑瘤作用機制。

HE 染色法是病理學中組織切片最常用的染色方法，可以顯示對比正常與病變組織結構形態(tài)異同。通過計算抑瘤率可以從數(shù)值上更直觀反映藥物的抑瘤效果。本研究結果顯示，樺褐孔菌醇提取物能有效破壞腫瘤細胞形態(tài)，促使其變性、壞死，且抑瘤率隨其劑量的上升同步增大，進一步證實了樺褐孔菌醇提取物的抗胃癌作用。

細胞凋亡對癌癥的發(fā)生起負調(diào)控作用，是目前公認的腫瘤抑制機制之一，受Bcl-2 家族、半胱氨酸蛋白酶（Caspase）家族、P53 等多種蛋白的調(diào)控［8］。Bcl-2 家族是內(nèi)源性的線粒體凋亡途徑的關鍵調(diào)控因子，Bcl-2 和Bax 分別為典型的抗凋亡與促凋亡成員，可通過調(diào)節(jié)線粒體功能以調(diào)控細胞凋亡［9］。Bax加速細胞凋亡［10］，而Bcl-2 作用相反，可抑制細胞凋亡［11］。此外，二者任意一方的高表達均可抑制對方基因表達從而影響細胞凋亡［12］。Bax/Bcl-2 比率變化影響線粒體膜的通透性，釋放凋亡效應因子，進而激活Caspase-9。Caspase-9 在內(nèi)源性凋亡途徑中起關鍵作用，位于Caspase 瀑布式活化及家族級酶聯(lián)反應頂端，是凋亡蛋白家族主要成員［13］?；罨腃aspase-9 隨即激活下游Caspase，從而加快細胞凋亡進程［14］。P53基因是一種典型抑癌基因，與線粒體凋亡直接相關，DNA 損傷或致癌因素刺激會激活P53，從而誘導腫瘤細胞生長停滯或誘導細胞凋亡［15］。Bax 和Bcl-2 同為P53 的重要轉(zhuǎn)錄靶點，P53表達上調(diào)可引起B(yǎng)ax 表達上調(diào)和Bcl-2 表達下調(diào)，繼而促使Caspase-9 表達，誘導腫瘤細胞凋亡［16］。本研究結果顯示，樺褐孔菌醇提取物高、中、低劑量組干預調(diào)控的BGC-823 胃癌細胞P53、Bax、Caspase-9表達均明顯上調(diào)，Bcl-2 表達下調(diào)，Bax/Bcl-2 比率增大，提示樺褐孔菌醇提取物可能通過改變線粒體膜通透性，活化凋亡蛋白誘導胃癌細胞凋亡從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

有研究證實腫瘤的發(fā)生發(fā)展與宿主自由基水平關系密切［17］。因此，采用能適當清除自由基的藥物或調(diào)節(jié)自由基機制來預防及治療胃癌具有廣闊的探究空間。SOD 作為一種過氧化物分解酶，是抗氧化的關鍵防御物質(zhì)，機體內(nèi)自由基清除速率與該酶活性呈正相關性，隨其升高而加快［18］。GSH-PX 是廣泛存在的內(nèi)源性抗氧化酶，對維持細胞膜結構與功能的完整性具有重要意義，是衡量機體抗氧化能力指標之一［19］。MDA 是脂質(zhì)過氧化的最終分解產(chǎn)物，其水平升高標志細胞氧化損傷程度加重［20］。在機體穩(wěn)態(tài)下，SOD、GSH-PX 等抗氧化物酶共同參與機體的氧自由基酶防御體系構建，維持機體氧化與抗氧化動態(tài)平衡［21］。當平衡被打破，抗氧化防御體系出現(xiàn)異常時，MDA 等脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物將迅速生成并大量累積，造成細胞氧化損傷，進而推動腫瘤發(fā)生與發(fā)展進程［22］。因此樺褐孔菌醇提取物的抗氧化應激作用可以通過檢測SOD、GSH-PX 和MDA 的含量來間接反映。本研究結果顯示，經(jīng)樺褐孔菌醇提取物干預后，胃癌裸鼠模型中SOD、GSH-PX表達上調(diào)，MDA 表達下調(diào)，表明樺褐孔菌醇提取物可能通過提高胃癌裸鼠抗氧化酶活性、抑制脂質(zhì)過氧化反應及清除自由基等方式抵抗胃癌裸鼠體內(nèi)氧化應激，進而發(fā)揮抗腫瘤作用。

綜上所述，樺褐孔菌醇提取物對胃癌模型有明顯的抑制作用，其發(fā)揮抗胃癌作用的機制可能與調(diào)控細胞凋亡蛋白表達及抗氧化應激相關。該研究為樺褐孔菌醇提取物未來有望成為臨床治療胃癌新藥提供了一定的理論支持，但其作用機制還需深入發(fā)掘，多角度，深層次進一步開展相關實驗，以期為開展臨床應用提供更多證據(jù)支持。

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