上官琳暉，丁文文，劉佳宇，范闊海，尹偉，孫娜，孫盼盼，李宏全*

（1.山西農業(yè)大學 動物醫(yī)學學院/中獸醫(yī)藥現(xiàn)代化山西省重點實驗室，山西 晉中 030801；2.山西農業(yè)大學 實驗動物管理中心，山西 晉中 030801）

豬圓環(huán)病毒2 型（Porcine circovirus type 2，PCV2）是豬圓環(huán)病毒相關疾?。≒orcine circovirus type 2 associated disease，PCVAD）主要病原體［1］。PCV2 感染后主要侵害機體免疫系統(tǒng)，表現(xiàn)為感染豬外周血和免疫器官中淋巴細胞大量凋亡，致使感染豬出現(xiàn)免疫抑制并繼發(fā)感染豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV）、豬細小病毒和豬流行性腹瀉病毒等多種病原體［2-3］。在PCV2 感染豬體內，其抗原主要存在于樹突狀細胞（Dendritic cell，DC）中［4］。體外實驗表明，PCV2 在體外感染樹突狀細胞后，會抑制DC 成熟增強DC 內吞作用，減弱DC對T 淋巴細胞的刺激作用［5］。因此，探討PCV2 與樹突狀細胞相互作用的機制是有必要的。

DC 作為功能最強的抗原呈遞細胞（Antigenpresenting cell，APC），在免疫反應中起捕獲外來抗原的作用［6］。但是病毒也可以通過干擾DC 功能來逃避機體的抗病毒免疫反應并導致持續(xù)感染［7］，或者利用DC 攝取抗原后向淋巴結遷移的特性以DC 為媒介在體內傳播［8-9］。研究表明，PCV2感染機體后，以巨噬細胞或樹突狀細胞為靶細胞，單核細胞來源的樹突狀細胞（Mononuclear-derived dendritic cells，MoDC）中持續(xù)存在并保持感染性；這種現(xiàn)象表明DC 可能是PCV2 在體內傳播的媒介［10-11］。

外泌體（Exosome，Exo）是一種由細胞釋放的細胞外囊泡（Extracellular vesicles，EVs），直徑為30~150 nm，呈橢圓或圓形盤狀［12-14］。外泌體可通過傳遞其所攜帶的內容物（蛋白質、脂質、mRNA、miRNA、tRNA 等）參與細胞間的分子傳遞來調節(jié)受體細胞的生理狀態(tài)［15］。在病毒感染中，外泌體可以通過內容物變化，對機體的抗病毒作用產生影響［16］。MicroRNA（miRNA）是一類內源性非編碼小RNA，大小為19~25 nt，在細胞凋亡、免疫功能和腫瘤發(fā)生等過程中發(fā)揮調節(jié)作用，通常會導致靶基因轉錄后沉默［17-18］。研究表明，病毒感染會引起宿主細胞中miRNA 表達量的變化，差異miRNA 又可以通過靶向宿主或病毒的基因轉錄，來調節(jié)病毒感染過程和宿主的免疫反應［19］，如PRRSV可以通過上調感染細胞中miR-382-5p 和miR-30c表達，抑制Ⅰ型IFN 產生，促進PRRSV 的感染和復制［20-21］。病毒與miRNA 這種相互作用可以被外泌體介導。PCV2 感染PK-15 細胞后，PK-15 外泌體可以通過上調miR-125a-5p 來抑制靶基因Bcl-2 表達，從而激活線粒體凋亡通路，抑制脾淋巴細胞增殖［22-23］。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，PCV2 感染MoDC 后，在MoDC 來源外泌體中檢測到病毒成分，但PCV2感染后是否可以引起MoDC 來源外泌體中miRNAs 變化，以調節(jié)機體免疫反應目前尚不清楚。因此，本研究通過建立PCV2 感染豬MoDC 模型，對正常MoDC 來源外泌體（DEX）與病毒感染的MoDC 來源外泌體（VDEX）中miRNA 進行高通量測序，旨在探明PCV2 影響下VDEX 中差異表達miRNAs 及其靶基因的變化規(guī)律，為明確PCV2 感染的分子機制提供思路。

1 材料和方法

1.1 試驗材料和細胞制備

PCV2-SH 毒株由南京農業(yè)大學姜平教授提供，經PK-15 增殖后測定病毒TCID50 為10-5.38。選取1 月齡臨床健康且PCV2 陰性長白豬，購自太谷縣冠農農牧科技有限公司，采集前腔靜脈血20 mL，使用豬外周血單個核細胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC）分離液試劑盒（天津灝洋）提取PBMC。將PBMC 在MoDC 誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 d，每隔天更換半量培養(yǎng)基，即可得到MoDC。

1.2 試驗方法

1.2.1 建立MoDC 感染PCV2 模型

將所得MoDC 接種到96 孔板中，每孔5×104個細胞，37 ℃孵育12 h。棄去原培養(yǎng)基，加入2%1640 培養(yǎng)基和感染復數(shù)為1 MOI 的PCV2 病毒液，同時設置空白細胞對照組，每組3 個重復孔，病毒作用于細胞2 h 后棄去病毒液，加入2% 1640 培養(yǎng)基，培養(yǎng)至48 h。使用PCV2 間接免疫熒光檢測試劑盒（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）檢測MoDC 是否感染PCV2。

1.2.2 外泌體制備及鑒定

超高速離心法提取DEX 與VDEX。將細胞培養(yǎng)液轉移到10 mL EP 管中，1500 r·min-1，離心10 min，去除細胞沉淀；6000 r·min-1，4 ℃，離心10 min，去除死細胞；15 000 r·min-1，4 ℃，離心30 min，去除細胞碎片；31 200 r·min-1，4℃，離心90 min，棄去液體，1 mL 預冷PBS 完全溶解沉淀后，補滿PBS；31 200 r·min-1，4℃，離心90 min，棄去液體，100 μL 預冷PBS 重懸沉淀，經0.22 μm 濾器過濾后分裝，-80 ℃保存。

納米顆粒追蹤技術（NTA）檢測：使用超純水清洗Zeta View PMX 110 樣本池，聚苯乙烯微球（110 nm）校準機器，PBS 溶液再次清洗樣本池，將DEX 與VDEX 樣品使用PBS 溶液稀釋后上機檢測。

Western blot 檢測：分別取100 μL 溶于PBS 的DEX 與VDEX 提取總蛋白，二喹啉甲酸（Bicinchoninic acid，BCA）法測蛋白濃度，Western blot 鑒定外泌體表面標志物CD63 和TSG101，一抗Anti-CD63 antibody（Abcam）和TSG101 Polyclonal Antibody（三鷹生物）以5% BSA 封閉液按1：1000 稀釋，二抗Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）-HRP（全式金）以TBST 按1∶40 000 稀釋。

1.2.3 Small RNA 測序

TRIzol 法分別提取DEX 與VDEX 組總RNA，用于Small RNA 文庫制備。使用TruSeq Small RNA Sample Prep Kits 試劑盒制備Small RNA 測序文庫，由聯(lián)川生物技術公司完成測序。

1.2.4 測序結果分析

使用ACGT101-miRNA 軟件對miRNA 測序結果進行分析。原始數(shù)據(jù)經過質控處理后得到clean reads，留堿基長度在18~26 nt 序列，再將其與各種RNA 數(shù)據(jù)庫（mRNA 數(shù)據(jù)庫、RFam 數(shù)據(jù)庫和Repbase 數(shù)據(jù)庫）序列比對與過濾，最后獲得有效數(shù)據(jù)，對有效數(shù)據(jù)進行進一步鑒定和預測分析。

1.2.5 miRNA 表達和差異分析

將DEX 組和VDEX 組miRNA 表達量歸一化到同一數(shù)量級，每組樣品拷貝數(shù)=原始拷貝數(shù)×算法校正因數(shù)；當miRNA 表達量>1000 為高表達，表達量在10~999 之間為中表達，表達量在0~9 之間為低表達。miRNA 差異倍數(shù)（Fold change，F(xiàn)C）=VDEX 組均值/DEX 組均值，采用獨立樣本T 檢驗分析兩組樣品間miRNA 差異顯著性，當|Log2（FC）|>1 時，如P<0.01 則miRNA 表達差異極顯著；0.010.05 時miRNA 差異表達不顯著。選擇差異最顯著40 個miRNA（校正P值FDR 最小的3.14e-08~9.70e-04）利用百邁克云平臺熱圖繪制軟件繪制了聚類熱圖。

1.2.6 miRNA 靶基因預測和富集性分析

使用TargetScan（v5.0）和miRanda（v3.3a）對差異顯著（P<0.05）的miRNA 進行靶基因預測。在TargetScan算法中保留閾值為TargetScan score≥50，miRanda Energy<-10，兩款軟件篩選結果取交集即為miRNA 靶基因。對靶基因進行GO 功能和KEGG通路富集分析。

1.2.7 目標miRNA 的qPCR 驗證

根據(jù)測序所得miRNA 序列采用加尾法在DNAMAN 9 軟件中設計miRNA 上游引物（表1），引物序列由西安擎科生物科技有限公司合成，下游通用引物由M5 miRNA qPCR Assay Kit 提供。使用Easy Pure? miRNA Kit 試劑盒（全式金）提取并純化DEX 與VDEX 中miRNA，根據(jù)M5 miRNA cDNA Synthesis Kit（聚合美）說明書進行操作，qPCR 反應體系20 μL：2×M5 miRNA qPCR Mixture 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 7.2 μL。PCR 反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸1 min，共40個循環(huán)；熔解曲線15 s。目的基因表達量用2-ΔΔCt法計算。

表1 qRT-PCR 引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequence

1.3 數(shù)據(jù)分析

miRNA 測序結果用獨立樣本t檢驗和超幾何檢驗進行分析。qRT-PCR 結果t-test 檢驗顯著性；P<0.05 表示差異顯著，P<0.01 差異極顯著。用GraphPad Prism 5.0 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 感染PCV2 MoDC 模型的鑒定

PCV2 Cap 蛋白是由ORF2 所編碼的病毒衣殼蛋白，是PCV2 目前唯一已知的結構蛋白，具有良好的免疫原性，常用來作為PCV2 的檢測［22］。感染PCV2 的MoDC 培養(yǎng)48 h 后，］間接免疫熒光（IFA）檢測PCV2 Cap 蛋白，用熒光倒置顯微鏡觀察。未感染病毒的MoDC 正常細胞對照組（圖1A，圖1C）中未觀察到特異性綠色熒光；MoDC 在感染PCV2 48 h 后，熒光顯微鏡下可觀察到特異性的綠色熒光為Cap 蛋白（圖1D，圖1F），并且可以觀察到Cap 蛋白在MoDC 內表達（圖4F）。結果表明，MoDC 可以被PCV2 感染，PCV2 體外感染MoDC 模型建立成功，達到后續(xù)提取外泌體的細胞要求。

圖1 PCV2 感染MoDC 48 h 后PCV2 Cap 蛋白分布Fig.1 Cap protein distribution of PCV2 after PCV2 infection with MoDC in 48 h

2.2 外泌體鑒定

DEX 與VDEX 鑒定結果如圖2 所示。粒徑檢測顆粒分析技術結果見圖2A，2 組外泌體直徑集中在120 nm 左右。從兩組MoDC 培養(yǎng)基上清中經超速離心所得的沉淀物，免疫印跡檢測結果見圖2B，沉淀物均表達外泌體標志性蛋白質CD63 和TSG101。NTA 和WB 結果表明，超高速離心所得沉淀物為外泌體。

圖2 外泌體鑒定Fig.2 Identification of exosomes

2.3 DEX 和VDEX 差異表達miRNAs 比較分析

DEX 和VDEX 的miRNAs 表達量差異表達miRNAs 有908 個。表2 給出差異極顯著前10 個miRNA。差異表達miRNAs 火山圖（圖3）顯示，與DEX 組相比，VDEX 組差異表達顯著有504 個miRNAs（P<0.05），VDEX 組特異性高表達新miRNA 有3 個，分別是：miPC-3p-11758_454、miPC-3p-7555_705 和miPC-5p-3971_1298；特異性中度表達有61 個。DEX 組特異性高表達有3個，分別是：ssc-miR-4332_L-1R-1、ssc-miR-142-3p 和ssc-miR-150；特異性中表達有156 個，特異性低表達87 個。即PCV2 侵入樹突細胞外泌體以后激活了64 種miRNA 表達，遏止了246 個miRNA 表達。

圖3 差異表達miRNA 火山圖Fig.3 Volcano plot of differentially expressed miRNA

表2 PCV2 感染外泌體中差異極顯著miRNA（前10）Table.2 Highly differentiated miRNAs in PCV2-infected exosomes （Top 10）

2.4 miRNAs 聚類熱圖

圖4是用miRNA 差異極顯著前40 個miRNA聚類分析，特異性僅在DEX 中表達miRNA 有11個，僅在VDEX 組表達8 個；共表達miRNA 有21個：其中19 個miRNA 在VDEX 中顯著降低，僅有2 個上調。

圖4 差異表達miRNA 聚類熱圖Fig.4 Complex heatmap of differentially expressed miRNA

2.5 靶基因GO 富集分析

GO 富集分析氣泡圖顯示（圖5），差異miRNA的靶基因富集在細胞核中的數(shù)量最多，其次是蛋白結合功能；富集程度最高的是激酶活性、其次是氧化還原酶活性；靶基因富集數(shù)量多同時富集程度高是在細胞質。結果表明差異miRNA 的靶基因可能廣泛參與調控細胞功能和生物學過程。

圖5 差異表達miRNA 靶基因GO 富集分析Fig.5 GO enrichment analysis of differentially expressed genes in miRNA

2.6 靶基因KEGG 分析

KEGG 通路分析氣泡圖（圖6）顯示，差異miRNA 的靶基因富集在癌癥通路的數(shù)量最多，其次是單純皰疹病毒1 感染通路；富集程度最高的通路是T 細胞受體（TCR）信號通路，其次Th17 細胞分化通路、再者是B 細胞受體信號通路和FCγR-介導吞噬作用；靶基因富集數(shù)量多同時富集程度高的是內吞作用通路。TNF 信號通路、人白細胞病毒1 感染（HTLV-1）、人類免疫缺陷病毒1 型感染（HIV-1）、類風濕關節(jié)炎通路、流體剪切力與動脈粥樣硬化、趨化因子信號通路等均與免疫相關。

圖6 差異表達miRNA 靶基因KEGG 富集分析Fig.6 KEGG enrichment analysis of differentially expressed miRNA target genes

2.7 構建miRNA 靶基因的網(wǎng)絡圖

選擇VDEX 組特異性高表達的3 個miRNAs，極顯著上調ssc-miR-10b 和PC-3p-29629_167 ，極顯著下調ssc-miR-140-3p_L-1、ssc-miR-532-5p、 ssc-miR-425-5p、 ssc-miR-210、 ssc-miR-144_R+1 和ssc-miR-34c 的靶基因及其富集KEGG 通路（表3）。把12 個miRNAs 預測靶基因作為研究對象，以紅色四邊形節(jié)點為miRNA，紫色圓形節(jié)點為對應的靶基因，箭頭代表靶向關系，構建miRNA-Target 的調控網(wǎng)絡圖（圖7），其中VDEX 組特異性高表達miPC-3p-7555_705 處于中間位置，與ssc-miR-10b 共同調控TNF 表達，與特異性高表達miPC-5p-3971_1298 共同調控TRIM52 和SMAD3，與ssc-miR-140-3p_L-1 共同調控IL2 和PPP3CA，還有ssc-miR-532-5p 調控IL2，與ssc-miR-34c 共同調控轉錄因子FOSL1。另外，IL-2 及受體家族IL2RG、IL2RA、IL2RB，原癌基因AKT 家族等、轉錄因子、NFKBIA、NFKBIE、NFATC1 家族均是與免疫調控密切相關的基因。

圖7 12 個miRNA-靶基因網(wǎng)絡圖Fig.7 Network diagram of 12 miRNA-target genes

2.8 miRNA 測序結果驗證

在表達差異顯著miRNA 中進一步篩選，保留P<0.001 和| Log2（FC）|≥2.0 的豬源已知miRNA，再參照KEGG 結果篩選可能參與病毒感染和免疫相關的目標miRNA。最后選出10 個目標miRNA：ssc-miR-199a-3p-R-1、ssc-miR-532-5p、ssc-miR-425-5p、ssc-miR-210、ssc-miR-144-R+1、ssc-let-7c、ssc-miR-107-R-2、ssc-miR-22-5p-R-1、ssc-miR-296-3p-R+1 和ssc-miR-10b。對篩選出10 個目標miRNA 進行qPCR 驗證，結果表明，與DEX 相比，ssc-miR-532-5p、ssc-miR-425-5p、ssc-miR-210、ssc-miR-144-R+1、ssc-let-7c、ssc-miR-107-R-2、ssc-miR-22-5p-R-1 和 sscmiR-296-3p-R+1 在VDEX 中表達量均顯著降低（P<0.05；圖8），與測序結果一致；ssc-miR-199a-3p-R-1 和ssc-miR-10b 在VDEX 中表達量顯著降低（P<0.05），與測序結果不一致，這可能由于我們未使用測序樣本進行驗證，并且這2 組基因表達量偏低，從而導致結果上下調不一致。

圖8 目標miRNA qPCR 驗證Fig.8 qPCR verification of target miRNA

3 討論

DC 是目前所知抗原遞呈功能最強大的抗原遞呈細胞，能有效激活初始T 細胞，參與機體的免疫調節(jié)。Vincent 等［24］研究發(fā)現(xiàn)，感染了PCV2 的DC 與T 細胞共培養(yǎng)一段時間后，雖然觀察到T 細胞與DC 產生了細胞接觸，但未觀察到病毒轉移。這表明，在PCV2 感染中，感染了PCV2 的DC 可能不通過細胞接觸的方式調節(jié)機體的抗PCV2 感染。DC 分泌的外泌體具有調節(jié)多種免疫細胞細胞活動的功能。Tkach 等［25］通過將DC 分泌的各類外泌體分別添加進CD4+T 細胞培養(yǎng)體系中與T 細胞共孵育。結果發(fā)現(xiàn)，DC 分泌的外泌體均可以激活CD4+T 細胞，促進CD4+T 細胞增殖及分化。另外，在腫瘤研究中，發(fā)現(xiàn)外泌體還可以通過向受體細胞傳遞MHC Ⅰ、補體活化相關物質以及抗原成分，促進T 細胞和B 細胞的活化，增強抗腫瘤免疫反應［26-28］。為了探究感染了PCV2 的DC 是否可以通過VDEX 途徑進行免疫調節(jié)，本研究通過高通量測序技術獲得了DEX 與VDEX 中miRNA 差異表達譜，與DEX 相比，VDEX 中表達差異顯著的miRNA 有504 個（P<0.05），其中上調的有161個，下調的有343 個。對差異顯著的miRNA 進行靶基因預測、GO 富集分析和KEGG 富集分析，差異顯著miRNA 共預測到13 204 個靶基因（P<0.05），GO 富集分析得到具有顯著性的GO 條目1752 條（P<0.05），KEGG 富集分析得到具有顯著性的通路203 條（P<0.05）。

GO 富集分析結果顯示，差異miRNA 的靶基因主要參與的生物學功能有轉錄調控（DNA 模板）、RNA 聚合酶Ⅱ對轉錄的正/負調控、信號轉導和氧化還原等過程，KEGG 通路富集顯示，差異miRNA 靶基因在TNF 信號通路、Th17 細胞分化通路、T 細胞受體信號通路、癌癥通路、B 細胞受體信號通路、自噬通路和AMPK 信號通路等信號通路顯著富集。因此，DEX 與VDEX 的差異主要集中在轉錄調控、信號轉導、細胞核、T 細胞受體信號通路等方面。這些差異表明，VDEX 可能通過參與轉錄調控和T 細胞受體信號通路介導免疫過程。

其中ssc-miR-122 通過與PK-15 細胞中的3’UTR 結合，下調活化T 細胞5 核因子（NFAT5）和嘌呤霉素敏感氨基肽酶的表達，抑制PCV2 的蛋白質表達和病毒DNA 復制［29］。miR-30a-5p 靶向自噬調節(jié)因子14-3-3 基因，并在調節(jié)細胞周期中發(fā)揮作用。miR-30a-5p 的過表達可以通過增強自噬來觸發(fā)PCV2 復制，而miR-30a-5p 的阻斷顯著降低了PCV2 的復制［30］。miR-15a 的上調通過介導細胞周期蛋白D1 和E 的降解促進了PCV2 誘導的G0/G1 細胞周期阻滯，有助于病毒的有效復制［31］。在本研究中，ssc-miR-122 的上調以及miR-30a-5p 的下調可能解釋PCV2 在DC 細胞中沒有檢測到明顯的病毒復制。PCV2 通過上調miR-23a 和miR-29b，激活PI3K/Akt1 和p38 MAPK 信號，抑制IL-12p40 的表達。同時，抑制ssc-miR-23a 和ssc-miR-29b 可以減輕PCV2 對IL-12p40 的抑制作用，導致IL-12p40 表達和Th1 細胞群增加［32］。IL-12p40 是IL-12 的p40 亞基，其可以誘導Th1 的促炎功能，從而將先天免疫反應和適應性免疫反應聯(lián)系起來［33］。提示ssc-miR-23a 和ssc-miR-29b可能與T 細胞極化和宿主免疫反應有關。在PCV2 亞臨床感染豬中miRNA 126-3p，miRNA 126-5p，let-7d-3p，mir-129a 和mir-let-7b-3p 上調，而mir-193a-5p，mir-574-5p 和mir-34a 下調，推測這些miRNA 可以參與與免疫系統(tǒng)相關的途徑［34］。

本研究通過結合差異miRNA 顯著性P 值，F(xiàn)old-change 以及KEGG 分析結果，選出可能參與VDEX 介導免疫反應的10 個目標miRNA。在這10 個miRNA 的預測靶點中，存在調控T 細胞增殖分化的靶點。ssc-miR-10b 靶向IL2RA 基因，IL2RA 可以通過激活調節(jié)性T 細胞（Treg）來抑制效應T 細胞的活化和增殖［35，36］。ssc-miR-532-5p、ssc-miR-107-R-2 和ssc-miR-296-3p-R+1 靶向TAF1 基因，TAF1 是CD4+CD25+FoxP3+Treg 細胞主要轉錄子FoxP3 的啟動子，有促進Treg 分化增殖的作用［37］。ssc-miR-107-R-2 靶向STAT3，STAT5 基因，研究發(fā)現(xiàn)STAT3 和STAT5 可作用于Treg 的分化過程，未成熟樹突狀細胞外泌體中miR-683 可以通過調節(jié)STAT3，STAT5 的表達促進Treg 分化［38］。

隨后，我們對目標miRNA 進行qPCR 驗證，檢測miRNA 在正常組和病毒組中的相對表達量，結果發(fā)現(xiàn)qPCR 結果與測序結果基本一致。由此可知，VDEX 可能是通過調控T 細胞的增殖分化來調節(jié)免疫反應。雖然本研究獲得了感染PCV2 的MoDC 外泌體中差異表達miRNA 的一些信息，但仍然存在一些不足，本研究僅限于基因水平，缺乏在動物模型中的驗證，我們將在后期試驗中進一步驗證本次發(fā)現(xiàn)。

4 結論

本研究通過比較DEX 和VDEX 中差異表達miRNA 來進行生物信息學預測分析，結果發(fā)現(xiàn)差異miRNA 靶基因主要參與轉錄調控，并且多集中于T 細胞受體信號通路。由此我們推測PCV2 感染后表達量變化最大的13 種miRNA 可能是VDEX 調節(jié)免疫反應的效應物質之一。本試驗為深入研究PCV2 與DC 感染的相互作用以及對PCV2 的防治提供了新思路。