崔素華 梁 楓 丁伯平 秦亞?wèn)| 汪榮斌 張 瑞

1 安徽中醫(yī)藥高等專科學(xué)?；A(chǔ)教學(xué)部藥理教研室,安徽省蕪湖市 241000; 2 皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系藥理教研室

青錢柳又名搖錢樹、青錢李,是我國(guó)南方的藥食同源植物,系胡桃科青錢柳屬,為國(guó)家二級(jí)保護(hù)樹種。隨著對(duì)青錢柳作用了解的深入,青錢柳被國(guó)家列為功能性食品原料,需求量大大增加。青錢柳的天然活性成分有多糖、三萜、黃酮和酚酸等[1]。我國(guó)自1970年對(duì)青錢柳研究以來(lái)發(fā)現(xiàn)青錢柳有抗氧化、降血糖、降血脂、調(diào)節(jié)免疫力、抗衰老、抑菌等作用[2-5]。

近年來(lái),大量研究表明,合理使用抗氧化劑可以預(yù)防疾病、延緩疾病的發(fā)展進(jìn)程。人工合成的抗氧化劑雖然抗氧化活性強(qiáng),但對(duì)機(jī)體有潛在危害,于是如何從天然產(chǎn)物中提取安全有效的抗氧化物質(zhì)成為抗氧化研究的主要趨勢(shì),準(zhǔn)確評(píng)價(jià)天然植物的抗氧化活性是目前研究的熱點(diǎn)。本文概括了目前青錢柳研究中常用的抗氧化研究方法,有利于青錢柳的進(jìn)一步開發(fā)利用。目前有關(guān)抗氧化活性的檢測(cè)大多采取的是體外抗氧化活性評(píng)價(jià)法、細(xì)胞模型抗氧化活性評(píng)價(jià)法與體內(nèi)抗氧化活性評(píng)價(jià)法。

1 體外抗氧化活性評(píng)價(jià)方法

體外抗氧化評(píng)價(jià)方法實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單快速并且不需要?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn),因此一般首選體外評(píng)價(jià)法對(duì)物質(zhì)的抗氧化活性進(jìn)行初篩。目前常用于對(duì)青錢柳進(jìn)行抗氧化活性檢測(cè)的機(jī)制主要有以下幾種:(1)檢測(cè)樣品清除自由基的能力;(2)檢測(cè)樣品的還原能力;(3)檢測(cè)樣品對(duì)脂類物質(zhì)的氧化抑制能力。

1.1 清除自由基型評(píng)價(jià)方法 自由基由于含有未配對(duì)電子,所以極不穩(wěn)定,其氧化反應(yīng)能力很強(qiáng),能使機(jī)體內(nèi)的大分子物質(zhì)過(guò)氧化,從而導(dǎo)致不可逆性損傷,自由基過(guò)量是許多疾病產(chǎn)生的誘因。清除自由基是抗氧化劑發(fā)揮抗氧化作用的主要機(jī)制,因此評(píng)價(jià)青錢柳的自由基清除能力可以作為評(píng)價(jià)其抗氧化活性的重要指標(biāo)。

1.1.1 清除DPPH自由基評(píng)價(jià)方法:DPPH(二苯代苦味?；杂苫?清除方法由Bios[6]于1958年首先提出, 其自由基非常穩(wěn)定,在乙醇等溶液中顯紫色,在517nm處吸光值很強(qiáng),DPPH清除方法因?yàn)椴僮骱?jiǎn)單快捷,被廣泛應(yīng)用于青錢柳提取物的抗氧化能力測(cè)定。

鄒榮燦等[7]以甲醇定容DPPH溶液,對(duì)不同產(chǎn)地青錢柳多糖進(jìn)行DPPH清除能力研究發(fā)現(xiàn),在0.01～2.0mg/ml濃度范圍內(nèi),青錢柳多糖對(duì)DPPH的清除能力隨多糖濃度的上升而增大,呈一定量效關(guān)系,各產(chǎn)地青錢柳多糖對(duì)DPPH清除能力的差異不明顯,青錢柳的抗氧化能力與其多糖濃度呈劑量關(guān)系。岳喜良等[8]以甲醇定容DPPH溶液,對(duì)青錢柳樣品進(jìn)行DPPH清除能力研究發(fā)現(xiàn),施氮量顯著影響了青錢柳葉中DPPH的IC50(DPPH為50%時(shí)的樣品濃度),DPPH的IC50與黃酮類化合物呈顯著負(fù)相關(guān),低氮處理的青錢柳葉抗氧化能力明顯高于其他實(shí)驗(yàn)組。

DPPH方法簡(jiǎn)單快捷且重現(xiàn)性好,是評(píng)價(jià)青錢柳抗氧化活性應(yīng)用頻率最高的分析方法之一,但是缺點(diǎn)是清除反應(yīng)僅在甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑中發(fā)生, 不能在水溶液中應(yīng)用,針對(duì)這個(gè)缺點(diǎn)部分學(xué)者對(duì)此進(jìn)行了改進(jìn),使其能在水溶液中進(jìn)行測(cè)定。黃四新等[9]通過(guò)改進(jìn)的方法用水將青錢柳化合物稀釋后配制成不同濃度的DPPH溶液進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)化合物濃度與DPPH清除能力呈明顯量效關(guān)系,且都能較快達(dá)到最大清除能力,部分化合物對(duì)DPPH的清除能力強(qiáng)于維生素C。

1.1.2 清除ABTS自由基評(píng)價(jià)方法:ABTS[2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽]自由基清除方法由Marklund[10]于1979年首先提出。ABTS是一種化學(xué)顯色劑,在734nm或414nm處測(cè)定反應(yīng)溶液吸光度即可測(cè)定樣品的抗氧化能力。

TEAC[2,2-連氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)]自由基方法是Miller[11]于1993年開發(fā)的基于ABTS清除自由基的方法,其所用的自由基溶液是預(yù)先反應(yīng)好的溶液,與傳統(tǒng)的ABTS方法相比可以降低植物提取物等抗氧化物質(zhì)中其他化合物的影響。

鄭曉杰等[12]對(duì)青錢柳提取物進(jìn)行ABTS清除能力測(cè)定,發(fā)現(xiàn)青錢柳提取物可有效清除ABTS自由基,且存在采收期和產(chǎn)地變異性。郭彤彤等[13]對(duì)青錢柳黃酮進(jìn)行TEAC法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),樣品的ABTS自由基清除活性呈濃度依賴性變化,證實(shí)青錢柳黃酮在食用大豆油中的應(yīng)用能減緩大豆油的氧化,延長(zhǎng)儲(chǔ)存期限,并且可以預(yù)防人體疾病,避免合成抗氧化劑引起的食品安全問(wèn)題。

ABTS法因?yàn)榭焖俸?jiǎn)便被普遍用于常規(guī)抗氧化劑清除自由基能力的評(píng)價(jià),水溶性化合物和脂溶性化合物都可以測(cè)定。不過(guò)ABTS法本質(zhì)上是用TEAC值來(lái)表征被測(cè)物質(zhì)清除ABTS+·這種自由基的能力, 并不是直接反映被測(cè)物質(zhì)的活力,所以想全面的評(píng)估一種物質(zhì)的抗氧化能力需要結(jié)合其他方法進(jìn)行全方位的測(cè)定。

1.1.3 清除超氧陰離子自由基評(píng)價(jià)方法:超氧陰離子自由基(O2·-)是自由基引起機(jī)體中毒的主要原因,其作為鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引發(fā)劑可以通過(guò)反應(yīng)生成其他自由基,導(dǎo)致多糖解聚、核酸鏈斷裂以及不飽和脂肪酸過(guò)氧化,引起膜損傷、線粒體氧化磷酸化而導(dǎo)致機(jī)體疾病。因此,檢測(cè)青錢柳對(duì)O2·-的清除能力可以用來(lái)評(píng)價(jià)其抗氧化活性。超氧陰離子O2·-評(píng)價(jià)方法是通過(guò)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)還原吩嗪硫酸甲酯-(PMS)生成O2·-,然后和氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)反應(yīng)生成在560nm有強(qiáng)吸收峰的藍(lán)色產(chǎn)物,當(dāng)抗氧化物質(zhì)加入PMS-NADH-NBT體系后,通過(guò)吸光度測(cè)定可以計(jì)算出抗氧化物質(zhì)的清除自由基能力。

胡世一等[14]以維生素C作陽(yáng)性對(duì)照,在536nm處檢測(cè)青錢柳內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物清除O2-·的能力,發(fā)現(xiàn)18株菌株清除O2-·能力普遍較弱,清除率均<50%。黃新月等[15]對(duì)青錢柳多糖的超氧自由基清除能力進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)其清除率隨濃度的增加而增加,呈劑量依賴關(guān)系。同時(shí)多糖的羧甲基化取代度升高后清除率降低,考慮可能與羧甲基化修飾以后青錢柳多糖溶解性降低有關(guān)。

1.1.4 清除羥基自由基評(píng)價(jià)方法:羥基自由基(OH·)是毒性最大的自由基,氧化能力很強(qiáng),帶有一個(gè)不成對(duì)電子,可以引起電子轉(zhuǎn)移、奪取氧原子和羥基化等反應(yīng),與活細(xì)胞中的分子發(fā)生反應(yīng)導(dǎo)致組織脂質(zhì)過(guò)氧化、核酸斷裂、蛋白質(zhì)解聚與聚合、多糖解聚而造成損害。羥自由基清除法也是評(píng)價(jià)青錢柳體外抗氧化活性比較常用的方法。

劉賢賢等[16]對(duì)65%甲醇的青錢柳葉浸膏進(jìn)行羥自由基清除能力測(cè)定,發(fā)現(xiàn)在相同實(shí)驗(yàn)條件下,IC50越小,對(duì)羥自由基的清除能力越大,抗氧化效果越好。夏和元等[17]以不同時(shí)間采集的青錢柳葉為研究對(duì)象,檢測(cè)其對(duì)OH·的清除能力,發(fā)現(xiàn)樣品對(duì)羥基自由基有較好的清除能力但存在明顯差異,其中7月份綠色葉陰干和殺青樣品效果最好。

1.2 還原金屬離子評(píng)價(jià)方法 物質(zhì)的還原能力與其抗氧化活性之間有著明顯的相關(guān)性,目前最常用的是還原金屬離子評(píng)價(jià)方法是還原鐵離子法(FRAP)。FRAP最早由Benzie等[18]提出,主要用于血漿中抗氧化成分的評(píng)價(jià),后來(lái)廣泛用于植物抗氧化活性檢測(cè)。該方法的原理是在較低pH環(huán)境下,Fe3+-三吡啶三吖嗪可被樣品還原為二價(jià)鐵形式,呈現(xiàn)出藍(lán)色,吸光度593nm時(shí)光吸收值最高,根據(jù)其吸光度值的大小評(píng)價(jià)抗氧化能力,吸光度值與抗氧化能力成正比。

陳培等[19]對(duì)不同基因型青錢柳進(jìn)行四種不同的光質(zhì)處理后測(cè)定其FRAP,發(fā)現(xiàn)藍(lán)光和綠光更有利于提高青錢柳葉中抗氧化活性,藍(lán)光處理和金鐘山基因型的青錢柳葉抗氧化能力方面表現(xiàn)更佳。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在青錢柳培育過(guò)程中,可通過(guò)改變光照、選擇基因型來(lái)提高青錢柳葉的抗氧化活性。陳瑋玲等[20]對(duì)不同青錢柳葉提取物進(jìn)行FRAP測(cè)定,發(fā)現(xiàn)樣品還原能力與DPPH自由基清除能力相似,四種不同溶劑提取物中70%乙醇提取物還原能力最強(qiáng),總酚、總黃酮含量與還原能力呈正相關(guān)。

FRAP方法操作簡(jiǎn)單快捷、重現(xiàn)性好,但也有學(xué)者認(rèn)為其生物相關(guān)性較差,不能作為抗氧化能力檢測(cè)的最佳選擇。

1.3 抑制脂質(zhì)過(guò)氧化評(píng)價(jià)方法 脂質(zhì)中不飽和脂肪酸通過(guò)自動(dòng)氧化生成不穩(wěn)定狀態(tài)的氫過(guò)氧化物,然后繼續(xù)分解生成短碳鏈的小分子化合物如醛、酮等。硫代巴比妥酸法常用于檢測(cè)青錢柳的脂質(zhì)過(guò)氧化,其原理是體內(nèi)高不飽和的脂肪酸經(jīng)過(guò)氧化生成過(guò)氧化脂質(zhì)(LPO),最后生成丙二醛(MDA)。

吳菲菲等[21]對(duì)不同濃度的青錢柳多糖溶液進(jìn)行脂質(zhì)過(guò)氧化(LPO)抑制能力檢測(cè),發(fā)現(xiàn)青錢柳多糖對(duì)卵黃脂蛋白過(guò)氧化的抑制作用與濃度呈正相關(guān)。當(dāng)濃度為1.6mg/ml時(shí),青錢柳粗多糖和精制多糖對(duì)卵黃脂蛋白過(guò)氧化的抑制作用最強(qiáng),在0.05～1.6mg/ml范圍內(nèi),青錢柳粗多糖對(duì)LPO的抑制效果優(yōu)于其精制多糖。段小群等[22]對(duì)青錢柳多糖進(jìn)行抗脂質(zhì)過(guò)氧化研究發(fā)現(xiàn),青錢柳多糖可減輕小鼠肝組織自發(fā)性及自由基誘導(dǎo)劑引起的肝脂質(zhì)過(guò)氧化水平,闡明青錢柳多糖有明顯的抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用,并具有一定的量效關(guān)系。

脂質(zhì)體系抗氧化檢測(cè)的缺點(diǎn)主要是實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長(zhǎng)且操作相對(duì)復(fù)雜, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果也容易受到多種因素影響。

2 體內(nèi)抗氧化活性評(píng)價(jià)方法

體外抗氧化活性評(píng)價(jià)方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單迅速、重現(xiàn)性好,但體外評(píng)價(jià)體系與生物體內(nèi)實(shí)際環(huán)境相差較大,某些在體外評(píng)價(jià)法里表現(xiàn)出高抗氧化活性的物質(zhì)在生物體內(nèi)可能活性較差,所以需要在體外評(píng)價(jià)后再進(jìn)行體內(nèi)評(píng)價(jià)從而進(jìn)一步證實(shí)抗氧化劑的活性。青錢柳體內(nèi)抗氧化活性評(píng)價(jià)可以通過(guò)在相應(yīng)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)某些酶活性或代謝產(chǎn)物含量來(lái)進(jìn)行抗氧化能力判斷,SOD、MDA、GSH-Px等常被用作重要的抗氧化指標(biāo), 它們的協(xié)同作用可以維持機(jī)體自由基的動(dòng)態(tài)平衡, 同時(shí)阻止脂質(zhì)過(guò)氧化和此過(guò)程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物對(duì)機(jī)體造成損害。

2.1 超氧化物歧化酶(SOD)法 SOD是一種抗氧化金屬酶,可以催化超氧陰離子自由基歧化生成過(guò)氧化氫和氧,可以保持生物體自由基產(chǎn)生和過(guò)氧化物清除能力均衡,從而起到保護(hù)細(xì)胞的作用。

2.2 丙二醛(MDA)法 MDA是在脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)鏈終止階段產(chǎn)生,可以引起細(xì)胞腫脹壞死、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞。通過(guò)對(duì)MDA進(jìn)行含量測(cè)定,可以分析機(jī)體細(xì)胞受到自由基攻擊時(shí)組織的損傷程度。

2.3 谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)法 GSH-PX是一種過(guò)氧化物分解酶,催化還原型谷胱甘肽變?yōu)檠趸凸入赘孰?可以使有毒的過(guò)氧化物還原成無(wú)毒的羥基化合物,同時(shí)還可以促進(jìn)H2O2的分解,減少氧自由基損傷細(xì)胞。

趙靜等[23]研究發(fā)現(xiàn)青錢柳能明顯增高肝臟SOD和GSH-Px的活性,降低肝臟MDA的含量,通過(guò)清除機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物,間接發(fā)揮抗氧化作用。盧振華[24]研究發(fā)現(xiàn)青錢柳可以顯著增高SOD的活性, 降低機(jī)體內(nèi)MDA含量,保護(hù)機(jī)體免受自由基傷害。陳丹等[25]研究發(fā)現(xiàn)富硒青錢柳—黃精復(fù)方可有效提高2型糖尿病大鼠血清中SOD、GSH-Px的活性,降低血清中MDA的含量,降低氧化應(yīng)激程度,改善糖尿病動(dòng)物機(jī)體抗氧化能力。

3 細(xì)胞模型抗氧化活性評(píng)價(jià)方法

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確,可以真實(shí)反映青錢柳在體內(nèi)的抗氧化程度,但費(fèi)用較高、實(shí)驗(yàn)周期也較長(zhǎng),所以也可以通過(guò)細(xì)胞模型抗氧化活性評(píng)價(jià)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。

賀海波等[26]在對(duì)青錢柳不同溶劑提取物進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn),其對(duì)模型大鼠胰島細(xì)胞瘤細(xì)胞(INS-1)細(xì)胞的保護(hù)作用與其增強(qiáng)內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)功能密切相關(guān)。羅丹等[27]發(fā)現(xiàn)富硒青錢柳—蛹蟲草復(fù)方能降低NIT-1細(xì)胞內(nèi)ROS水平,發(fā)揮抗氧化作用。王胤康等[28]研究了青錢柳多糖和黃酮對(duì)胰島素抵抗的人源肝癌細(xì)胞的影響,發(fā)現(xiàn)它們能夠逆轉(zhuǎn)胰島素抵抗,增加肝癌細(xì)胞葡萄糖攝取量,降低α-葡萄糖苷酶活性。

4 展望

青錢柳是一種具有多種功能的生物抗氧化劑,綜合對(duì)其進(jìn)行抗氧化成分研究的過(guò)程發(fā)現(xiàn),每種抗氧化活性評(píng)價(jià)方法都有一定的局限性和缺點(diǎn),如果僅通過(guò)一種方法來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)是不合理。因此,應(yīng)該建立一套多方案評(píng)價(jià)體系來(lái)評(píng)價(jià)青錢柳的抗氧化能力,使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更有科學(xué)利用價(jià)值,更好地為青錢柳的開放利用提供參考依據(jù)。