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        柚皮苷對更年期抑郁癥模型小鼠絕望行為的影響及神經(jīng)保護機制研究

        2023-09-09 02:04:56王麗紅趙德萍徐紅丹
        海南醫(yī)學院學報 2023年16期
        關鍵詞:柚皮苷海馬神經(jīng)元

        蘇 婷,王麗紅,于 浩,崔 悅,張 寧,趙德萍,徐紅丹,雷 霞,2

        (1.佳木斯大學藥學院,黑龍江 佳木斯 154007;2.無錫市中醫(yī)醫(yī)院,江蘇 無錫 214071;3.黑龍江中醫(yī)藥大學,黑龍江 哈爾濱150040;4.無錫衛(wèi)生高等職業(yè)技術學校,江蘇 無錫 214071)

        更年期抑郁癥是一種以情緒低落、絕望、焦慮為主要臨床特征的精神疾病,海馬神經(jīng)元損傷是其主要病理特征之一[1]。絕經(jīng)后女性腦內(nèi)的海馬神經(jīng)元細胞缺乏雌激素的保護作用,更加難以應對壓力事件,是導致女性絕經(jīng)后易感抑郁的重要原因[2]。研究表明,壓力刺激會造成前額葉皮層谷氨酸大量釋放,引起神經(jīng)元興奮毒損傷,造成海馬神經(jīng)元細胞過度凋亡,細胞數(shù)量減少[3]。

        柚皮苷(4,5,7-三羥基黃烷酮-7-鼠李糖苷),是一種分布較廣的黃酮類化合物,其在骨碎補中含量較高,具有植物雌激素樣結構[4]。Jung 等[5]研究表明,柚皮苷易通過血腦屏障,并具有較強的抗細胞凋亡作用。進一步研究發(fā)現(xiàn),柚皮苷對神經(jīng)元細胞的抗凋亡作用依賴于激活雌激素受體(estrogen receptor,ER)[6,7]。柚皮苷是否 通過促進更 年期抑郁癥(OVX+CUMS)模型小鼠腦內(nèi)的ER 受體表達而發(fā)揮抗細胞凋亡作用?本文主要探究柚皮苷對OVX+CUMS 模型小鼠海馬雌激素受體及神經(jīng)元細胞凋亡的影響。

        1 資料與方法

        1.1 資料

        1.1.1 動物 SPF 級昆明小鼠,雌性,體重(23±2)g,購自昌盛生物科技有限公司,合格證號:SCXK(遼)2019-0001。所有方案均經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準(許可證號:NO.2019-002)。每只鼠籠(42 cm×30 cm×27 cm)飼養(yǎng)和馴化5 只小鼠,并將其飼養(yǎng)于溫度為(21±2)℃、相對濕度為(62±2)%、光照12 h 晝夜交替環(huán)境下。實驗期間自由飲食、飲水。

        1.1.2 藥品和主要試劑 柚皮苷(純度≥98%,貨號:B21594),購自上海源葉生物科技有限公司;ICI182780,(貨號:531042),購自Sigma;雌二醇(純度98%,S30633),購于源葉生物;BCA 蛋白定量試劑盒(貨號:20201ES76),購自翌圣生物科技(上海)股份有限公司;PVDF 膜和 Immobilon Western HRP 底 物(貨 號:10600023,WBKLS0100),購 自Whatman 公司;ERα、ERβ、GluR2、CAMK Ⅱ、NMDAR1、β-actin、山羊抗兔IgG H&L(HRP)(貨號:ab22595,ab22595,ab52180,ab181052,ab17345,ab8227,ab6721),購自Abcam 公司;Bad、Bcl-2、Caspase3(貨號:BM4241,BA0412,BA2142),購自博士德生物;抗體稀釋液(貨號:E-IR-R106),購自Elabscience。

        1.1.3 主要儀器 光學顯微鏡(型號:BX41,奧林巴斯);化學成像系統(tǒng)(型號:A44116,Thermo);酶標儀(型號:5187149,Thermo);水平搖床(型號:WD9405B,北京市六一儀器廠);電泳儀(型號:MiniPROTEANTetra Cell,BIO-RAD 公 司);半 干轉 膜 儀(型 號:Trans-Blot SD Cell,BIO-RAD 公司);超純水制備系統(tǒng)(型號:RsearchUV UF,上海和泰公司)。

        1.2 方法

        1.2.1 動物分組

        54 只小鼠隨機分為6 組(n=9),即空白組、模型(OVX+CUMS)組、假手術組(SHAM 組)、雌二醇組(E2組)、柚 皮 苷 組 和 柚 皮 苷+ER 阻 斷 劑(ICI182780)組。

        1.2.2 OVX+CUMS 模型復制及給藥

        適應性飼養(yǎng)7 d 后,按馮鈺[8]手術操作方法對空白組外其他各組小鼠進行雙側卵巢摘除手術。每只雌性小鼠均用2%異氟烷后,在其背部區(qū)域做一個切口,找到卵巢周圍的脂肪,拉出卵巢,切除卵巢并剪去余線,隨后將子宮角送回原位。假手術按上述操作進行,但只剪去等體積脂肪塊。

        手術結束14 d 后,對除空白組和SHAM 組外其余各組小鼠按吳熠等[9]應激方式進行刺激。每天隨機進行一種應激刺激,但不連續(xù)使用同一種應激方式,連續(xù)刺激21 d。

        21 d 刺激結束后,空白組、SHAM 組和OVX+CUMS 組每天灌胃0.2 mL 蒸餾水,E2組、柚皮苷組每天分別灌胃等體積E(220.090 mg·kg-1·d-1)、柚皮苷(100 mg·kg-1·d-1),柚皮苷+ICI182780 組先腹腔注 射ICI182780(0.075 mg·kg-1·d-1),15 min 后 灌 胃等體積柚皮苷(100 mg·kg-1·d-1),柚皮苷給藥劑量基于實驗室前期研究結果確定最佳給藥劑量[10]。連續(xù)給藥21 d 后,第22 天進行懸尾實驗,第23 天進行強迫游泳實驗。

        1.2.3 行為學實驗

        1.2.3.1 懸尾實驗 將每只小鼠用膠帶使其懸浮在桌面上方58 cm 處的架子邊緣,并將其放置在離尾巴尖端大約1 cm 的地方,懸掛保持6 min,并在測試的最后4 min 記錄靜止時間。靜止時間判定標準為小鼠被動地且完全靜止不動時,即視為靜止。

        1.2.3.2 強迫游泳實驗 將每只小鼠單獨放置在一個玻璃聚碳酸酯圓柱體中(高度:25 cm;直徑:10 cm),深度為10 cm,水溫保持恒溫,保持6 min,并在測試的最后4 min 記錄靜止時間。靜止時間判定標準如“1.2.3.1”。

        1.2.4 腦組織收集

        行為學結束后,戊巴比妥(80 mg/kg)麻醉后,經(jīng)心臟灌注適量生理鹽水,其中各組3 只小鼠繼續(xù)經(jīng)心臟灌注4%多聚甲醛,立即摘除腦組織,并沿中縫分為半腦,隨后用生理鹽水沖洗表面,用濾紙吸干體表水份,稱重。隨后將3 只灌注多聚甲醛的小鼠腦組織放入4%多聚甲醛固定24 h,其余小鼠腦組織分離海馬后,于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2.5 HE 染色觀察小鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)變化

        將“1.2.4”小鼠腦組織經(jīng)脫水、包埋、切片(厚度為4 μm)、烘片后,對切片進行HE 染色,并于顯微鏡下觀察。

        1.2.6 免疫組化檢測海馬區(qū)ERα 和ERβ 的陽性細胞表達

        按云海龍等[11]步驟進行免疫組化實驗操作,一抗ERα(1∶200)、ERβ(1∶200)和 二抗HRP(1∶500)按相應比例用抗體稀釋液稀釋后進行孵育,最后采用Image J 軟件對每個切片5 個不同視野中的陽性細胞進行分析計算。

        1.2.7 蛋白免疫印跡(WB)法檢測海馬中ERβ、GluR2、CAMKⅡ、NMDAR1、Bad、Bcl-2、Caspase3蛋白表達

        取出海馬,按耿娜[12]方法進行提蛋白、上樣、蛋白含量檢測等操作,經(jīng)上樣、電泳、轉膜、抗體孵育等操作后,使用成像系統(tǒng)通過ECL 化學發(fā)光檢測信號顯影成像,最后應用Image J 軟件對清晰條帶進行分析。各抗體用抗體稀釋液按ERβ(1∶200)、GluR2(1∶500)、CAMK Ⅱ(1∶200)、NMDAR1(1∶500)、Bad(1∶500)、Bcl-2(1∶500)、Caspase3(1∶500)、β-actin(1∶1 000)比例對抗體進行稀釋。

        1.2.8 統(tǒng)計學分析

        2 結果

        2.1 行為學實驗結果

        2.1.1 懸尾實驗結果 與空白組相比,OVX+CUMS 組小鼠靜止時間顯著增加(P<0.01);與OVX+CUMS 組相比,SHAM 組、E2組和柚皮苷組小鼠靜止時間顯著減少(P<0.01);與柚皮苷組相比,柚皮苷+ICI182780 組小鼠靜止時間明顯增加(P<0.05)。結果見圖1。

        圖1 各組小鼠對懸尾實驗的影響(n=9,)Fig 1 Effect of each group of mice on the suspended tailexperiment(n=9,)

        2.1.2 強迫游泳實驗結果 與空白組相比,OVX+CUMS 組小鼠靜止時間顯著增加(P<0.01);與OVX+CUMS 組相比,SHAM 組、E2組和柚皮苷組小鼠靜止時間顯著減少(P<0.01);與柚皮苷組相比,柚皮苷+ICI182780 組小鼠靜止時間明顯增加(P<0.05)。結果見圖2。

        圖2 各組小鼠對強迫游泳實驗的影響(n=9,)Fig 2 Effect of each group of mice on the forced swim experiment (n=9,)

        2.2 HE 染色觀察各組小鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)變化結果

        如圖3 所示,空白組小鼠海馬神經(jīng)元細胞正常,排列緊密;模型組小鼠海馬神經(jīng)元細胞排列稀疏,細胞固縮,胞體減?。慌c模型組相比,SHAM 組、E2組及柚皮苷組小鼠海馬神經(jīng)元細胞完整,排列相對緊密;柚皮苷+ICI182780 組神經(jīng)元細胞與模型組細胞變化相似,胞體減小,細胞排列松散。

        圖3 各組小鼠海馬神經(jīng)元細胞形態(tài)變化(n=9,)Fig 3 Cell morphological changes of hippocampal neurons in each mouse group (n=9,)

        2.3 免疫組化檢測海馬區(qū)ERa 和ERβ 的陽性細胞表達結果

        與空白組相比,OVX+CUMS 組小鼠ERa 表達降低,但無統(tǒng)計學意義(P>0.05),ERβ 表達顯著降低(P<0.01);與OVX+CUMS 組相比,SHAM組、E2組和柚皮苷組小鼠ERa 表達升高,但無統(tǒng)計學意義(P>0.05),ERβ 表達顯著升高(P<0.01);與柚皮苷組相比,柚皮苷+ICI182780 組小鼠ERa 和ERβ 表達顯著降低(P<0.01)。結果見圖4。

        圖4 各組小鼠海馬中ERα 和ERβ 的陽性細胞表達的影響(n=9,)Fig 4 Effect of positive cell expression of ERα and ERβ in the hippocampus of each mouse group(n=9,)

        如圖5 所示,空白組小鼠海馬區(qū)ERα 蛋白表達細胞排列緊密;模型組小鼠海馬區(qū)ERα 蛋白表達細胞減少,核固縮;SHAM 組、E2組及柚皮苷組小鼠較模型組小鼠海馬區(qū)細胞增多,細胞排列稍整齊;柚皮苷+ICI182780 組較柚皮苷組海馬區(qū)細胞減少,且與模型組小鼠細胞形態(tài)相似。

        圖5 各組小鼠ERα 蛋白表達(免疫組化,×200)Fig 5 Expression of ERα protein in each group of mice (immunohistochemical,×200)

        如圖6 所示,空白組小鼠海馬區(qū)ERβ 蛋白表達細胞正常、排列緊密;模型組小鼠海馬區(qū)ERβ 蛋白表達細胞減少,排列松散;SHAM 組、E2組及柚皮苷組較模型組小鼠海馬區(qū)細胞增多;柚皮苷+ICI182780 組較柚皮苷組海馬區(qū)細胞減少,且與模型組小鼠細胞形態(tài)相似。

        圖6 各組小鼠ERβ 蛋白表達(免疫組化,×200)Fig 6 Expression of ERβ protein in each group of mice (immunohistochemical,×200)

        2.4 WB 檢 測 海 馬 中ERβ、GluR2、NMDAR1、CAMKⅡ及凋亡因子Bad、Bcl-2 和Caspase3 的表達結果

        2.4.1 WB 檢測海馬中ERβ 表達結果 與空白組相比,OVX+CUMS 組小鼠ERβ 表達顯著降低(P<0.01);與OVX+CUMS 組相比,SHAM 組、E2組和柚皮苷組小鼠ERβ 表達顯著升高(P<0.01);與柚皮苷組相比,柚皮苷+ICI182780 組小鼠ERβ 表達顯著降低(P<0.01)。結果見圖7。

        圖7 各組小鼠海馬中ERβ 表達結果(n=3,)Fig 7 Results of ERβ expression in the hippocampus of each mouse group (n=3,)

        2.4.2 WB 檢 測 海 馬 中NMDAR1、GluR2、CAMKⅡ表達結果 與空白組相比,OVX+CUMS 組小鼠CAMKⅡ表達顯著升高(P<0.01)、NMDAR1 表達明顯升高(P<0.05)、GluR2 表達顯著降低(P<0.01);與OVX+CUMS 組 相 比,SHAM 組 小 鼠GluR2、CAMKⅡ表達明顯升高(P<0.05),E2組小鼠CAMKⅡ表達顯著下降(P<0.01)、NMDAR1 表達明顯下降(P<0.05)、GluR2 表達顯著升高(P<0.01),柚皮苷組小鼠CAMKⅡ表達明顯下降(P<0.05)、NMDAR1 表達顯著下降(P<0.01)、GluR2表達顯著升高(P<0.01);與柚皮苷組相比,柚皮苷+ICI182780 組小鼠CAMKⅡ、NMDAR1 表達明顯升高(P<0.05),GluR2 表達降低(P>0.05)。結果見圖8。

        2.4.3 WB 檢測海馬中凋亡因子Bad、Bcl-2 和Caspase3 的表達結果 與空白組相比,OVX+CUMS組 小 鼠Bad、Caspase3 表 達 顯 著 升 高(P<0.01),Bcl-2 表 達 極 顯 著 降 低(P<0.001);與OVX+CUMS 組 相 比,SHAM 組、E2組 和 柚 皮 苷 組 小 鼠Bad 和Caspase3 表達顯著降低(P<0.01),Bcl-2 表達顯著升高(P<0.01);與柚皮苷組相比,柚皮苷+ICI182780 組小鼠Bad、Caspase3 表達升高(P<0.01,P<0.05),Bcl-2 表達明顯降低(P<0.05)。結果見圖9。

        圖9 各組小鼠海馬中凋亡因子Bad、Bcl-2 和Caspase3 的表達結果(n=3,)Fig 9 Results of expression of apoptotic factors Bad,Bcl-2 and Caspase3 in the hippocampus of mice in each group(n=3,)

        3 討論

        采用OVX 聯(lián)合CUMS 的抑郁癥模型,能合理地模擬雌激素撤退和遭受壓力性刺激的雙重致病因素[13]。OVX+CUMS 模型可以誘導出抑郁樣行為以及典型的海馬神經(jīng)元過度凋亡,在更年期抑郁癥的機制研究中是較為理想的模型[14,15]。本實驗結果表明,模型小鼠懸尾不動時間與游泳靜止時間均顯著增加,小鼠產(chǎn)生絕望行為,說明OVX+CUMS方法復制的更年期抑郁癥模型小鼠表現(xiàn)人類抑郁的核心癥狀,出現(xiàn)了意志力減弱或情緒低落[1,9]。經(jīng)E2或柚皮苷給藥干預后,小鼠靜止時間均有不同程度的減短,說明柚皮苷能夠減輕小鼠絕望行為。在ER 阻斷劑的作用下,柚皮苷對模型小鼠行為的恢復作用被逆轉,說明ER 可能是介導柚皮苷發(fā)揮作用的重要靶點。

        谷氨酸受體分為離子型受體(NMDAR)和代謝型 受 體(mGLuRs)[16]。研 究 表 明,抑 郁 狀 態(tài) 下,NMDA 受體主要調(diào)控鈣調(diào)蛋白/鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶(CaM/CaMKⅡ)通路,GluR2 亞基的高表達會促進Ca2+內(nèi)流,大量內(nèi)流的Ca2+會在線粒體內(nèi)快速沉積,造成線粒體功能喪失,進一步增加一氧化氮合酶的活性,從而增加NO 的合成[17-19]。因此,當神經(jīng)元含有大量的離子型NMDA 受體時,細胞內(nèi)Ca2+超載,會導致大量神經(jīng)元因興奮性毒性而過度凋亡[20]。海馬神經(jīng)元細胞突觸結構、數(shù)量和功能的缺失正是造成抑郁樣行為的重要原因。本研究發(fā)現(xiàn),模型小鼠海馬神經(jīng)元細胞會出現(xiàn)胞體減小、核固縮等變化,柚皮苷給藥可改善海馬區(qū)病理變化,且能夠上調(diào)GluR2 蛋白表達,抑制海馬區(qū)NMDA 受體蛋白表達,下調(diào)CAMKⅡ表達,從而減輕細胞因興奮毒而死亡。在ER 阻斷劑干預下,也反向驗證了柚皮苷抑制谷氨酸受體調(diào)節(jié)的鈣超載作用依賴于ER 受體。

        本文通過對海馬區(qū)ERα 和ERβ 蛋白表達進行半定量,結果發(fā)現(xiàn)柚皮苷上調(diào)了模型小鼠海馬ERβ蛋白的表達,但對ERα 無明顯影響,與文獻結論一致[21],提示柚皮苷主要激活海馬區(qū)ERβ,而非ERα(主要調(diào)節(jié)外周激素分泌水平)。張陽等[22]證實了ERβ 對海馬神經(jīng)元細胞有保護作用。ERβ 激活下游信號,主要通過調(diào)節(jié)核移位發(fā)揮基因組效應,促進 抗 凋 亡 因 子Bcl-2 的 合 成[7]。Bcl-2 家 族 和Caspase3 家族不斷激活可發(fā)揮抗細胞凋亡作用[6],但是動物在遭受反復刺激后,往往出現(xiàn)Bcl-2/Bad 比值極顯著降低,預示著大腦相應區(qū)域的細胞過度凋亡。柚皮苷具有抗細胞凋亡作用,但在ICI182780作用下其抗凋亡作用明顯降低,說明柚皮苷可能通過激活海馬區(qū)ERβ 減少神經(jīng)元細胞過度凋亡。

        4 結論

        柚皮苷可能通過激活更年期抑郁癥模型小鼠海馬區(qū)ERβ,抑制谷氨酸受體激活引起的神經(jīng)元興奮毒,減少海馬神經(jīng)元細胞凋亡,改善絕望行為。

        作者貢獻度說明:

        蘇婷、于浩、崔悅、趙德萍:建立模型、指標檢測、數(shù)據(jù)整理與分析、撰寫論文;王麗紅、張寧、徐紅丹:指導實驗、修改論文;雷霞:基金支持、論文審閱。

        所有作者不存在利益沖突關系。

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