王旭敏，李怡霞，鄧子雨，張楊杰，狄建兵*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030801；2.華朔（山西）綠色產(chǎn)業(yè)發(fā)展集團(tuán)生物科技檢測(cè)有限公司，山西 朔州 038300；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 山西功能農(nóng)產(chǎn)品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山西 太原 030031；4.泰州安井食品有限公司，江蘇 泰州 225700）

核桃，世界四大干果之一［1］，據(jù)原國家林業(yè)局、國家林草局提供的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)和《中國農(nóng)村統(tǒng)計(jì)年鑒》：2020 年我國核桃的產(chǎn)量為479.6 萬噸；2021 年我國核桃種植面積達(dá)1.2 億畝，產(chǎn)量達(dá)540.4 萬噸［2］。核桃中脂肪含量為60%~70%，蛋白質(zhì)含量為15%~20%，核桃的可食用部分為核桃仁，占總重量的40%~60%，含有豐富的營養(yǎng)素，核桃殼皮在打磨石材、生產(chǎn)活性炭、油毛氈工業(yè)以及磨碎做肥料等方面應(yīng)用廣泛［3］。核桃富含脂肪酸和天然抗氧化劑，在預(yù)防和降低心臟病及癌癥風(fēng)險(xiǎn)方面有重要作用，也具有補(bǔ)腎、溫肺潤喉、潤腸通便等優(yōu)點(diǎn)［4］。在食品的加工與貯存過程中，都伴隨有蛋白質(zhì)氧化的發(fā)生。有研究表明，氧化作用會(huì)改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特性，影響蛋白質(zhì)的消化性質(zhì)，降低其營養(yǎng)蛋白質(zhì)氧化是指由于蛋白質(zhì)在受到直接或間接氧化作用后，分子內(nèi)部發(fā)生變化，其原本的共價(jià)態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，被破壞，分子間的連接、肽鏈斷裂，功能特性進(jìn)一步惡化，導(dǎo)致食品風(fēng)味降低、營養(yǎng)損失等［6］。脂肪氧合酶（Lipoxygenase， LOX）在動(dòng)植物體內(nèi)最常見，并且植物性原料中的LOX 活性較動(dòng)物性原料中的高［7］，是氧化的一個(gè)關(guān)鍵因素。LOX 催化的脂質(zhì)氧化是由4 個(gè)基本反應(yīng)組成的，分別為奪氫過程、自由基的重排、氧插入和過氧自由基的還原［8］。脂質(zhì)氧化與蛋白質(zhì)氧化可以相互轉(zhuǎn)移，這2 種氧化反應(yīng)的產(chǎn)物如自由基、H2O2等可作為中間物質(zhì)參與到另一種氧化反應(yīng)中，前者常常先于后者發(fā)生，并且會(huì)迅速生成醛類、酮類和低級(jí)脂肪酸等一系列化合物，所以二者之間常?？梢员徽f成是前者的產(chǎn)物可以促進(jìn)后者的發(fā)生［9］。

本文以核桃為試驗(yàn)原料，利用脂肪氧合酶對(duì)不同添加量的亞油酸進(jìn)行催化，對(duì)核桃氧化蛋白的溶解度、粒徑、電位、巰基含量、表面疏水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及內(nèi)源熒光進(jìn)行檢測(cè)分析，本文對(duì)核桃蛋白質(zhì)的氧化機(jī)理進(jìn)行研究，有助于了解脂質(zhì)氧化對(duì)核桃蛋白結(jié)構(gòu)的影響，為抑制核桃蛋白的氧化，增加核桃產(chǎn)品的貨架期提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

核桃：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹研究所（經(jīng)度112°29′49″E；緯度37°20′29″N）；2021 年9 月摘；品種為秋香。

脫脂核桃粉：實(shí)驗(yàn)室制備粉。

1.2 主要試劑

本試驗(yàn)所需試劑如表1 所示。

1.3 主要設(shè)備

表2為試驗(yàn)所需主要儀器設(shè)備。

表2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備Table 2 Test instruments and equipments

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 核桃分離蛋白的制備

參照劉巖等［10］方法略加修改，脫脂核桃粉與水按1∶26 的比例混合，調(diào)節(jié)pH 至11，磁力攪拌1.5 h，離心（5000×g，20 min），取上清液，調(diào)節(jié)pH 至4.5，磁力攪拌1 h，離心（9000×g，20 min），得沉淀，將沉淀pH 調(diào)節(jié)至7.0，倒入液氮快速冷凍，-80 ℃冰箱中放置24 h 后放入真空凍干機(jī)，得到核桃分離蛋白，4 ℃冰箱保存。

1.4.2 脂肪氧合酶（LOX）的制備

底物的制備：取燒杯，加入0.27 mL 亞油酸、5 mL NaOH 溶液，混合均勻，加入0.25 mL Tween 20，用HCl 溶液調(diào)節(jié)混合液的pH 至9.0，加入硼酸緩沖液定容至500 mL。

粗酶液的制備［11］：稱0.5 g 核桃，冰浴研磨，分別加入20 mL 聚乙烯吡咯烷酮溶液與PBS 緩沖液，離心（4 ℃，12 000×g，30 min），取澄清液，過0.22 μm 濾膜，制得所需粗酶液。

1.4.3 核桃氧化蛋白的制備

將1.4.1 制得的核桃分離蛋白溶于其重量的20 倍的去離子水中，將pH 調(diào)節(jié)至9.0，取5 個(gè)錐形瓶，各加入1.4.2 制得的酶液10 mL，再分別加入0、3、4.5、7.5、9 mL 亞油酸，混勻，放入4 ℃冰箱中反應(yīng)6 h，調(diào)節(jié)pH 至4.5，離心（5000×g，30 min），取沉淀，水洗沉淀，將沉淀pH 調(diào)節(jié)至中性，倒入液氮快速冷凍，-80 ℃冰箱中放置24 h 后放入真空凍干機(jī)，得到核桃氧化蛋白，4 ℃冰箱保存［12］。

1.4.4 溶解度的測(cè)定

配制5 mg·mL-1蛋白溶液，離心（10 000×g，20 min），取上清液，用雙縮脲法［13］測(cè)定蛋白質(zhì)含量，計(jì)算其溶解度。

1.4.5 粒徑及電位的測(cè)定

將核桃氧化蛋白用10 mmol·L-1、pH 7.0 的PBS 緩沖液進(jìn)行稀釋，過0.45 μm 濾膜，用納米粒度及Zeta電位分析儀進(jìn)行測(cè)定。

1.4.6 游離巰基含量的測(cè)定

采用DTNB 比色法［14］。稱取15 mg 核桃氧化蛋白加入5 mL Tris-Gly-8 mol·L-1Urea 緩沖液中，使用漩渦振蕩儀，在高速模式下振蕩分散，加入50 μL DTNB 溶液（4 mg·mL-1），迅速混勻，室溫靜置1 h，以緩沖液為空白對(duì)照，測(cè)定其吸光度A412。

1.4.7 表面疏水性的測(cè)定

采用ANS 熒光探針法［15］。用10 mmol·L-1、pH 7.0 的PBS 緩沖液將核桃氧化蛋白進(jìn)行溶解，再加入5 mL 8 mmol·L-1的ANS 溶液，測(cè)定熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長395 nm、吸收波長470 nm），以熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)濃度作圖，曲線斜率即為蛋白質(zhì)表面疏水指數(shù)。

1.4.8 二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定

采用傅里葉紅外光譜儀對(duì)核桃氧化蛋白進(jìn)行全波段掃描，對(duì)蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。

1.4.9 內(nèi)源熒光光譜的測(cè)定

用10 mmol·L-1、pH 7.0 的PBS 緩沖液將核桃氧化蛋白進(jìn)行溶解，配制成1% 的蛋白溶液，離心（25 ℃，10 000×g，20 min），以PBS 緩沖液為空白對(duì)照，設(shè)定熒光光譜為295 nm，發(fā)射光譜為300~400 nm［16］，測(cè)定其光譜。

1.4.10 數(shù)據(jù)處理分析

核桃氧化蛋白所測(cè)指標(biāo)進(jìn)行3 次取平均值，使用SPSS26.0、Origin21.0進(jìn)行分析繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)氧化對(duì)核桃氧化蛋白溶解度的影響

溶解度是指某種物質(zhì)在溶劑中的溶解程度，常常被用來表示蛋白的聚集程度。溶解度好的蛋白在加工中應(yīng)用較廣，能有效促進(jìn)生產(chǎn)［17］，而核桃蛋白含有大量脂肪，溶解性較差。

測(cè)定不同氧化程度時(shí)核桃氧化蛋白的溶解度，由圖1 可見，亞油酸添加量為0 mL 時(shí)，溶解度為27.97%，當(dāng)亞油酸添加量從0 mL 增加到3 mL，從4.5 mL 增加到9 mL 時(shí)，溶解度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，當(dāng)亞油酸添加量為4.5 mL 時(shí)，溶解度上升，達(dá)到最大值，為45.81%，此時(shí)核桃氧化蛋白溶解性最好。在低亞油酸濃度氧化時(shí)，核桃氧化蛋白內(nèi)部形成可溶性聚集物，溶解度有所提高，隨著氧化程度的加深，可溶性聚集物通過共價(jià)互聯(lián)轉(zhuǎn)為不可溶聚集物，溶解度明顯下降［18］。

2.2 蛋白質(zhì)氧化對(duì)核桃氧化蛋白粒徑的影響

蛋白質(zhì)粒徑大小是反映聚集程度的一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)［19］，與其在體系中的穩(wěn)定性緊密聯(lián)系［20］。如圖2 所示，亞油酸添加量為0 mL 時(shí)，粒徑最大，亞油酸添加量為3 mL 時(shí)，粒度分布向小的方向發(fā)生偏移，亞油酸添加量為4.5、7.5 mL 時(shí)，粒度分布均向大的方向偏移，亞油酸添加量為9 mL 時(shí)，粒度分布又向小的方向發(fā)生偏移。這種情況的出現(xiàn)，是因?yàn)楹颂业鞍踪|(zhì)在氧化反應(yīng)后，內(nèi)部分子結(jié)構(gòu)被破壞、展開，粒徑變小；隨著反應(yīng)的進(jìn)一步進(jìn)行，氧化加深，暴露的疏水基團(tuán)開始聚集，生成可溶性聚集體，大于原來的疏水基團(tuán)，粒徑變大；在氧化進(jìn)行到最后階段時(shí)，又生成不可溶性聚集體，基團(tuán)之間互相分開，相應(yīng)的可溶性部分的粒徑減小［21］。

圖2 不同亞油酸添加量對(duì)核桃氧化蛋白粒徑的影響Fig.2 Effects of various added amounts of linoleic acid on particle sizes of walnut oxidized protein

2.3 蛋白質(zhì)氧化對(duì)核桃氧化蛋白電位的影響

Zeta 電位是指剪切面的電位，是粒子間的相互作用造成的。Zeta電位可以反映蛋白表面所帶正負(fù)電荷的情況，與蛋白中氨基酸殘基的離子化有關(guān)［22］。帶電性的大小是表達(dá)蛋白分子穩(wěn)定性的重要基礎(chǔ)，Zeta 電位的絕對(duì)值越高，說明此時(shí)體系不易受外界影響，越穩(wěn)定［5］。

如圖3 所示，在亞油酸添加量不同的樣品中，電位值均為負(fù)值，表明在核桃氧化蛋白中，存在較多的帶負(fù)電荷的氨基酸。亞油酸添加量為0 mL 時(shí)，Zeta電位絕對(duì)值為6.71 mV，添加亞油酸后，核桃氧化蛋白電位絕對(duì)值先增大，在亞油酸添加量為3 mL時(shí)為最大值16.73 mV，說明此時(shí)體系最穩(wěn)定，隨著氧化的進(jìn)一步加深，核桃氧化蛋白電位絕對(duì)值逐漸變小，吸引力的作用力明顯超過了排斥力的作用力，核桃蛋白體系的分散被破壞，發(fā)生凝聚現(xiàn)象。

圖3 不同亞油酸添加量對(duì)核桃氧化蛋白Zeta 電位的影響Fig.3 Effects of various added amounts of linoleic acid on Zeta potential of walnut oxidized protein

2.4 蛋白質(zhì)氧化對(duì)核桃氧化蛋白巰基含量的影響

常見的蛋白質(zhì)中通常都含有豐富的半胱氨酸，且以巰基的形式存在，巰基極易被氧化，氧化后其共價(jià)鍵會(huì)被破壞，生成新的二硫鍵，導(dǎo)致巰基含量下降，對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)生影響［23］，通?？梢杂脕碛^察蛋白質(zhì)的氧化程度。

如圖4 所示，巰基含量隨著亞油酸添加量的增加呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢(shì)，從75.58 μmol·g-1下降到41.90 μmol·g-1。這種情況的出現(xiàn)，可能是因?yàn)檠趸饔迷斐傻鞍踪|(zhì)的變性以及二硫鍵的生成，并且隨著氧化的加深，多肽分子會(huì)繼續(xù)發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)一步形成其他物質(zhì)如磺酸類或者其他產(chǎn)物，使得巰基含量進(jìn)一步降低［24］。

圖4 不同亞油酸添加量對(duì)核桃氧化蛋白巰基含量的影響Fig.4 Effects of various added amounts of linoleic acid on sulfhydryl content of walnut oxidized protein

2.5 蛋白質(zhì)氧化對(duì)核桃氧化蛋白表面疏水性的影響

蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性大多依賴于分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)，表面疏水性可以反映其氧化程度，同時(shí)在評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)理化性質(zhì)以及結(jié)構(gòu)變化方面也有著至關(guān)重要的作用［25］。

核桃氧化蛋白表面疏水性受亞油酸不同添加量的影響如圖5 所示，隨著亞油酸添加量的增加，表面疏水指數(shù)呈現(xiàn)先增加而后降低的趨勢(shì)，亞油酸添加量為0 mL 時(shí)，疏水指數(shù)為19.29，亞油酸添加量為3 mL 時(shí)，疏水指數(shù)達(dá)到最大，為52.33。這主要是由于在脂肪氧合酶催化亞油酸的體系中，氧化作用改變了蛋白質(zhì)的構(gòu)象，隨著亞油酸的增多，即氧化程度的加深，蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團(tuán)開始暴露于空氣中，并且開始相互作用產(chǎn)生反應(yīng)，形成聚集體，疏水指數(shù)降低；或者是由于氧化使得蛋白結(jié)構(gòu)展開，又發(fā)生了重新聚集，在此過程中疏水基團(tuán)嵌入，有新的親水基團(tuán)形成，疏水指數(shù)下降［26］。

圖5 不同亞油酸添加量對(duì)核桃氧化蛋白表面疏水性的影響Fig.5 Effects of various added amounts of linoleic acid on surface hydrophobicity of walnut oxidized protein

2.6 蛋白質(zhì)氧化對(duì)核桃氧化蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

紅外光譜是一項(xiàng)具有測(cè)定所需樣品少、無損、分辨率高、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)的技術(shù)，廣泛應(yīng)用于定性定量分析蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)［27］。酰胺Ⅰ帶（1600~1700 cm-1）是主要表達(dá)C=O 的伸縮振動(dòng)，以及它與NH 彎曲振動(dòng)（酰胺II 帶）、C-N 伸縮振動(dòng)（酰胺III帶）的偶合關(guān)系，然而伸縮振動(dòng)的頻率大小如何，主要還是依賴于C=O 和NH 之間的氫鍵特性，因此常常通過觀察酰胺Ⅰ帶的圖譜趨勢(shì)，來研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化［28］。

由圖6 中可以看出，不同亞油酸添加量下核桃氧化蛋白的紅外光譜圖變化趨勢(shì)并無太大差異，對(duì)酰胺Ⅰ帶進(jìn)行二階求導(dǎo)，可以得到各個(gè)特征峰［29］，其中1614~1643 cm-1、1678~1685 cm-1處為β-折疊；1643~1651 cm-1處為無規(guī)則卷曲；1651~1664 cm-1處為α-螺旋；1664~1678 cm-1、1685~1700 cm-1處為β-轉(zhuǎn)角。

圖6 不同亞油酸添加量在酰胺Ⅰ帶處圖譜Fig.6 The spectra of different linoleic acid additions at the amide I band

由圖7 可見，加入3 mL 亞油酸時(shí)，酰胺Ⅰ帶最高峰位在波長1654.8 cm-1處，當(dāng)亞油酸添加量大于4.5 mL 時(shí)，酰胺Ⅰ帶最高峰位向低波長處發(fā)生移動(dòng)，均到了1652.9 cm-1處，這說明核桃蛋白在脂肪氧合酶的影響下，結(jié)構(gòu)開始不穩(wěn)定，原來的結(jié)構(gòu)受到破壞，被解離，氫鍵的作用逐漸加強(qiáng)，電子云密度降低，使得酰胺Ⅰ帶的峰位開始向低波數(shù)的方向移動(dòng)［30］。

圖7 不同亞油酸添加量在全波段處圖譜Fig.7 The spectra of different linoleic acid additions at the full band

2.7 蛋白質(zhì)氧化對(duì)核桃氧化蛋白內(nèi)源熒光的影響

蛋白質(zhì)本身就具有內(nèi)源熒光，根據(jù)熒光光譜可以對(duì)蛋白質(zhì)的組成以及分子構(gòu)象等進(jìn)行詳細(xì)分析［31］。內(nèi)源熒光吸收波長的最大值可以用來反映蛋白質(zhì)中色氨酸殘基的相對(duì)位置和變化，也可以反映蛋白質(zhì)微環(huán)境的變化［32］，由此反應(yīng)結(jié)構(gòu)的變化。

不同亞油酸添加量對(duì)核桃氧化蛋白內(nèi)源熒光的影響如表3 所示，最大吸收波長并無明顯變化，變化范圍在323~325 nm 之間。熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)持續(xù)降低的趨勢(shì)，從155.35 降低到115.10。最大吸收波長向323 nm 處的轉(zhuǎn)移說明氧化的加深會(huì)使得蛋白之間重新聚集在一起，發(fā)生凝聚，色氨酸殘基的暴露量減小、暴露程度降低，內(nèi)部物質(zhì)轉(zhuǎn)移到了更加疏水的環(huán)境中去［33］。而內(nèi)源熒光強(qiáng)度的持續(xù)下降，可能是蛋白質(zhì)中的更多側(cè)鏈暴露出來，轉(zhuǎn)移到更加親水的環(huán)境中，從而引發(fā)結(jié)構(gòu)的變化［34］。

表3 不同亞油酸添加量對(duì)核桃氧化蛋白內(nèi)源熒光的影響Table3 Effects of various added amounts of linoleic acid on intrinsic fluorescence of walnut oxidized protein

3 討論

本文利用脂肪氧合酶催化亞油酸的氧化系統(tǒng)，對(duì)核桃氧化蛋白進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果表明：添加亞油酸后核桃氧化蛋白溶解度與粒徑變化趨勢(shì)一致，當(dāng)亞油酸添加量為0~3 mL 時(shí)，溶解度下降，粒度分布向粒徑小的方向發(fā)生偏移；當(dāng)亞油酸添加量為3~7.5 mL 時(shí)，溶解度上升，粒徑變大；亞油酸添加量為9 mL 時(shí)，溶解度下降，粒度大小向粒徑小的方向偏移。隨著氧化程度加深，Zeta 電位的絕對(duì)值先增大后減小，當(dāng)亞油酸添加量為3 mL 時(shí)達(dá)到最大值，此時(shí)核桃氧化蛋白最穩(wěn)定。表面疏水性呈現(xiàn)先增加而后持續(xù)降低的趨勢(shì)，當(dāng)亞油酸添加量為3 mL時(shí)，疏水指數(shù)達(dá)到最大為52.33。孫領(lǐng)鴿等［35］等在蛋白質(zhì)氧化對(duì)核桃蛋白界面性質(zhì)的影響研究中，發(fā)現(xiàn)隨著氧化程度的加深，核桃蛋白粒徑分布發(fā)生轉(zhuǎn)移，低濃度的氧化使蛋白質(zhì)分子解離，粒徑變小，而過度的氧化使核桃蛋白分子結(jié)構(gòu)重新展開，暴露出的內(nèi)部分子與核桃蛋白結(jié)合形成新的聚集體，粒徑增加，表面疏水性及Zeta 電位絕對(duì)值都先增大后減小。游離巰基含量呈下降趨勢(shì)，從75.58 μmol·g-1下降到41.90 μmol·g-1，王丹丹等［36］采用不同濃度的AAPH 熱降解形成烷過氧自由基代表脂質(zhì)過氧化反應(yīng)過程中產(chǎn)生的脂質(zhì)自由基，對(duì)核桃分離蛋白進(jìn)行不同程度的氧化修飾，隨著氧化的加深，半胱氨酸的氧化還原狀態(tài)被改變，蛋白質(zhì)中巰基和二硫鍵的數(shù)量和分布被改變，巰基含量持續(xù)降低。廖鈺等［21］研究了脂肪氧合酶催化亞油酸氧化對(duì)花生蛋白結(jié)構(gòu)的影響，花生分離蛋白的熒光峰位隨著亞油酸含量的增加先增加后減小，這與我們得出的結(jié)果一致，峰位紅移表明氧化使蛋白結(jié)構(gòu)展開，內(nèi)部的色氨酸殘基逐漸暴露，而峰位藍(lán)移則表明進(jìn)一步的氧化使蛋白重新發(fā)生聚集，色氨酸殘基暴露程度降低。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果說明核桃蛋白在經(jīng)過不同程度的氧化后，蛋白結(jié)構(gòu)均會(huì)發(fā)生變化，當(dāng)亞油酸添加量為3 mL 時(shí)，抗氧化效果比較好。較低程度的氧化可以改善核桃的蛋白結(jié)構(gòu)，提高了核桃蛋白的利用率，也為如何提高核桃產(chǎn)品的貨架期奠定優(yōu)良基礎(chǔ)。近年來，核桃蛋白深受大眾喜愛，市場潛力大，對(duì)核桃蛋白進(jìn)行更深入的研究，能更好的促進(jìn)核桃產(chǎn)品的加工產(chǎn)業(yè)化。