秦 蕾, 秦 鑫

(1. 北京老年醫(yī)院 普外科, 北京, 100095; 2. 山西醫(yī)科大學(xué), 山西 太原, 030001)

結(jié)直腸癌(CRC)是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其中晚期結(jié)直腸癌患者的預(yù)后仍然不佳[1-2]。研究[3]顯示包括病毒和細(xì)菌感染、酒精、煙草煙霧、衰老、潰瘍性結(jié)腸炎、久坐的生活方式以及基因突變等因素均可能與結(jié)直腸癌有關(guān)。CRC的發(fā)病與3種類(lèi)型的遺傳畸變有關(guān),即染色體不穩(wěn)定(CIN)、微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI)和CpG島甲基化表型(CIMP)[4]。髓樣分化因子88(MyD88)是白細(xì)胞介素-1(IL-1)和Toll樣受體(TLR)信號(hào)傳導(dǎo)的必要適配分子[5]。TLRs是一個(gè)模式識(shí)別受體家族,可識(shí)別各種病原體相關(guān)分子模式(PAMPs), 并激活宿主對(duì)病原體入侵的先天免疫防御。MyD88信號(hào)通路在激活的CD4+T細(xì)胞存活過(guò)程中介導(dǎo)全身和心臟細(xì)胞因子反應(yīng),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移,并與肝細(xì)胞癌(HCC)患者介導(dǎo)的炎癥通路損傷和神經(jīng)退行性組織損傷的預(yù)后密切相關(guān)[6-9]。

研究[10-11]證明MyD88表達(dá)是卵巢癌的不良預(yù)后因素,且在腺病毒角膜炎中發(fā)揮作用。另有研究[12-13]表明,MyD88是炎癥性肺部疾病的治療靶點(diǎn),且在眼表穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮重要作用。既往研究[14]顯示MyD88在結(jié)直腸癌患者癌組織及癌旁正常結(jié)直腸組織中表達(dá),且癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織;MyD88表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者的臨床分期、T分期、M分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),MyD88高表達(dá)的結(jié)直腸癌患者的生存率明顯低于MyD88低表達(dá)的患者。本研究探討MyD88在結(jié)直腸癌患者中的作用,通過(guò)敲除結(jié)直腸癌細(xì)胞中MyD88基因以了解其在細(xì)胞中的功能作用,并分析MyD88敲低導(dǎo)致相關(guān)信號(hào)通路改變的機(jī)制,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

SW460細(xì)胞(上海中科院細(xì)胞庫(kù));MyD88-siRNA重組腺病毒載體及陰性對(duì)照質(zhì)粒購(gòu)自上海吉瑪生物有限公司; DMEM培養(yǎng)基(TOYOBO); Trizol試劑盒(TaKaRa); Hoechst 33258 染色試劑; Western印跡試劑盒(美國(guó)Sigma公司); 全蛋白抽提試劑盒; Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen, 美國(guó)); 磷酸鹽緩沖液(PBS, 美國(guó)Amresco公司); BCA 蛋白定量試劑盒 (Thermo Fisher Scientific); CCK-8 (Dojindo); Matrigel(BD Bioscience),細(xì)胞裂解抽提試劑(碧云天), PMSF(Amresco)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)器材

蘇凈 Airtech超凈工作臺(tái)(北京六一儀器廠(chǎng)); SANYO MCO-15AC細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)強(qiáng)生公司); Nikon Ti-U/Ti-s倒置熒光顯微鏡(日本三菱公司); 5810R型高速離心機(jī)(日本島津公司); 微量移液槍(美國(guó) Promega公司); 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE, 美國(guó)Corning公司); E-Gel Imager凝膠成像儀(美國(guó)Beckma公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 慢病毒感染和穩(wěn)定細(xì)胞系篩選: SW480細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基中,置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng),條件為37 ℃、5%CO2濃度。在HEK293T細(xì)胞中將MyD88敲除質(zhì)粒和空載體與psPAX2和pMD2.G共轉(zhuǎn)染,培養(yǎng)2 d后將上清液過(guò)濾。采用上清感染SW480細(xì)胞,嘌呤霉素篩選2周后提取蛋白和mRNA進(jìn)行驗(yàn)證。將轉(zhuǎn)染空載體和MyD88敲除質(zhì)粒的SW480細(xì)胞分別作為對(duì)照組和MyD88-siRNA組。

1.3.2 細(xì)胞總RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)檢測(cè): 利用TRIZOL提取2組細(xì)胞中總RNA, 具體實(shí)驗(yàn)步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。采用Nanodrop測(cè)定的260 nm與280 nm下吸光度比值(OD260/280 nm比值)計(jì)算總RNA的純度,采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。取2 μL RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以構(gòu)建cDNA文庫(kù),以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量反應(yīng),以GAPDH基因作為內(nèi)參基因。PCR反應(yīng)條件: 95 ℃下2 min預(yù)變性; 95 ℃下15 s, 60 ℃下30 s, 設(shè)置40個(gè)循環(huán); 以2-△△CT方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.3 細(xì)胞總蛋白提取和蛋白質(zhì)印跡法(Western blot): 將細(xì)胞采用含1%PMSF的細(xì)胞裂解緩沖液進(jìn)行冰上裂解30 min, 隨后將裂解液在4 ℃、12 000 g離心10 min, 提取上清液,使用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒進(jìn)行蛋白定量,并加入5×SDS煮沸10 min。將50 μg蛋白采用12% SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離,將凝膠轉(zhuǎn)移至0.45 μm PVDF膜中。采用1%的牛血清白蛋白對(duì)PVDF膜進(jìn)行常溫封閉1 h, 隨后采用稀釋后的抗體在4 ℃搖床上過(guò)夜孵育。采用TBST(0.1% Tween-20)將PVDF膜洗滌3次,每次10 min; 采用山羊抗兔IgG H&L (HRP)二抗常溫孵育1 h, 隨后采用TBST(0.1% Tween-20)將PVDF膜洗滌3次。最后采用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光底物檢測(cè)液對(duì)蛋白條帶進(jìn)行檢測(cè)。

本研究所用抗體及稀釋濃度為: MyD88(1∶1 000, AF5195; Affinity)、GAPDH(1∶1 000, ab181602; Abcam)、NF-κB p65(1∶1 000, AF5006; Affinity)、p-NF-κB p65(1∶1 000,#3033; Cell Signaling)、c-jun(1∶1 000,bs-0670R; Bioss)、p-c-jun(1∶1 000, bs-3172R; Bioss)、goat anti-rabbit IgG H&L (HRP) (1∶2 000, ab7090; Abcam)。

1.3.4 細(xì)胞增殖檢測(cè): 調(diào)整各組細(xì)胞濃度至1.0×104個(gè)/孔并接種于96孔板中,每組分別設(shè)置6個(gè)復(fù)孔,置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng),條件為37 ℃、5%CO2濃度。在培養(yǎng)24、48、72、96 h后,棄掉上層培養(yǎng)基,添加100 μL的10% CCK-8無(wú)血清培養(yǎng)基,孵育1 h后使用微生物板閱讀器(Bio-Tek)計(jì)算細(xì)胞增殖。

1.3.5 細(xì)胞遷移的愈合實(shí)驗(yàn): 將各組細(xì)胞接種于6孔板中,每組分別設(shè)置6個(gè)復(fù)孔,待細(xì)胞生長(zhǎng)至100%時(shí),用20 μL移液管尖劃傷細(xì)胞層,將含10%FBS的培養(yǎng)基替換為無(wú)血清培養(yǎng)基。拍攝細(xì)胞在培養(yǎng)0、48 h后的圖像,計(jì)算細(xì)胞的遷移能力。

1.3.6 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn): 在培養(yǎng)基上室涂上Matrigel, 調(diào)整各組細(xì)胞濃度至9.0×104個(gè)/孔接種于上室,下室為含20% FBS的DMEM培養(yǎng)基。在37 ℃、5% CO2條件下孵育48 h后,取出Transwell室,將培養(yǎng)基丟棄并用無(wú)鈣PBS清洗,而后用甲醇固定細(xì)胞30 min, 用0.1%結(jié)晶紫染色20 min, 再用棉簽輕輕拭去上面未遷移的細(xì)胞,并在顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 siRNA干擾后MyD88蛋白及mRNA表達(dá)水平

在轉(zhuǎn)染siRNA 48 h后,檢測(cè)2組細(xì)胞內(nèi)MyD88的蛋白及mRNA表達(dá)水平。RT-qPCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染MyD88-siRNA后, MyD88的mRNA和蛋白表達(dá)水平均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1), 見(jiàn)圖1。

A: MyD88蛋白水平; B: MyD88 mRNA水平(2組比較, ****P<0.000 1)。圖1 MyD88敲除后2組細(xì)胞蛋白和mRNA表達(dá)水平比較

2.2 MyD88-siRNA干擾后抑制SW480細(xì)胞的增殖

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,MyD88-siRNA組細(xì)胞增殖率、細(xì)胞存活率均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 說(shuō)明MyD88沉默能夠顯著抑制結(jié)直腸癌的細(xì)胞增殖。見(jiàn)圖2。

圖2 2組細(xì)胞的增殖率和存活率的比較

2.3 MyD88-siRNA干擾后抑制SW480細(xì)胞的遷移

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,MyD88-siRNA組的劃痕愈合速度低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1), 見(jiàn)圖3。

圖3 2組細(xì)胞劃痕試驗(yàn)后細(xì)胞愈合情況比較

2.4 MyD88-siRNA干擾后抑制SW480細(xì)胞的侵襲

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,MyD88-siRNA組結(jié)直腸細(xì)胞通過(guò)基底膜遷移的細(xì)胞數(shù)量低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 說(shuō)明MyD88敲除可以顯著抑制SW480細(xì)胞的侵襲。見(jiàn)圖4。

圖4 2組細(xì)胞的侵襲能力比較(放大200倍)

2.5 MyD88對(duì)NF-κB和AP-1信號(hào)通路的影響

Western blot結(jié)果顯示, NF-κB(p65)、p-NF-κB(p-p65)、AP-1(c-jun)和p-AP-1(p-c-Jun)蛋白在MyD88-siRNA組的表達(dá)水平低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 說(shuō)明MyD88沉默可以抑制NF-κB和AP-1信號(hào)通路的蛋白表達(dá)水平。見(jiàn)圖5。

圖5 2組細(xì)胞中NF-κB和AP-1信號(hào)通路相關(guān)蛋白的Western blot結(jié)果

3 討 論

MyD88在先天免疫反應(yīng)中發(fā)揮核心作用,其參與調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路活性[15]和MAPKs-c-jun(AP-1)信號(hào)通路[16]。MyD88和MyD88相關(guān)信號(hào)通路已被證明參與內(nèi)源性和外源性炎癥反應(yīng),以及癌癥相關(guān)細(xì)胞的進(jìn)展和癌變過(guò)程。此外,MyD88異常表達(dá)的檢測(cè)可用于預(yù)測(cè)各種人類(lèi)癌癥(如淋巴癌、肝癌)的預(yù)后[17]。因此,MyD88可作為潛在的致癌標(biāo)志物進(jìn)行相關(guān)研究,對(duì)結(jié)直腸癌的治療有積極的影響。

本研究成功敲除了MyD88,并通過(guò)RT-qPCR和Western blot對(duì)敲除效率進(jìn)行了驗(yàn)證分析,并進(jìn)一步驗(yàn)證MyD88敲除是否會(huì)影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的生物學(xué)特征,結(jié)果表明敲除MyD88可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移,證實(shí)MyD88在結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移中發(fā)揮重要的作用。臨床研究[18]發(fā)現(xiàn)MyD88的SNP位點(diǎn)與結(jié)直腸癌患者的生存率較差密切相關(guān)。此外,MyD88沉默可以降低胰腺癌細(xì)胞的侵襲性和遷移能力[19]。MyD88的高表達(dá)與結(jié)直腸癌患者肝轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后相關(guān)[20]。

然而,MyD88誘導(dǎo)結(jié)直腸癌生物學(xué)行為的具體機(jī)制尚不清楚。有研究[16]通過(guò)比較IL-18-/-、IL-18R1-/-和MyD88-/-結(jié)直腸癌相關(guān)小鼠模型以及野生小鼠發(fā)現(xiàn),MyD88可以通過(guò)IL-18/MyD88通路保護(hù)腸道免受腫瘤發(fā)生的影響。相反的,在LPS處理后的MyD88敲除小鼠中,MyD88可通過(guò)TLR/MyD88通路促進(jìn)結(jié)腸炎向結(jié)直腸癌的惡性轉(zhuǎn)化[21]。目前,MyD88在結(jié)直腸癌進(jìn)展過(guò)程中的雙重功能尚不清楚,其內(nèi)在機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

MyD88信號(hào)在調(diào)節(jié)腸道正常上皮細(xì)胞和癌細(xì)胞的生長(zhǎng)中發(fā)揮作用。NF-κB的上調(diào)與很多腫瘤進(jìn)展過(guò)程相關(guān),參與腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲; AP-1, 特別是c-Jun同樣影響腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[22-23]。多項(xiàng)研究表明,絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)和核因子κB(NF-κB)信號(hào)通路是導(dǎo)致脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的急性肺損傷(ALI)[24]、破骨細(xì)胞生成[25]、神經(jīng)炎癥[26]、動(dòng)脈粥樣硬化[27]、前列腺癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生[28]以及人類(lèi)樹(shù)突狀細(xì)胞激活[29]的關(guān)鍵因素。MyD88敲除可影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的生物學(xué)特征,包括細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移; 在MyD88敲除的細(xì)胞系中,p65、磷酸化p65、c-jun和磷酸化c-jun蛋白表達(dá)均有不同程度的下降。敲低MyD88基因可以影響MyD88介導(dǎo)的NF-κB (p65)和NF-κB的激活A(yù)P-1(MAPKs-c-jun)通路,從而有效延緩腫瘤的侵襲性轉(zhuǎn)化。

綜上所述,MyD88可作為結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制的獨(dú)立因子,并可作為潛在的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物。敲除MyD88基因可以影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移,并降低NF-κB和AP-1通路的活性。