盛華明, 李 森, 鄧立春, 姚 勇

(東南大學醫(yī)學院附屬江陰醫(yī)院, 1. 腫瘤內科, 2. 肛腸外科, 江蘇 江陰, 214400)

結直腸癌是男性第3大常見癌癥和女性第2大常見癌癥[1], 有約40%患者會死于結直腸癌[2], 故亟需探尋基于結直腸癌進展?jié)撛跈C制的新療法。研究[3]證實,長鏈非編碼RNA (lncRNA)廣泛參與關鍵的生理病理過程,例如細胞增殖和凋亡、細胞生長和衰老以及免疫激活或失活,并且與腫瘤等疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關。lncRNA發(fā)揮作用的明確機制之一是通過與競爭性內源RNA(ceRNA)競爭海綿微小RNA(miRNA), 從而影響其調節(jié)功能[4]。miRNA是長度約22個核苷酸的非編碼小RNA, 通過直接結合特定靶基因的3′UTR參與基因表達的調節(jié),從而影響細胞分化、發(fā)育、凋亡、增殖和其他生物學活性[5]。研究[6]表明, lncRNA GATA3-反義RNA 1(lncRNA GATA3-AS1)是一種新的反義基因,與GATA3共享啟動子區(qū)域,是GATA3高效轉錄所必需的。lncRNA GATA3-AS1已被證實是胰腺癌[7]、肝癌[8]的致癌基因,然而lncRNA GATA3-AS1在結直腸癌中的表達水平和功能尚未明確。微小RNA-574-3p(miR-574-3p)在結直腸癌組織中表達下調,可作為結直腸癌的新型候選治療劑[9], 但其與lncRNA GATA3-AS1的關系尚未明確。本研究觀察結直腸癌組織中l(wèi)ncRNA GATA3-AS1的表達情況,并探討lncRNA GATA3-AS1在結直腸癌細胞SW620增殖、遷移和侵襲中的作用與機制,以期明確lncRNA GATA3-AS1在結直腸癌中的生物學作用及可能涉及的miRNA調節(jié)機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

收集2019年8月—2021年10月在本院進行手術切除的43例結直腸癌患者(男29例,女14例,均未接受過任何相關性治療)的結直腸癌組織和癌旁組織,所有組織儲存于-80 ℃環(huán)境。本研究經醫(yī)院倫理委員會審核批準,且所有患者知情同意。

結直腸癌細胞株SW620(美國類型培養(yǎng)物保藏中心), Lipofectamine 2000試劑、Super Script第一鏈cDNA試劑盒(美國Invitrogen), SYBR Premix ExTaq Ⅱ試劑盒(大連寶生物工程), Taq Man microRNA試劑盒(美國Applied Biosystems),細胞計數試劑盒8(CCK-8)(日本Dojindo), si-NC、si-GATA3-AS1、miR-NC、miR-574-3p模擬物、anti-miR-NC、anti-miR-574-3p、pcDNA、pcDNA-GATA3-AS1(上海GenePharm), pmirGLO載體、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(美國Promega), 二辛可寧酸(BCA)蛋白測定試劑盒(上海碧云天),聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美國GE Health), 抗E-cadherin抗體、抗N-cadherin抗體(美國Abcam), Matrigel(美國BD Biosciences)。

1.2 細胞培養(yǎng)與分組處理

將結直腸癌細胞SW620培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。將SW620細胞分為si-NC組、si-GATA3-AS1組、miR-NC組、miR-574-3p組、si-GATA3-AS1+anti-miR-NC組、si-GATA3-AS1+anti-miR-574-3p組。根據Lipofectamine 2000試劑說明步驟進行轉染,在6孔板中接種1×105個SW620細胞,待其融合至約70%時,分別用si-NC、si-GATA3-AS1、miR-NC、miR-574-3p模擬物、anti-miR-NC與si-GATA3-AS1、anti-miR-574-3p與si-GATA3-AS1轉染48 h, 后續(xù)進行細胞評價。

1.3 逆轉錄-定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測lncRNA GATA3-AS1和miR-574-3p表達

根據制造商Invitrogen的說明,使用Trizol試劑從結直腸癌組織、癌旁組織和結直腸癌細胞SW620中提取總RNA。使用Super Script第一鏈cDNA試劑盒將合格的RNA[260 nm與280 nm處光密度(OD)比值(OD260 nm/280 nm)為1.8～2.0]轉化為cDNA。使用SYBR Premix ExTaq Ⅱ試劑盒在Applied Biosystems 7500實時PCR系統上進行qPCR, 以GAPDH量化lncRNA GATA3-AS1的相對表達。miR-574-3p水平使用Taq Man microRNA試劑盒按照制造商的說明進行檢測,以U6量化miR-574-3p的相對表達。使用2-△△Ct方法計算相對表達量。引物序列: lncRNA GATA3-AS1正向5′-TTGTTCCCTCTTCGCTCCT-3′, 反向5′-TTGTTCCTTCACCGCATG-3′; miR-574-3p正向5′-ATCGGAAGTTGAGTGAGCCGCGTC-3′, 反向5′-GCCGTGAGTCAGGAGTGGT-3′。GAPDH正向5′-AGAACGGGAAGCTTGTCATC-3′, 反向5′-CATCGCCCCACTTGATTTTG-3′。U6正向5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′, 反向5′-CGCTTCAGAATTTGCGTGTCAT-3′。

1.4 CCK-8法檢測細胞增殖活性

轉染后,在96孔板中接種1×104個SW620細胞。孵育48 h后,加入10 μL CCK-8溶液, 37 ℃保持1 h。通過Synergy H4多功能酶標儀檢測450 nm波長處OD(OD450 nm)。

1.5 克隆形成實驗檢測細胞克隆形成數

轉染后,在6孔板中接種200個SW620細胞。孵育14 d后,將細胞用4%甲醛37 ℃固定10 min, 0.5%結晶紫37 ℃染色15 min, 于顯微鏡下觀察細胞克隆形成數。

1.6 細胞劃痕實驗檢測劃痕愈合率

通過細胞劃痕實驗評估SW620細胞的體外遷移能力。轉染后,將1×105個細胞接種到6孔板中,待細胞融合成單層,用移液器吸頭垂直刮擦細胞單層。用磷酸鹽緩沖液洗滌后,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。使用顯微鏡觀察0 h和24 h的劃痕,通過ImageJ圖像分析軟件檢測劃痕愈合率。

1.7 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力

37 ℃條件下,用30 μg Matrigel對Transwell腔室膜預處理30 min, 形成重建的基底膜。將1×105個結直腸癌細胞(置于200 μL不含胎牛血清的RPMI-1640中)接種到Transwell腔室的上孔,下孔填充600 μL含有10%胎牛血清作為趨化劑的RPMI-1640。孵育48 h后,將細胞在4%甲醛中固定30 min, 然后用結晶紫染色15 min。用濕棉簽小心地從Transwell上表面(內部)去除非侵襲細胞,用顯微鏡(放大倍數200倍)對侵襲細胞進行計數。

1.8 蛋白質印跡法(Western blot)檢測遷移侵襲相關蛋白E-cadherin和N-cadherin表達

轉染后,將SW620細胞在冰上裂解緩沖液中裂解,再將裂解液進行離心(10 min, 12 000轉/min, 4 ℃), 并進行BCA法定量?？偟鞍淄ㄟ^8%～12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離,樣品在轉移緩沖液中電轉移到PVDF膜上。將PVDF膜用5%脫脂牛奶于37 ℃封閉2 h, 4 ℃條件下與抗E-cadherin(1∶1 000)、抗N-cadherin(1∶1 000)和抗GAPDH(1∶2 000)抗體孵育過夜。然后,將條帶與HRP偶聯的山羊抗兔IgG于37 ℃孵育2 h,通過增強化學發(fā)光檢測系統對條帶進行可視化。

1.9 雙熒光素酶報告基因實驗檢測lncRNAGATA3-AS1與miR-574-3p的靶向關系

運用生物信息學軟件LncBase Predicted v. 2預測lncRNA GATA3-AS1與miR-574-3p的靶向結合關系。將含有miR-574-3p潛在位點的lncRNA GATA3-AS1野生型(WT)或突變型(MUT)序列插入到pmirGLO載體中,合成WT-GATA3-AS1或MUT-GATA3-AS1。將1×104個SW620細胞接種到6孔板中,并使用Lipofectamine 2000將WT-GATA3-AS1或MUT-GATA3-AS1與miR-574-3p模擬物或對照miR-NC共轉染。轉染48 h后,收獲細胞,使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。另向SW620細胞中分別轉染pcDNA、pcDNA-GATA3-AS1、si-NC、si-GATA3-AS1,分別設為pcDNA組、pcDNA-GATA3-AS1組、si-NC組、si-GATA3-AS1組, 48 h后通過RT-qPCR檢測miR-574-3p表達。

1.10 統計學分析

2 結 果

2.1 lncRNA GATA3-AS1和miR-574-3p在結直腸癌組織中的表達

結直腸癌組織中l(wèi)ncRNA GATA3-AS1表達量高于癌旁組織(增加約3.24倍), miR-574-3p表達量低于癌旁組織(減少約0.62倍),差異有統計學意義(P<0.05), 見表1。

表1 lncRNA GATA3-AS1、miR-574-3p在結直腸癌組織和癌旁組織中的表達

2.2 干擾lncRNA GATA3-AS1表達對結直腸癌細胞SW620增殖能力的影響

si-GATA3-AS1組SW620細胞中l(wèi)ncRNA GATA3-AS1表達量、細胞增殖活性和克隆形成數均低于si-NC組,差異有統計學意義(P<0.05), 見圖1、表2。

表2 干擾lncRNA GATA3-AS1表達對結直腸癌細胞SW620增殖能力的影響

2.3 干擾lncRNA GATA3-AS1表達對結直腸癌細胞SW620遷移和侵襲能力的影響

si-GATA3-AS1組SW620細胞的劃痕愈合率、侵襲細胞數和N-cadherin蛋白表達量均低于si-NC組,而E-cadherin蛋白表達量高于si-NC組,差異有統計學意義(P<0.05), 見圖2、表3。

A: 細胞劃痕實驗檢測劃痕愈合率; B: Transwell實驗檢測細胞侵襲能力; C: Western blot檢測遷移侵襲相關蛋白E-cadherin和N-cadherin表達。圖2 干擾lncRNA GATA3-AS1表達對結直腸癌細胞SW620遷移和侵襲能力的影響

表3 干擾lncRNA GATA3-AS1表達對SW620細胞遷移和侵襲能力的影響

2.4 lncRNA GATA3-AS1靶向調控miR-574-3p的表達

LncBase Predicted v.2預測結果顯示, lncRNA GATA3-AS1與miR-574-3p含有互補配對的堿基序列,見圖3。miR-574-3p模擬物與WT-GATA3-AS1共轉染的熒光素酶活性低于miR-NC與WT-GATA3-AS1共轉染,差異有統計學意義(P<0.05), 但miR-574-3p模擬物或miR-NC分別與MUT-GATA3-AS1共轉染的熒光素酶活性比較,差異無統計學意義(P=0.850), 見表4。pcDNA組、pcDNA-GATA3-AS1組、si-NC組、si-GATA3-AS1組SW620細胞中miR-574-3p表達量分別為(1.00±0)、(0.41±0.05)、(0.98±0.06)、(2.84±0.24), pcDNA-GATA3-AS1組miR-574-3p表達量低于pcDNA組,si-GATA3-AS1組miR-574-3p表達量高于si-NC組,差異均有統計學意義(P<0.05)。

圖3 lncRNA GATA3-AS1與miR-574-3p的靶向關系預測結果

表4 雙熒光素酶報告基因實驗檢測結果

2.5 miR-574-3p過表達對結直腸癌細胞SW620增殖、遷移和侵襲能力的影響

miR-574-3p組SW620細胞的miR-574-3p表達量高于miR-NC組,細胞增殖活性、克隆形成數、劃痕愈合率、侵襲細胞數和N-cadherin蛋白表達量均低于miR-NC組, E-cadherin蛋白表達量高于miR-NC組,差異有統計學意義(P<0.05), 見圖4、表5。

圖4 miR-574-3p過表達對SW620細胞遷移侵襲相關蛋白表達的影響

表5 miR-574-3p過表達對結直腸癌細胞SW620增殖、遷移和侵襲能力的影響

2.6 抑制miR-574-3p表達對干擾lncRNAGATA3-AS1表達的SW620細胞增殖、遷移和侵襲的影響

si-GATA3-AS1+anti-miR-574-3p組SW620細胞的miR-574-3p表達量低于si-GATA3-AS1+anti-miR-NC組,細胞增殖活性、克隆形成數、劃痕愈合率、侵襲細胞數和N-cadherin蛋白表達量均高于si-GATA3-AS1+anti-miR-NC組, E-cadherin蛋白表達量低于si-GATA3-AS1+anti-miR-NC組,差異有統計學意義(P<0.05), 表明抑制miR-574-3p表達逆轉了干擾lncRNA GATA3-AS1表達對結直腸癌SW620細胞增殖、遷移和侵襲的作用,見圖5、表6。

表6 抑制miR-574-3p表達對干擾lncRNA GATA3-AS1表達的SW620細胞增殖、遷移和侵襲的影響

圖5 抑制miR-574-3p表達對干擾lncRNA GATA3-AS1表達的SW620細胞遷移侵襲相關蛋白表達的影響

3 討 論

將合適的lncRNA作為診斷生物標志物或干預靶點,或可為結直腸癌的診斷和治療提供新的思路。CONTRERAS-ESPINOSA L等[10]利用轉錄組分析將lncRNA GATA3-AS1鑒定為與局部晚期乳腺癌患者新輔助化療耐藥相關的lncRNA。ZHU Y P等[11]發(fā)現, lncRNA GATA3-AS1在人膀胱癌組織中顯著上調。lncRNA GATA3-AS1在胰腺癌[7]、肝癌[8]和三陰性乳腺癌[12]組織和細胞中過表達,敲低lncRNA GATA3-AS1可抑制胰腺癌、肝癌和三陰性乳腺癌細胞增殖,并減弱胰腺癌細胞侵襲能力和肝癌細胞遷移能力。本研究發(fā)現,結直腸癌組織中l(wèi)ncRNA GATA3-AS1表達顯著上調,提示其異常表達可能有助于結直腸癌的進展(類似其在胰腺癌、肝癌和三陰性乳腺癌中的致癌作用)。為了更好地了解lncRNA GATA3-AS1在結直腸癌中的生物學作用,本研究進一步開展體外細胞實驗,發(fā)現干擾結直腸癌細胞SW620中l(wèi)ncRNA GATA3-AS1表達能明顯抑制細胞增殖活性和克隆形成、遷移、侵襲能力,下調N-cadherin表達和上調E-cadherin表達,表明干擾lncRNA GATA3-AS1表達可抑制結直腸癌細胞SW620的遷移和侵襲能力。由此證實, lncRNA GATA3-AS1作為致癌基因而加速結直腸癌的進展。

據報道, miR-574-3p可在上皮性卵巢癌[13]、食管癌[14]和肝癌[15]中充當抗腫瘤因子,抑制癌細胞增殖和轉移。miR-574-3p在結直腸癌組織中低表達,上調其表達可抑制結直腸癌細胞的增殖和遷移,促進細胞凋亡[16]。miR-574-3p在卵巢癌組織和細胞中低表達,過表達miR-574-3p可抑制卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲[17]。miR-574-3p過表達上調了胃癌細胞中E-cadherin的表達,同時下調了波形蛋白的表達[18]。本研究結果顯示, miR-574-3p在結直腸癌組織中表達降低,且miR-574-3p過表達可抑制結直腸癌細胞SW620的增殖、遷移和侵襲能力,表明miR-574-3p在結直腸癌進展中起抑制作用。

lncRNA作為特定miRNA的ceRNA, 可調節(jié)基因表達[19]。例如, LINC00997通過與miR-574-3p相互作用,可促進宮頸癌細胞增殖、遷移、侵襲和自噬[20]。lncRNA ZEB2-AS1通過miR-574-3p/HMGA2軸促進食管鱗狀細胞癌細胞的增殖、遷移和侵襲[21]。為了深入了解lncRNA GATA3-AS1的潛在調控機制,本研究通過生物信息學軟件預測了miR-574-3p與lncRNA GATA3-AS1的靶向關系,發(fā)現兩者含有互補配對的堿基序列,且該結果得到雙熒光素酶報告基因實驗的證實。本研究中,結直腸癌細胞SW620中l(wèi)ncRNA GATA3-AS1可負向調控miR-574-3p的表達,這意味著lncRNA GATA3-AS1可直接結合miR-574-3p, 并破壞miR-574-3p的穩(wěn)定性。本研究還發(fā)現,抑制miR-574-3p表達后,干擾lncRNA GATA3-AS1表達抑制結直腸癌細胞SW620增殖、遷移和侵襲的結果被逆轉。由此表明, lncRNA GATA3-AS1在結直腸癌細胞SW620中充當miR-574-3p的ceRNA, 從而發(fā)揮對結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲的調控作用。

綜上所述, lncRNA GATA3-AS1在結直腸癌中表達上調,可通過調控miR-574-3p促進結直腸癌細胞SW620的增殖、遷移和侵襲,提示lncRNA GATA3-AS1可能作為癌基因在結直腸癌中發(fā)揮作用,具有作為結直腸癌診斷生物標志物的潛在價值。