林開淼,元曉春,曾泉鑫,徐建國(guó),陳文偉,陳岳民

1 福建師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院,福州 350007 2 武夷學(xué)院旅游學(xué)院,武夷山 354300 3 福建戴云山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局,德化 362500

由于化石燃料與農(nóng)業(yè)化肥的大量使用,大氣中活性氮的沉降量快速增加,預(yù)計(jì)到2050年亞熱帶地區(qū)氮沉降量會(huì)再翻一番[1]?？焖僭黾拥牡两堤岣吡送寥赖h(huán)通量和各種含氮化合物間的轉(zhuǎn)化速率,破壞土壤養(yǎng)分元素的平衡[2],成為影響森林土壤有機(jī)氮循環(huán)及其氮有效性的重要環(huán)境因素。土壤有機(jī)氮占土壤總氮的90%以上,但大部分有機(jī)氮不能被植物和微生物直接吸收,需要通過微生物的礦化作用轉(zhuǎn)化為小分子態(tài)有機(jī)氮和無機(jī)氮成分,才能被植物利用,因此有機(jī)氮礦化速率是決定土壤氮供應(yīng)能力的關(guān)鍵因子[3]。由于有機(jī)氮庫組成十分復(fù)雜,有機(jī)氮來源和分子的類型多樣[4],土壤有機(jī)氮解聚作用成為限制土壤有機(jī)氮礦化的關(guān)鍵過程,直接控制有效性氮來源的“瓶頸”[5]。然而,相對(duì)于無機(jī)氮循環(huán)過程,有機(jī)氮解聚作用仍然是一個(gè)“黑箱”,有機(jī)氮解聚酶對(duì)氮沉降如何響應(yīng)仍有待探明[6]。因此,關(guān)注氮沉降對(duì)森林生態(tài)系統(tǒng)土壤有機(jī)氮解聚作用的影響,有助于理解氮沉降背景下土壤有機(jī)氮礦化和氮素有效性供給的關(guān)鍵過程,進(jìn)而為森林土壤氮素養(yǎng)分的管理和調(diào)控提供一定的實(shí)踐指導(dǎo)。

土壤有機(jī)氮的解聚作用本質(zhì)上是解聚酶將有機(jī)氮大分子聚合物水解,生成能夠被植物吸收的低聚物[7]或者小分子單體,如氨基酸、氨基糖、核酸等[8]。因此,解聚酶是解聚作用強(qiáng)度和方向的關(guān)鍵控制因子,其活性的大小常被用來表征解聚作用的強(qiáng)度[9]。然而解聚酶并不是某一種酶,是能夠?qū)⑼寥篮蠓肿泳酆衔镏鸩剿獾囊幌盗忻竅8],所以解聚作用的研究首先需要明確解聚酶的類型。例如,有研究發(fā)現(xiàn),蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和肽聚糖酶是主要參與有機(jī)氮解聚作用的酶[6]。因此,研究氮沉降下土壤有機(jī)氮解聚酶的活性及其反應(yīng)方向是理解有機(jī)氮解聚作用調(diào)控機(jī)理的關(guān)鍵[5]。溫帶森林土壤的氮添加試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了蛋白酶活性可以作為表征解聚作用的有效指標(biāo)[3]。與溫帶相比,雖然亞熱帶森林土壤相對(duì)富氮,但是該區(qū)域高溫多雨,植被生產(chǎn)力旺盛,對(duì)氮養(yǎng)分的需求更高[10],氮沉降控制亞熱帶森林土壤有機(jī)氮解聚作用的變化可能比溫帶地區(qū)更為復(fù)雜。氮沉降增加了土壤無機(jī)氮,微生物和植物對(duì)土壤有機(jī)氮釋放有效性養(yǎng)分需求降低,但是對(duì)土壤有機(jī)氮解聚酶活性影響并不一致[5]。目前亞熱帶地區(qū)大多數(shù)研究都集中在土壤氮循環(huán)的無機(jī)部分,僅有少數(shù)研究中報(bào)告了有機(jī)氮解聚(蛋白質(zhì))的總速率[11]。因此,亞熱帶森林土壤有機(jī)氮解聚作用如何響應(yīng)及驅(qū)動(dòng)解聚酶活性變化的關(guān)鍵因素仍需要開展更多研究來明確。

黃山松(Pinustaiwanensis)是我國(guó)特有樹種,主要分布在緯度25°—35°,海拔800—1600 m范圍內(nèi),為我國(guó)東部亞熱帶中山地區(qū)森林演替的先鋒樹種。戴云山自然保護(hù)區(qū)內(nèi)分布著我國(guó)東南沿海山地分布最南端、面積最大、保護(hù)最完好的黃山松原生性群落[12]。該區(qū)屬于典型的亞熱帶海洋性季風(fēng)氣候,夏季高溫多雨,土壤風(fēng)化強(qiáng)烈[13]。此外,一般認(rèn)為高海拔地區(qū)土壤氮庫和有效氮含量比低海拔低,植物生長(zhǎng)對(duì)氮素需求較高[14]。隨著全球氣候變化和森林演替,戴云山南北坡黃山松出現(xiàn)枯損、被毛竹林和以殼斗科為代表的山地常綠闊葉林替代等現(xiàn)象,并有持續(xù)擴(kuò)大趨勢(shì)。這可能加大植被對(duì)土壤氮素的需求,甚至造成缺氮的狀況[15],所以在亞熱帶中山較高海拔地區(qū),黃山松土壤有機(jī)氮解聚提供的小分子有機(jī)氮對(duì)維持土壤氮礦化供應(yīng)至關(guān)重要。本研究以福建戴云山自然保護(hù)區(qū)內(nèi)的黃山松林為研究對(duì)象,通過野外模擬大氣氮沉降,分析不同氮添加量對(duì)土壤有機(jī)氮解聚酶活性的影響及其調(diào)控因素,研究結(jié)果有助于揭示土壤有機(jī)氮解聚酶對(duì)氮沉降的響應(yīng)機(jī)理,在維持土壤有效氮含量和提高黃山松生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗(yàn)樣地位于福建戴云山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的黃山松林內(nèi)(25°38′26″N,118°8′26″E),該區(qū)屬于亞熱帶季風(fēng)氣候,年平均氣溫17℃,每年有霧期達(dá)140 d左右,有霜期達(dá)165 d左右。雨量充沛,降雨集中在每年生長(zhǎng)季的3—9月,濕度較大,年相對(duì)濕度平均在80%以上,常年陰雨較多,日照較少,地貌以低山丘陵為主,地帶性土壤為黑云母花崗巖發(fā)育的紅壤,該地區(qū)總氮沉降量為約38 kg N hm-2a-1[16]。樣地優(yōu)勢(shì)樹種為黃山松,林下植被優(yōu)勢(shì)種為箬竹(Indocalamus),伴生植物有山茶花(Camelliaflower)、毛稔(Melastomasanguineum)等。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

于2017年在黃山松林樣地內(nèi)設(shè)置12個(gè)10 m×10 m的模擬氮沉降小區(qū),所有試驗(yàn)小區(qū)朝向東方向,坡度25°—35°,海拔1480 m。黃山松林平均胸徑范圍32.93—36.23 cm,平均樹高16.29—19.21 m,密度720—723 株/hm2,郁閉度0.80—0.83[17]。通過隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)設(shè)置對(duì)照(CT,0 kg N hm-2a-1)、低氮(LN,40 kg N hm-2a-1)和高氮(HN,80 kg N hm-2a-1)3種處理,每種處理4個(gè)重復(fù),每個(gè)試驗(yàn)d小區(qū)周圍都有大于5 m寬的緩沖區(qū)。試驗(yàn)區(qū)從2018年5月開始氮添加,氮添加時(shí)間為生長(zhǎng)季(3—9月),每月進(jìn)行一次,氮添加形式為分析純尿素[CO(NH2)2]。每次將尿素(LN,24.49 g;HN,48.98 g)溶解于20 L去離子水中,用背式噴霧器對(duì)各樣區(qū)進(jìn)行均勻的林下噴灑,對(duì)照樣區(qū)則用等量的去離子水代替尿素溶液進(jìn)行噴灑。

1.3 樣品采集與處理

經(jīng)過2年的氮沉降模擬實(shí)驗(yàn),于2020年4月份在每個(gè)樣區(qū)利用五點(diǎn)混合取樣,去除表面植被后分別鉆取0—10 cm和10—20 cm土層的土壤樣品,帶回實(shí)驗(yàn)室,剔除細(xì)根、碎石等雜質(zhì)后,過2 mm篩后置于4℃冰箱儲(chǔ)存,一部分樣品用于土壤有機(jī)氮解聚酶活性、微生物生物量碳(MBC)和微生物生物量氮(MBN)測(cè)定;另一部分經(jīng)過自然風(fēng)干并過0.125 mm篩,用于測(cè)定土壤基本理化性質(zhì)指標(biāo)。

1.4 土壤分析方法

土壤酶活性的測(cè)定:采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司的試劑盒測(cè)定,按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。在最佳反應(yīng)條件下,采用比色法進(jìn)行酶活性的測(cè)定。蛋白酶包括酸性蛋白酶(ACPT,EC 3.4.23.18)、中性蛋白酶(NPT,EC 3.4.21.14)和堿性蛋白酶(ALPT,EC 3.4.21.14)。參照Ladd和Butler(1972)[21]的方法,采用福林酚比色法測(cè)定;幾丁質(zhì)酶(Chi,EC 3.2.1.14)依據(jù)Wirth和Wolf等(1990)[22]的方法,通過二甲氨基苯甲醛比色法測(cè)定;漆酶(Lac,EC 1.10.3.2)參照Loncar等(2013)的方法,用ABTS氧化法測(cè)定[23];錳過氧化物酶(MnP,EC 1.11.1.13)依照Camarero等(1999)的方法[24],通過愈創(chuàng)木酚比色法測(cè)定;谷氨酰胺酶(GLS,EC 3.5.1.2)參考Shirfrin等(1974)的方法,用奈氏比色法測(cè)定[25];土壤芳基硫酸酯酶(ASF,EC 3.1.6.1)根據(jù)Tabatabai等(1970)的方法,采用對(duì)硝基苯胺比色法測(cè)定[26]。所測(cè)定酶的底物及特征吸收峰如表1所示。

表1 土壤有機(jī)氮解聚酶的種類、縮寫、相應(yīng)底物和特征吸收峰

1.5 土壤分析方法

采用Excel 2013和SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析(Tukey)檢驗(yàn)不同氮添加處理土壤性質(zhì)、有機(jī)氮解聚酶活性的差異顯著性(α=0.05)。利用Canaco 5.0軟件進(jìn)行冗余分析,通過前向選擇的方法探究氮添加處理下影響土壤有機(jī)氮解聚酶活性的關(guān)鍵因子。為消除不同量綱的影響,在進(jìn)行冗余分析前,將環(huán)境因子(土壤性質(zhì)和微生物生物量)的數(shù)據(jù)進(jìn)行z-score標(biāo)準(zhǔn)化;同時(shí),通過方差膨脹系數(shù)(VIF)檢驗(yàn)了這些變量的多重共線性,發(fā)現(xiàn)各因子不存在顯著的關(guān)聯(lián)(VIF<15),符合分析要求[27]。繪圖由Origin 2018軟件完成,圖表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=4)。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮添加對(duì)土壤性質(zhì)的影響

短期氮添加顯著降低0—10 cm土層DOC含量(P<0.05),并顯著增加0—10 cm和10—20 cm土層礦質(zhì)氮含量(P<0.05),但對(duì)DON含量無顯著影響。此外,氮添加顯著增加了10—20 cm土層MBC的含量(P<0.05),但對(duì)土壤pH,TC,TN,TC/TN均無顯著影響(表2)。

表2 氮添加對(duì)土壤性質(zhì)的影響

2.2 氮添加對(duì)土壤有機(jī)氮解聚酶活性影響

氮添加顯著降低了0—10 cm和10—20 cm土層Lac的含量,對(duì)Chi和ASF均無顯著影響(圖1)。同時(shí),氮添加顯著增加了0—10 cm土層MnP含量(P<0.05),但10—20 cm土層低氮處理下MnP含量顯著增加(P<0.05)。此外,氮添加對(duì)表層部分土壤有機(jī)氮解聚活性的影響低于亞表層,其中氮添加對(duì)0—10 cm土層ACPT、ALPT、NPT和GLS均無顯著影響,但10—20 cm土層高氮處理下的ACPT、ALPT、NPT顯著降低,而GLS顯著增加(P<0.05)。

圖1 氮添加對(duì)黃山松0—10 cm和10—20 cm土壤有機(jī)氮解聚酶活性的影響Fig.1 Effect of nitrogen addition on soil organic Nitrogen depolymerase activities of 0—10 cm and 10—20 cm soil layer of Pinus taiwanensis CT: 對(duì)照 control;LN: 低氮 low nitrogen; HN: 高氮high nitrogen; ALPT: 堿性蛋白酶 Alcalase protease; ACPT: 酸性蛋白酶 Acid protease; NPT: 中性蛋白酶 Neutral protease; Chi: 幾丁質(zhì)酶活性Chitinase; GLS: 谷氨酰胺酶 Glutaminase;ASF 芳基硫酸酯酶 arylsulfatase; MnP: 錳過氧化物酶 Manganese peroxidase; Lac: 漆酶活性 Laccase. 其中,Lac酶活性單位為nmol/min /g,MnP為nmol/d/g,其余酶活性單位為μg/h/g. 圖中星號(hào)表示氮處理對(duì)酶活性的影響顯著(*: P<0.05, **: P<0.05),不同小寫字母表示不同氮添加量間差異顯著(P<0.05)

2.3 土壤解聚酶活性的驅(qū)動(dòng)因素

圖2 氮添加對(duì)黃山松0—10 cm和10—20 cm土壤有機(jī)氮解聚酶活性的冗余分析Fig.2 Redundancy analysis of soil organic Nitrogen depolymerase activities of Pinus taiwanensis by simulated nitrogen addition ACPT: 酸性蛋白酶 Acid Protease; NPT: 中性蛋白酶 Neutral Protease; ALPT: 酪蛋白 Alcalase Protease; Chi: 幾丁質(zhì)酶 Chitinase; Lac: 漆酶 Laccase; Mnp: 錳過氧化物酶 Manganese Peroxidase; GLS: 谷氨酰胺酶 D-glutaminase; ASF: 芳基硫酸酯酶 Arylsulfatase

3 討論

3.1 氮添加對(duì)土壤有機(jī)氮解聚酶活性的影響

3.2 氮添加下土壤有機(jī)氮解聚酶活性的調(diào)控因素

盡管已有研究表明土壤底物會(huì)影響有機(jī)氮解聚酶的釋放[9],但在本研究中氮添加對(duì)土壤TC、TN、DOC和DON并沒有顯著影響(表1)。顯然,這些因素對(duì)有機(jī)氮解聚酶的直接影響不顯著,這與武夷山黃山松林研究結(jié)論一致[11]。過去研究認(rèn)為土壤pH控制蛋白水解酶的合成,如LAP氨肽酶、金屬蛋白酶等在土壤pH值為7.2時(shí)活性最大,微生物群落組成受土壤pH值驅(qū)動(dòng)并對(duì)肽酶活性有顯著影響[43]。但是本研究發(fā)現(xiàn)氮添加并未顯著影響土壤pH值。顯然,底物限制和pH值并不是有機(jī)氮解聚活性影響的關(guān)鍵機(jī)制。

土壤微生物生物量是調(diào)控有機(jī)氮解聚酶活性變化的主要因素之一,本研究發(fā)現(xiàn)MBC對(duì)0—10 cm和10—20 cm土層土壤有機(jī)氮解聚酶活性影響最大(圖2)。王麗君等[44]認(rèn)為土壤酶活性和微生物生物量碳氮磷均存在顯著的相關(guān)性,支持了本結(jié)論。郭銀花等[45]發(fā)現(xiàn)氮添加加劇了土壤微生物碳限制,這可能是微生物生物量調(diào)控有機(jī)氮解聚酶活性對(duì)氮添加的響應(yīng)的主要原因。本研究發(fā)現(xiàn)隨著氮添加量增加,土壤MBC和MBN含量先升高后下降(表2),但是大多數(shù)解聚酶活性并沒有呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。因此,MBC并不能完全解釋高氮處理土壤有機(jī)氮解聚酶活性仍然保持較高原因。袁穎紅等[46]研究表明氮添加處理不僅會(huì)增加土壤微生物生物量碳含量,還能提高微生物生物活性和微生物多樣性指數(shù)。因此,微生物多因子的綜合效應(yīng)可能更有助于解釋有機(jī)氮解聚酶活性的變化[44],這是未來進(jìn)一步需要探索的一個(gè)方向。

4 結(jié)論