陳文倩，丁曉璐

（1.常熟市第一人民醫(yī)院腫瘤科；2.常州市第一人民醫(yī)院病理科，江蘇 蘇州 215500）

結(jié)直腸癌是嚴(yán)重危害人類生命健康的常見消化系統(tǒng)惡性腫瘤，雖然各種綜合治療手段不斷發(fā)展，但總體生存率依舊欠佳，其原因主要是遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移高發(fā)生率及腫瘤局部高復(fù)發(fā)率，因此抑制和治療結(jié)直腸癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后重要因素。結(jié)直腸癌的發(fā)生和進(jìn)展呈多因素、多階段性，與多個(gè)癌基因的激活和過度表達(dá)、抑癌基因及脫氧核糖核酸（DNA）修復(fù)基因突變或功能缺失密切相關(guān)。目前，腫瘤細(xì)胞形成的分子機(jī)制及其與癌基因和抑癌基因的關(guān)系已成為研究熱點(diǎn)。吻素-1（Kiss-1）是從黑色素瘤細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用，正常情況下Kiss-1 在正常組織中表達(dá)較多，但在腫瘤組織，特別是消化系統(tǒng)腫瘤，如在胃癌、食管癌中等表達(dá)常常缺失，表明Kiss-1 參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[1-2]，但其具體作用尚不明確。Cyclin E 屬于細(xì)胞周期蛋白家族，在正常組織中該蛋白表達(dá)較低或不表達(dá)，有報(bào)道稱，Cyclin E 與惡性腫瘤有關(guān)，如乳腺癌中Cyclin E 過量表達(dá)與腫瘤發(fā)生及其惡性表型和不良預(yù)后密切相關(guān)[3]。本研究旨在探究Kiss-1、Cyclin E 在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性分析常熟市第一人民醫(yī)院2016 年1 月至2020 年3 月收治的85 例結(jié)直腸癌患者的臨床資料，取其結(jié)直腸癌組織標(biāo)本與結(jié)直腸癌癌旁正常組織標(biāo)本，分別作為結(jié)直腸癌組、癌旁組。診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照《結(jié)直腸癌診療規(guī)范（2015 年版）》[4]中的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)電子結(jié)腸鏡檢查取活檢病理、影像學(xué)檢查及術(shù)后標(biāo)本送病理檢查等確診者；年齡≥ 18 歲；術(shù)前無放化療、免疫治療、靶向治療、中醫(yī)治療等治療史者；臨床資料完整者等。排除標(biāo)準(zhǔn)：多源性腫瘤或多發(fā)癌者；存在炎癥性腸病、家族性腺瘤性息肉病者；合并血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)疾病者等。院內(nèi)醫(yī)學(xué)倫理委員會已批準(zhǔn)此研究實(shí)施。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本采集 所有手術(shù)切除標(biāo)本包括腫瘤組織和癌旁正常組織。癌旁正常組織為距癌組織邊緣5 cm 以上的正常組織，常規(guī)進(jìn)行石蠟阻滯連續(xù)切片，切片厚度為4 μm。

1.2.2 免疫組化檢測 采用檸檬酸高溫高壓對切片進(jìn)行抗原修復(fù)，加入封閉血清，室溫孵育30 min，隨后棄去血清，加入抗Kiss-1 或抗Cyclin E 一抗進(jìn)行4 ℃過夜孵育，磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS）漂洗3 次，5 min/次，加入二抗室溫孵育1 h，PBS 漂洗3 次，5 min/次，最后采用3, 3-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間。獲得滿意染色效果后，切片自然晾干，采用酒精、二甲苯梯度脫水透明，中性樹脂封片。顯微鏡下觀察Kiss-1、Cyclin E 的陽性表達(dá)情況。免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。以PBS 代替一抗作陰性對照。

1.2.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) Kiss-1 表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，呈淺黃色、黃色、棕黃色或棕褐色顆粒。Cyclin E 主要表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)，均表現(xiàn)為棕黃色或黃色顆粒。以染色強(qiáng)度作半定量評分，Kiss-1 免疫陽性反應(yīng)物主要著色于胞漿，Cyclin E 主要著色于胞核，根據(jù)染色強(qiáng)度分為：無染色為0 分，淺黃色為1 分，棕黃色為2 分。根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行評分：陽性細(xì)胞所占比例小于5%計(jì)為0分，5%≤陽性細(xì)胞所占比例＜25%計(jì)為1 分；25% ≤陽性細(xì)胞所占比例＜50%計(jì)為2 分；50% ≤陽性細(xì)胞所占比例＜75%為3 分；陽性細(xì)胞所占比例≥ 75%計(jì)為4 分。結(jié)合染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)和陽性細(xì)胞所占比例分?jǐn)?shù)，兩者相加，＞3 分為陽性表達(dá)，≤ 3 分為陰性表達(dá)[5]。

1.3 觀察指標(biāo)①觀察結(jié)直腸癌組織與結(jié)直腸癌癌旁組織Kiss-1、 Cyclin E 表達(dá)情況。②分析結(jié)直腸癌組織Kiss-1、Cyclin E 陽性表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系。其中臨床病理特征包括年齡、性別、腫瘤直徑（＜3 cm 或≥ 3 cm）、分化程度[6]（高分化：75%以上癌細(xì)胞分化良好，呈低度惡性；中分化：25%~75%的癌細(xì)胞分化良好，呈中度惡性；低分化：分化良好的癌細(xì)胞小于25%，呈高度惡性）、浸潤深度、神經(jīng)侵犯（有或無）、脈管侵犯（有或無）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（有或無）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（有或無）、臨床分期[6][根據(jù)T、N、M 分期綜合評估，T 分期（T1、T2、T3、T4a）、N 分期（N0、N1、N2）、M 分期（M0、M1），包括Ⅰ期（T1~2、N0、M0）、Ⅱ期（T3~4b、N0、M0）、Ⅲ期（T1~4b、N1~2、M0）、Ⅳ期（任何T、任何N、M1a~1b）]

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料經(jīng)K-S 法檢驗(yàn)均符合正態(tài)分布，以(±s)表示，行t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以[ 例(%)]表示，兩組間比較行χ2檢驗(yàn)，多組間比較行χ2趨勢分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌與癌旁正常組織中Kiss-1、Cyclin E 蛋白陽性表達(dá)情況比較結(jié)直腸癌組中Kiss-1 陽性表達(dá)患者占比顯著低于癌旁組，Cyclin E 陽性表達(dá)患者占比顯著高于癌旁組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。免疫組化染色顯示，Kiss-1 陽性免疫反應(yīng)物主要表達(dá)在細(xì)胞胞漿，呈現(xiàn)深棕色反應(yīng)，陽性反應(yīng)細(xì)胞比例約35%，見圖1-A；Cyclin E 的陽性免疫反應(yīng)物主要表達(dá)在細(xì)胞核，呈現(xiàn)深棕色反應(yīng)，細(xì)胞核染色較深，陽性反應(yīng)細(xì)胞比例約60%，見圖1-B。

圖1 結(jié)直腸癌組織Kiss-1、Cyclin E 免疫組織化學(xué)染色陽性圖片（×400）

表1 結(jié)直腸癌與癌旁正常組織中Kiss-1、Cyclin E 蛋白陽性表達(dá)情況比較[例(%)]

2.2 結(jié)直癌組織Kiss-1、Cyclin E 表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系Kiss-l 蛋白陽性表達(dá)中低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅲ+Ⅳ分期患者占比均顯著低于Kiss-l 蛋白陰性表達(dá)；Cyclin E 蛋白陽性表達(dá)中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅲ+Ⅳ分期患者占比均顯著高于Cyclin E 蛋白陰性表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表2。

表2 結(jié)直腸癌組織Kiss-1、Cyclin E 表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制眾多，臨床治療靶點(diǎn)有限，探究新興研究靶點(diǎn)與已知治療靶點(diǎn)的相關(guān)性，有利于結(jié)直腸癌的精準(zhǔn)靶向治療，因此，在結(jié)直腸癌發(fā)病早期制定特異性的診療方案和找出能預(yù)測患者預(yù)后的特異性標(biāo)志物已成為癌癥治療的研究熱點(diǎn)。

Kiss-1 作為人類腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，編碼145 個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)和19 個(gè)氨基酸的信號肽，定位于1 號染色體短臂3 區(qū)2 帶。Kiss-1 可大量表達(dá)于正常組織中，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等部位，其中以胎盤組織中的表達(dá)水平最高，而表達(dá)缺失主要在多種存在轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中，臨床研究已經(jīng)表明，Kiss-l 與黑色素瘤、甲狀腺癌、膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌、胃癌等的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7]。Kiss-1 基因首先在黑色素瘤細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)，其基因表達(dá)產(chǎn)物可顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，同時(shí)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的分化和凋亡[8]。當(dāng)結(jié)直腸癌組織Kiss-1 表達(dá)降低時(shí)，其編碼產(chǎn)物多肽與配體GPR54 的結(jié)合減少，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的基質(zhì)金屬蛋白酶活性增強(qiáng)，腫瘤細(xì)胞增殖、集落形成能力提高，腫瘤進(jìn)一步發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者預(yù)后較差[9]。本研究中，結(jié)直腸癌組中Kiss-1 陽性表達(dá)患者占比顯著低于癌旁組；Kiss-l蛋白陽性表達(dá)中低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅲ+Ⅳ分期患者占比均顯著低于Kiss-l 蛋白陰性表達(dá)，提示Kiss-1 蛋白在結(jié)直腸癌組織中呈低表達(dá)，且Kiss-1 的表達(dá)水平與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)。因此，監(jiān)測Kiss-1蛋白表達(dá)有希望成為評估結(jié)腸癌高危因素和惡性生物學(xué)行為的標(biāo)志物。

Cyclin E 主要表達(dá)于細(xì)胞核，是細(xì)胞周期G1期的正向調(diào)節(jié)因子，其調(diào)控細(xì)胞增殖主要是通過縮短G1期，引起中心體過增殖，干擾有絲分裂，形成不穩(wěn)定的染色體，從而誘發(fā)腫瘤形成[10]。本研究中，結(jié)直腸癌組中Cyclin E 陽性表達(dá)患者占比顯著高于癌旁組；Cyclin E 蛋白陽性表達(dá)中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅲ+Ⅳ分期患者占比均顯著高于Cyclin E蛋白陰性表達(dá)，提示Cyclin E 蛋白在結(jié)直腸癌組織中呈高表達(dá)，且Cyclin E 的表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)。相關(guān)研究中，Cyclin E 的高表達(dá)對細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生抑制作用，不僅提高結(jié)直腸癌細(xì)胞的生存能力，還參與結(jié)直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，其表達(dá)水平可能成為判斷結(jié)直腸癌預(yù)后的潛在指標(biāo)[11]。張庚等[12]研究結(jié)果顯示，在結(jié)腸鏡所取結(jié)直腸癌組織中Cyclin E 陽性率為66.3%，而鄰近正常黏膜組織中Cyclin E 陽性率僅為23.7%，并且結(jié)直腸癌組織中其表達(dá)與原發(fā)腫組織分化、臨床分期呈顯著正相關(guān)，說明Cyclin E 過度表達(dá)可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生及進(jìn)展有關(guān)。

綜上，Kiss-1 蛋白在結(jié)直腸癌組織中呈低表達(dá)，Cyclin E 蛋白在結(jié)直腸癌組織中呈高表達(dá)，且Kiss-1、Cyclin E 的表達(dá)水平與患者臨床病理特征有關(guān)，早期可通過檢測上述指標(biāo)對患者的病情進(jìn)行判斷，為臨床后續(xù)治療提供一定的參考依據(jù)。