鐘月明，王涓，丁郁，吳清平，張菊梅，劉鳴，汪智

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642）（2.廣東省科學(xué)院微生物研究所，華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省微生物安全與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)微生物組學(xué)與精準(zhǔn)應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510070）（3.暨南大學(xué)理工學(xué)院食品科學(xué)與工程系,廣東廣州 510632）

小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌是一種革蘭氏陰性桿菌或球桿菌[1]，主要存在于牛奶及奶制品[2]、生肉[3]、家禽[4]、雞蛋[5]、蔬菜和海鮮[6]中，具有“嗜冷性”，是在冷藏溫度下能生長的少數(shù)致病菌之一[7]。同時(shí)，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌是一種胃腸道病原體，經(jīng)食物、水感染人類后可導(dǎo)致耶爾森氏菌病。這種致病菌的感染，不僅是導(dǎo)致人胃腸道疾病的因素之一，而且對(duì)呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、骨骼結(jié)締組織等相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展也有一定的影響，有時(shí)也會(huì)導(dǎo)致敗血癥，甚至死亡[8]。2020年，歐洲食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）和歐洲疾病預(yù)防和控制中心（European Centre for Disease Prevention and Control，ECDC）有關(guān)耶爾森氏菌的報(bào)告指出，該致病菌所引起的耶爾森氏病是僅次于彎曲桿菌和沙門氏菌感染病的第三大最常見的人畜共患性疾病[9]。此外，本研究團(tuán)隊(duì)對(duì)我國食源性致病菌流行和污染的長期監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌在全國多地的零售食品均有檢出[10,11]，應(yīng)當(dāng)引起大家重點(diǎn)關(guān)注。

小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌按照生化鑒定分為六種生物型，分別是1A、1B、2、3、4和5。除了第一種生物型1A以外，其他五種生物型的菌株均含有攜帶重要毒力基因的毒力質(zhì)粒（pYV）。最常見的染色體編碼毒力決定簇是ail，參與抵抗人類血清殺傷的抗性；ystA和ystB編碼的酸熱穩(wěn)定腸毒素，可能會(huì)引起腹瀉；inv對(duì)入侵宿主細(xì)胞至關(guān)重要[12]。另外，基于常規(guī)血清型分型，已鑒定出70多種小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的血清型；基于脂多糖可鑒定常見的五種血清型分別是O:1,2、O:3、O:5、O:8、O:9，部分血清型如O:3、O:8、O:9被認(rèn)為與人類疾病密切相關(guān)[13]。

目前，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的現(xiàn)有檢測(cè)方法主要依賴生化反應(yīng)，具體檢測(cè)產(chǎn)品包括生化鑒定管、API鑒定試紙條等。常規(guī)檢測(cè)方法主要是參照食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)《食品微生物檢驗(yàn)》GB 4789.8-2016進(jìn)行分離鑒定[14]。雖然常規(guī)的分離鑒定方法仍然是目前檢測(cè)該菌的主要方法，但是檢測(cè)過程耗時(shí)費(fèi)力（大約1周），而且不能準(zhǔn)確地確定分離株是否具有致病性。此外，當(dāng)病原體濃度較低時(shí)很難在復(fù)雜的樣品環(huán)境中檢測(cè)到。為了克服這些局限性，急需開發(fā)出更快速、靈敏、特異的分子生物學(xué)手段對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌進(jìn)行檢測(cè)[12]?，F(xiàn)在的分子生物學(xué)檢測(cè)方法主要是基于小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌分子檢測(cè)靶標(biāo)來進(jìn)行方法構(gòu)建。已報(bào)道的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌核酸檢測(cè)靶標(biāo)主要分為兩類：一類是基于毒力基因的致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢測(cè)靶標(biāo)，包括ail[15]、ystA、ystB、inv[16]和outL[17]；另一類是基于保守基因的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌種檢測(cè)靶標(biāo)包括16S rDNA[18]、tufA[19]、foxA[20]、phop[21]、gyrB[22]和FR729477 locus[23]。

本文將圍繞近幾年小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌基于多種檢測(cè)靶標(biāo)的分子生物學(xué)檢測(cè)方法進(jìn)行綜述（圖1），旨在為該致病菌即時(shí)檢驗(yàn)（Point-of-Care Testing，POCT）的后續(xù)研究及發(fā)展提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

圖1 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的示意圖Fig.1 Schematic diagram of the molecular biology detection technology of Y.enterocolitica

1 變溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

1.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是對(duì)特定區(qū)域DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增的分子生物學(xué)技術(shù)[24]。它的最顯著的特征是能夠大規(guī)模地復(fù)制微量DNA，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便等特點(diǎn)。鄭宇等[32]基于小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌靶標(biāo)foxA、ail、ystA、ystB建立一種多重檢測(cè)方法，并成功利用單重PCR方法和所建立的多重PCR方法對(duì)145份實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)和分析。Bui等[15]利用多重PCR方法基于4種檢測(cè)靶標(biāo)（fyuA、ail、inv和virF）鑒別小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌致病性強(qiáng)弱。除鑒別該菌的致病性外，Rusak等[19]基于靶標(biāo)rfbC構(gòu)建雙重PCR方法來快速鑒定小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌血清型O:3，這極大縮短了鑒定血清型的時(shí)間。相比于分離純化和生化鑒定方法，雖然多重PCR方法能提高檢測(cè)效率，但是該檢測(cè)結(jié)果需要經(jīng)過繁瑣的電泳分析，且靈敏度有待進(jìn)一步提高。

1.2 實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)

熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）是利用特定熒光染色或熒光標(biāo)記技術(shù)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR產(chǎn)物，通過計(jì)算樣品模板濃度，達(dá)到定量的目的[25]。為了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌，國際ISO標(biāo)準(zhǔn)（ISO 10273:2017）規(guī)定了使用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)用于檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌[33]。Foley等[16]基于靶標(biāo)yadA、ystB和inv通過多重qPCR熔解曲線分析檢測(cè)不同生物型的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌，用于605個(gè)臨床樣本檢測(cè)，準(zhǔn)確率達(dá)到99%。Shi等[34]基于抗OmpF抗體-免疫磁珠捕獲該菌（捕獲率達(dá)到80%），結(jié)合靶標(biāo)foxA建立qPCR技術(shù)，能夠檢測(cè)人工污染豬肉樣品中的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌，靈敏度低至64 CFU/g。Liu等[35]基于多重qPCR定量檢測(cè)包括小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌在內(nèi)的12種常見病原體，結(jié)果表明不同病原體之間無交叉反應(yīng)，能同時(shí)快速檢測(cè)多個(gè)病原菌，具備高通量檢測(cè)的潛力。目前基于小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌qPCR檢測(cè)大多使用是熒光染色法（SYBR Green I）進(jìn)行檢測(cè)。該方法可與所有雙鏈DNA結(jié)合，因此可能無法辨別出PCR產(chǎn)物中存在的引物二聚體等，從而給實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來誤差。未來，研究人員可通過小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢測(cè)靶標(biāo)來設(shè)計(jì)適用于qPCR檢測(cè)的特異性熒光探針。

1.3 數(shù)字PCR

為了提高檢測(cè)的靈敏度，數(shù)字PCR（Droplet Digital PCR，ddPCR）逐漸進(jìn)入大眾的視線，該反應(yīng)體系能夠?qū)崿F(xiàn)核酸的絕對(duì)定量分析[26]。該技術(shù)將單個(gè)DNA分子分布到孤立的反應(yīng)中，擴(kuò)增后可以檢測(cè)和分析帶有熒光信號(hào)的產(chǎn)物。Cristiano等[36]利用qPCR和ddPCR用于評(píng)估小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌在不同溫度下孵育11 d中污染綠葉蔬菜中的檢測(cè)率，通過比較兩種方法，結(jié)果只有ddPCR可以在以低于1 log CFU/g接種的樣品中檢測(cè)到，說明ddPCR靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于其它檢測(cè)方法。但常規(guī)PCR、qPCR、ddPCR等檢測(cè)方法往往需要專業(yè)的檢測(cè)儀器，因此這些方法通常只用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，不能廣泛應(yīng)用于現(xiàn)場檢測(cè)。

1.4 基于變溫?cái)U(kuò)增的生物傳感器

以往報(bào)道顯示，結(jié)合變溫?cái)U(kuò)增和芯片的檢測(cè)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)高通量可視化檢測(cè)。胡瑞[27]將PCR反應(yīng)變性后的單鏈產(chǎn)物與芯片上的熒光微球探針結(jié)合，利用兩束激發(fā)光對(duì)待測(cè)物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合軟件分析即可直接獲得檢測(cè)結(jié)果，建立了對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌等四種病原菌xMAP（Flexible Multi-Analyte Profiling）液態(tài)芯片方法。該檢測(cè)技術(shù)能夠?qū)瓮ǖ蓝喾磻?yīng)同時(shí)檢測(cè)，具有多重、重復(fù)性好以及檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍寬等優(yōu)點(diǎn)。趙金毅[37]將PCR反應(yīng)變性后的單鏈產(chǎn)物與芯片表面探針雜交之后，利用辣根過氧化酶（HRP）催化形成沉淀在芯片表面發(fā)生沉積，通過芯片顏色變化分析檢測(cè)結(jié)果，建立了包括小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌在內(nèi)的9種食源性致病菌的可視化基因芯片檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)具有準(zhǔn)確、高通量等特點(diǎn)。為了解決芯片制備成本高且檢測(cè)過程繁瑣等缺點(diǎn)，張宏偉等[38]利用PCR結(jié)合試紙條建立了一種快速檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的檢測(cè)方法。結(jié)果表明該檢測(cè)體系靈敏度高（檢測(cè)限為100CFU/mL），準(zhǔn)確快速，可用于樣品快篩。目前針對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的芯片制備技術(shù)尚未成熟，所以該檢測(cè)技術(shù)未能廣泛推廣使用。

2 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

2.1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）是一種靈敏度高、反應(yīng)速度快、不受熱循環(huán)儀器限制的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[39,40]。該技術(shù)能針對(duì)靶基因的六個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)四種特異引物，在鏈置換DNA聚合酶的作用下，僅需15～60 min就能夠?qū)⒑怂岬臄U(kuò)增量達(dá)到原來的109～1010倍[41,42]。Ranjbar等[23]基于新挖掘檢測(cè)靶標(biāo)FR729477 locus建立LAMP檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的方法，結(jié)果表明該方法比PCR的靈敏度高10倍。徐云明等[43]基于靶標(biāo)outL建立一種能夠肉眼可視化檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的LAMP方法。該檢測(cè)體系只需增菌1 h，加標(biāo)雞肉檢測(cè)限為700 CFU/g。雖然LAMP具有很多優(yōu)點(diǎn)，但該反應(yīng)體系的配制對(duì)環(huán)境條件要求嚴(yán)格，需要在無菌的超凈臺(tái)中操作，否則會(huì)因?yàn)闅馊苣z而導(dǎo)致假陽性，而且LAMP無法進(jìn)行多重?cái)U(kuò)增，這限制了其在高通量檢測(cè)方面的發(fā)展[28]。

2.2 滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)

滾環(huán)擴(kuò)增（Rolling Circle Amplification，RCA）是能在DNA聚合酶的催化下使用環(huán)狀模板生成數(shù)千個(gè)重復(fù)的DNA序列[44,45]。與變溫核酸擴(kuò)增相比，RCA更適合現(xiàn)場檢測(cè)[46]。張建等[31]用核酸外切酶Ι將小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌靶標(biāo)16S rDNA序列由雙鏈變成單鏈，然后鎖式探針與模板單鏈結(jié)合延伸一周后，再進(jìn)行下一個(gè)延伸。第二個(gè)延伸過程是在phi29聚合酶鏈置換條件下進(jìn)行的，從模板上將擴(kuò)增產(chǎn)物置換出來，用于擴(kuò)增信號(hào)的檢測(cè)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的檢測(cè)。該方法在穩(wěn)定性、特異性和靈敏度方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。與此同時(shí)，RCA也具有一定的應(yīng)用弊端，即成本高、對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)門檻要求高等[47]。主要原因是：①鎖式探針直接合成成本以及phi29聚合酶成本高；②在實(shí)驗(yàn)的過程中，實(shí)驗(yàn)人員需要優(yōu)化反應(yīng)體系，以減少未成環(huán)鎖式探針和未結(jié)合探針的模板所產(chǎn)生的背景信號(hào)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

2.3 重組酶聚合酶擴(kuò)增

重組酶聚合酶擴(kuò)增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）主要有3種酶參與反應(yīng)。1、重組酶：其主要作用是結(jié)合引物并對(duì)同源區(qū)域進(jìn)行識(shí)別；2、單鏈結(jié)合蛋白：它能夠結(jié)合置換出來的單鏈，以便于后續(xù)反應(yīng)；3、DNA聚合酶：該酶能夠在常溫下催化延伸反應(yīng)，以生成新的DNA鏈[48,49]。目前，該擴(kuò)增技術(shù)所需的引物以及對(duì)應(yīng)的反應(yīng)條件，還需要實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行摸索、設(shè)計(jì)和優(yōu)化，適用于RPA技術(shù)的相關(guān)軟件還有待于進(jìn)一步開發(fā)。劉婧文等[49]建立的實(shí)時(shí)熒光RPA技術(shù)，具有成本低，操作簡單，不受人員、儀器、場地等人為和環(huán)境因素限制的特點(diǎn)，為致病小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌快速初篩定性檢測(cè)提供了數(shù)據(jù)支持和新的方向[50]。鄭宇[29]將SYBR Green I和RPA結(jié)合熒光可視化檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌，構(gòu)建了基于量子點(diǎn)檢測(cè)探針的RPA結(jié)合試紙條檢測(cè)體系，將該菌在實(shí)際樣品中的檢測(cè)也實(shí)現(xiàn)體溫觸發(fā)和快速可視化。此外，核酸等溫?cái)U(kuò)增方法可通過結(jié)合不同方法實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，Xiao等[51]建立基于靶標(biāo)ail的CRISPR/Cas12a-RPA體系來檢測(cè)生豬肉中的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌，檢測(cè)限為1.7 CFU/mL，比qPCR靈敏100倍。本實(shí)驗(yàn)室此前成功開發(fā)了基于CRISPR/Cas12a的檢測(cè)體系用于單增李斯特菌的檢測(cè)[52,53]。

3 總結(jié)與展望

目前已報(bào)道的可用于小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢測(cè)的方法有傳統(tǒng)培養(yǎng)法，免疫學(xué)和分子生物學(xué)方法。傳統(tǒng)培養(yǎng)法（例如使用CIN-1和改良Y瓊脂培養(yǎng)基）對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌進(jìn)行鑒定，但這些方法繁瑣、耗時(shí)、無法快速鑒定菌株是否具有毒性。而免疫學(xué)檢測(cè)方法中所需特異性單克隆抗體制備過程周期長、成本高。因此，通過使用分子生物學(xué)方法來檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌成為主流。

在分子生物學(xué)檢測(cè)方面，除了PCR、qPCR和LAMP檢測(cè)方法較為成熟外，ddPCR、RPA、RCA、變溫?cái)U(kuò)增的生物傳感器等方法都有很好的應(yīng)用前景，尤其是針對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的快速便攜式檢測(cè)，已開發(fā)的檢測(cè)方法匯總于表1。值得注意的是目前該菌的檢測(cè)和鑒定方法往往側(cè)重于檢測(cè)已知的致病菌株，而往往忽略生物型1A菌株。然而，生物型1A的菌株還存有潛在的未知風(fēng)險(xiǎn)，在檢測(cè)過程中故意忽視可能導(dǎo)致調(diào)查或診斷結(jié)果出現(xiàn)偏差。因此建立基于特異性分子靶標(biāo)的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌快速檢測(cè)方法是十分必要的。

表1 總結(jié)和比較小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的分子生物學(xué)檢測(cè)方法Table 1 Summary and comparison of molecular bioassays for Y.enterocolitica

此外，開發(fā)針對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌血清型的檢測(cè)方法也尤為重要。目前常用的血清型分型方法是玻片凝集法。然而，該方法需要5～8 d才能確定血清型，極大地阻礙了其應(yīng)用。為了克服傳統(tǒng)診斷血清型方法的不足，基于分子生物學(xué)檢測(cè)方法已被開發(fā)，但仍存在一定局限性。例如血清型靶標(biāo)覆蓋率不高，因此還有更多小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的血清型靶標(biāo)有待開發(fā)。

針對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的檢測(cè)已有較多檢測(cè)方法的報(bào)道，但現(xiàn)有檢測(cè)方法存在普遍問題有：檢測(cè)設(shè)備昂貴、靈敏度不足、樣品預(yù)處理復(fù)雜等。這些方法的不足就導(dǎo)致對(duì)大量且復(fù)雜的食品樣品難以有效監(jiān)測(cè)。因此現(xiàn)有的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢出率可能被低估。

未來小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌分子生物學(xué)檢測(cè)的研究重點(diǎn)是種靶標(biāo)和血清型靶標(biāo)挖掘、新檢測(cè)方法的開發(fā)驗(yàn)證。以期克服上述不足的同時(shí)為相關(guān)食品生產(chǎn)、零售和監(jiān)管提供可切實(shí)可行的技術(shù)基礎(chǔ)。