張麗芳，康俊杰，張建雄，鄭百芹，劉 洋

（1.唐山市食品藥品綜合檢驗檢測中心，唐山 063000；2.河北省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測技術(shù)創(chuàng)新中心，唐山 063000；3.唐山市功能性農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，唐山 063000；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（唐山），唐山 063000））

尼卡巴嗪（nicarbazin）又名球蟲凈，是一種廣譜、高效和性能穩(wěn)定的抗球蟲藥，可有效預(yù)防和治療雞等禽類的球蟲病。它預(yù)防效果好，耐藥性極慢，安全性高，有促生長作用，被廣泛應(yīng)用于雞的養(yǎng)殖環(huán)節(jié)[1-2]。尼卡巴嗪由4,4-二硝基均二苯脲（4,4'-Dinitrocarbanilide,DNC）與2-羥基-4,6-二甲基嘧啶（2-hydroxy-4,6-dimethylpyrimidine,HDP）兩種化合物組成，兩者均由家禽消化道吸收，并廣泛分布于組織及體液中。DNC通過糞便排出，代謝緩慢，HDP以尿液排出，代謝消除迅速[3]。國內(nèi)外均以DNC作為尼卡巴嗪在雞組織中的殘留標(biāo)志物[4]。GB31650-2019[5]規(guī)定尼卡巴嗪殘留標(biāo)志物在雞的所有組織中最高殘留限量為200 μg/kg。雞組織中殘留的DNC經(jīng)烹飪加熱后可誘導(dǎo)產(chǎn)生對硝基苯胺[6]，此化合物具有高毒性。尼卡巴嗪在禽類組織中不同程度的殘留會對人體健康產(chǎn)生潛在危害[7-8]。

測量不確定度定義為表征合理地賦予被測量之值分散性的非負(fù)參數(shù)。它是定量闡明檢測結(jié)果品質(zhì)優(yōu)良的重要指標(biāo)[9-11]，同時可分析和評定影響測量結(jié)果準(zhǔn)確性的各個分量，充分掌握關(guān)鍵因素，提高結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。不確定度作為合格判定的重要參考依據(jù)，將最大限度地減少最大殘留限量附近殘留水平合規(guī)決定中可能存在的爭議[12-13]。CNASGL006:2019《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》[14]改進(jìn)了當(dāng)測量結(jié)果接近于零時的不確定度評定，完善了帶有測定不確定的結(jié)果的符合性判定指南，使實驗室對提供測量不確定度的要求和方法日趨明確。目前獸藥殘留量的測量不確定評定方法仍不成熟[15-19]，存在一定的局限：如方法回收率未作為評定的考慮因素，忽略試劑的膨脹，量器在計算不確定度過程中選擇矩形分布、三角分布或正態(tài)分布計算方式不明確等。本文以GB29690-2013[20]《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 動物性食品中尼卡巴嗪殘留標(biāo)志物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》為檢測方法，采用液相色譜質(zhì)譜法對雞肉中尼卡巴嗪殘留標(biāo)志物殘留量進(jìn)行測定，依據(jù)JJF1135 -2005[21]《化學(xué)分析測量不確定度評定》、JJF1059.1-2012[22]《測量不確定度評定與表示》和CNAS- GL006-2019，綜合考慮各個因素，進(jìn)行測量不確定的評定，建立雞肉中尼卡巴嗪殘留標(biāo)志物殘留量不確定度評定的數(shù)學(xué)模型，分析影響測量結(jié)果準(zhǔn)確性的各關(guān)鍵因素，加強(qiáng)質(zhì)量控制，為科學(xué)評價藥物殘留量結(jié)果提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)4,4'-二硝基均二苯脲（含量100 μg/mL，不確定度5%）和4,4'-二硝基均二苯脲-D8（含量100 μg/mL，不確定度5%），均購自天津阿爾塔有限公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、正己烷（色譜純）購自德國Merck；無水硫酸鈉（分析純）購自天津福晨化學(xué)試劑；試驗用雞肉樣品購自當(dāng)?shù)爻小Ｒ合嗌V-串聯(lián)質(zhì)譜儀（Waters Xevo TQ）購自美國Waters公司；電子天平（HZ2004A）購自常州市衡正電子儀器有限公司；臺式離心機(jī)（D37520）購自德國Thermo公司；氮吹儀（TTL-DC）購自北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司。

1.2 試液配制 75%甲醇水：量取甲醇75 mL，用水溶解稀釋至100 mL；75%甲醇水飽和的正己烷：取75%甲醇水100 mL，加正己烷100 mL，搖勻靜置分層，取上層液；4,4'-二硝基均二苯脲貯備液：精密吸取4,4'-二硝基均二苯脲標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)1.0 mL置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容制備成10 μg/mL的儲備液；1.2.4 4,4'-二硝基均二苯脲中間液：精密吸取4,4'-二硝基均二苯脲儲備液0.1 mL分別置于1 mL容量瓶中，用75%甲醇水定容制備成1 μg/mL的中間液；4,4'-二硝基均二苯脲-D8內(nèi)標(biāo)工作液：精密吸取4,4'-二硝基均二苯脲-D8標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.1 mL置于100 mL容量瓶中，用75%甲醇水定容制備成100 ng/mL的內(nèi)標(biāo)工作液；標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制備：吸取4,4'-二硝基均二苯脲中間液液0.02 mL 置于10 mL容量瓶中；吸取4,4'-二硝基均二苯脲儲備液0.01 mL、0.02 mL、0.05 mL、0.2 mL、0.5 mL置于10 mL容量瓶中，準(zhǔn)確移取4,4'-二硝基均二苯脲-D8工作液1.0 mL置各容量瓶中，用75%甲醇水定容，制備成2、10、20、50、200、500 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線，4,4'-二硝基均二苯脲-D8內(nèi)標(biāo)濃度10 ng/mL。

1.3 試樣提取與凈化 稱取待測雞肉2.00±0.02 g，于50 mL離心管中，添加100 ng/mL 4,4'-二硝基均二苯脲-D8內(nèi)標(biāo)工作液100 μL，加無水硫酸鈉2 g，乙腈8 mL，渦旋0.5 min，超聲5 min，5000 ×g離心10 min，取上清液，于40℃氮氣吹干，加75%甲醇水飽和的正己烷1 mL，渦旋10 s，再加75%甲醇水溶液1.0 mL，充分渦旋混合，于40℃水浴中靜置5 min，2000 ×g離心5 min，取下層清液，濾膜過濾，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.4 儀器條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1×100 mm，1.7 μm）；柱溫：40℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：5.0 μL；流動相：A水，B乙腈；梯度洗脫：0-0.50 min，10%B；0.50-1.20 min，10%B-90%B；1.20-2.10 min，90%B；2.10-2.20 min，90%B-10%B；2.20-3.20，10%B。

電噴霧離子源；負(fù)離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測；-3500V電噴霧電壓；源溫：110℃；霧化溫度：350℃；霧化氣流速：450L/h；錐孔氣流速：50L/h；監(jiān)測離子：DNC 300.9＞136.9（定量），300.9＞106.9（定性），DNC-D8內(nèi)標(biāo)300.9＞141.0。

2 結(jié)果

2.1 不確定度來源分析 根據(jù)試驗檢測步驟和建立的數(shù)學(xué)模型，影響LC-MS/MS測定雞肉中DNC殘留量不確定度的因素有以下幾個方面：①標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度urel（C）；②內(nèi)標(biāo)加入體積引入的不確定度urel（N）；③稱樣量引入的不確定度urel（M）；④樣品前處理過程引入的不確定度urel（E）；⑤樣品的重復(fù)測定引入的不確定度urel（X）；⑥標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度urel（Y）；⑦回收率測定引入的不確定度urel（fR）。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度 依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書，4,4'-二硝基均二苯脲的擴(kuò)展不確定為5%（k=2），其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定為0.05/2=0.025，4,4'-二硝基均二苯脲-D8內(nèi)標(biāo)的擴(kuò)展不確定度為5%（k=2），其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定為0.05/2=0.025，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對不確定度為urel（C1）

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制引入的不確定度 配制標(biāo)準(zhǔn)儲備液時，用1000 μL的移液器移取100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)1000 μL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成10 μg/mL的儲備液。該過程不確定度的引入涉及到試劑膨脹、移液器和容量瓶的影響。實驗室溫度通常在20℃±5℃，甲醇的膨脹系數(shù)為0.00118℃-1，服從矩形分布，引入的不確定度為0.00118×5/=0. 00341；1000 μL移液器檢定證書給出的擴(kuò)展不確定度為0.3%（k=2），引入的不確定度為0.003/2=0.00150；A級10 mL容量瓶檢定給出的不確定度為0.008 mL（k=2），引入的不確定度為0.008/2/10=0.00040。標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制引入的不確定度urel（C2）==0.00375。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配制引入的不確定度 由標(biāo)準(zhǔn)曲線配制過程可知，稀釋定容過程使用10 mL容量瓶6次，1 mL容量瓶1次，100 μL可調(diào)移液器5次，1000 μL可調(diào)移液器2次。

2.2.4 容量瓶引入的不確定度 容量瓶引入不確定度的因素：①容量瓶檢定的允許擴(kuò)展不確定度；②實驗室溫度波動引起的體積變化。75%甲醇水體積膨脹系數(shù)為0.000937℃-1，計算如表1。

表1 稀釋過程中容量瓶引入的不確定度Table 1 Uncertainty of the volumetric flask in the dilution process

2.2.5 可調(diào)移液器引入的不確定度 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配制過程中使用100 μL、1000 μL移液器移取不同體積液體，引入不確定度的因素：①移液器本身的允許擴(kuò)展不確定度；②實驗室溫度波動引起的體積變化，根據(jù)儀器根據(jù)實際操作和檢定證書，將標(biāo)準(zhǔn)工作曲線稀釋過程可調(diào)移液器引入的相對不確定度計算如表2。

表2 稀釋過程中可調(diào)移液器引入的不確定度Table 2 Uncertainty of the pipette in the dilution process

綜上，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（C3）=0.02379。

2.2.6 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的合成不確定度 綜上，標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的相對不確定度為urel（C）

2.3 內(nèi)標(biāo)加入體積引入的不確定度 內(nèi)標(biāo)配制濃度為100 ng/mL，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線定容體積均為10 mL，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線中內(nèi)標(biāo)加入量為1.0 mL，試樣中內(nèi)標(biāo)加入量為100 μL，試樣經(jīng)提取定容處理后，標(biāo)準(zhǔn)曲線和試樣上機(jī)濃度均為10 ng/mL，內(nèi)標(biāo)維持在同一水平。內(nèi)標(biāo)配制過程產(chǎn)生的不確定度帶來的影響可以忽略，只考慮標(biāo)準(zhǔn)曲線中內(nèi)標(biāo)加入體積帶來的不確定度urel（1000 μL內(nèi)）和試樣中內(nèi)標(biāo)加入體積帶來的不確定度urel（100 μL內(nèi)）。內(nèi)標(biāo)加入體積引入的不確定度urel（N）計算過程如表3。

表3 相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（N）Table 3 Relative standard uncertainty urel（N）

2.4 樣品稱量引入的不確定度 試樣經(jīng)高速均質(zhì)機(jī)勻漿，樣品的均勻性引入的不確定度可忽略。根據(jù)分析天平的校準(zhǔn)證書，最大允許偏差為0.01 g，稱量樣品2.00 g，服從矩形分布，由稱量引起的不確定度urel

2.5 樣品前處理過程引入的不確定度 定容步驟為加75%甲醇水溶液1.0 mL。75%甲醇在20℃±5℃條件下的體積膨脹系數(shù)為0.000 937℃-1，其相對不確定度為0.00 270。1.0 mL使用1000 μL移液器移取，其允許擴(kuò)展不確定度為0.3%，引入的不確定度為0.00 150。前處理過程引入的合成不確定度為urel（E）0.00 309。

2.6 樣品重復(fù)測定引入的不確定度 在空白基質(zhì)中添加DNC標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，制成5 μg/kg的陽性樣品，重復(fù)測定6次，計算樣品重復(fù)測定引入的不確定度，結(jié)果如表4。

表4 雞肉中尼卡巴嗪殘留標(biāo)志物含量重復(fù)測定結(jié)果Table 4 Repeated determination results of nicarbazine residue marker in chicken

樣品重復(fù)測定引入的不確定度為A類不確定度，根據(jù)表5重復(fù)測定結(jié)果，計算樣品重復(fù)測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差為：=0.08050；樣品重復(fù)測定的標(biāo)準(zhǔn)不確定度U（X）==0.03286；樣品重復(fù)測定引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（X）==0.00771。

表5 4,4′-二硝基均二苯脲標(biāo)準(zhǔn)曲線測定結(jié)果Table 5 Results of 4,4′-Dinitrocarbanilide standard curve

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度 系列濃度為2、10、20、50、200、500 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線中含有濃度為10 ng/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。因使用內(nèi)標(biāo)校準(zhǔn)，則以待測物峰面積和內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值為橫坐標(biāo)，以待測物濃度和內(nèi)標(biāo)物濃度比值為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線測定結(jié)果如表5。

其中，p為標(biāo)準(zhǔn)溶液測定次數(shù)（p=6）；

標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：U（Y）

其中：SR為標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的剩余標(biāo)準(zhǔn)差；a為曲線的斜率；n為樣品重復(fù)測定次數(shù)（n=6）；Ci為標(biāo)準(zhǔn)溶液各點的濃度；C樣平均為重復(fù)測定樣品提取液DNC濃度的平均值；C平均為標(biāo)準(zhǔn)溶液各濃度的平均值；p為標(biāo)準(zhǔn)溶液測定次數(shù)（p=6）。

2.8 回收率引入的不確定度 在雞肉中分別添加質(zhì)量濃度為5、25、50 μg/kg的目標(biāo)分析物，每個濃度作3個平行，回收率計算結(jié)果如表6，回收率引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（fR）=0.02411

表6 回收率測定結(jié)果與不確定度Table6 The recovery and uncertainty of pesticides

2.9 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度及貢獻(xiàn)率 根據(jù)各分量評定的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度，合成尼卡巴嗪殘留標(biāo)志物殘留量的測量相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度，并評定各個分量對測量不確定度的貢獻(xiàn)率，結(jié)果如表7。依據(jù)JJF1059.1-2012，不確定度為U（X）=4.26×0.005459=0.23 μg/kg，擴(kuò)展不確定度為U=K×U（X）=0.46 μg/kg。因此，用液相色譜質(zhì)譜法測定雞肉中尼卡巴嗪殘留標(biāo)志物的含量時，擴(kuò)展不確定為0.46 μg/kg（k=2），試樣中尼卡巴嗪殘留標(biāo)志物的含量表示為：4.26±0.46 μg/kg（k=2）。各分量對合成不確定度的影響從大到小依次為標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、回收率、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、樣品重復(fù)測定、前處理過程、內(nèi)標(biāo)加入體積、稱量。

表7 尼卡巴嗪殘留標(biāo)志物殘留量測定的合成不確定度Table 7 The relative standard uncertainty of nicarbazine residue marker

3 討論

本文按照GB 29690-2013對雞肉中尼卡巴嗪殘留標(biāo)志物殘留量進(jìn)行檢測，通過對整個試驗過程不確定度來源的分析和評定，確定影響測量結(jié)果不確定度的主要因素為標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、回收率和標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合。評估結(jié)果與蒙麗瓊等[23]研究基本一致，但三個因素的順序不同?？剂吭?，與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)自身的不確定度和稀釋過程有關(guān)。黃榮浪等[24]認(rèn)為不論試驗結(jié)果是否折算回收率，回收率對試驗結(jié)果的不確定度均存在顯著影響，與本文評定結(jié)論一致。已報道的對回收率的不確定評定均采用一個添加濃度的平行測定，本文對高、中、低三個濃度進(jìn)行評定，主要考慮了實際待測樣品殘留量的不確定性。李文杰等[25]評定水產(chǎn)品中氟苯尼考?xì)埩袅繙y量不確定度的結(jié)論為標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液配制、曲線擬合是主要因素，回收率的影響并不突出，考慮可能與所評定目標(biāo)物本身的性質(zhì)和檢測方法有關(guān)。

為完善該檢測方法的質(zhì)量控制體系，在日常工作中應(yīng)對標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、回收率和標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合等幾個關(guān)鍵步驟嚴(yán)格控制，保證檢測結(jié)果質(zhì)量。標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程對合成不確定的貢獻(xiàn)率較大，主要與量器誤差、量器使用頻次，以及實驗人員的操作水平有關(guān)[26-27]。在配制標(biāo)準(zhǔn)溶液時，應(yīng)選擇國家認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心生產(chǎn)的合格、有效的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，盡量減少稀釋定容過程，考慮待測樣品實際含量的不確定性和儀器的檢測性能，選擇合適梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，降低由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度。建議在進(jìn)行準(zhǔn)確度要求較高的測量時，如：能力驗證、盲樣考核、檢出值在限量值附近等情況時，標(biāo)準(zhǔn)曲線方法得到初步結(jié)果后，選擇單點校正的方式進(jìn)行確定，可有效降低檢測過程中的不確定度?；厥章鼠w現(xiàn)了檢測過程中對目標(biāo)物的提取和凈化效率，可通過優(yōu)化前處理過程、配制基質(zhì)標(biāo)液降低機(jī)制效應(yīng)等方法提升加標(biāo)回收率。此外，試驗過程中使用的量器必須檢定合格；加強(qiáng)儀器的維護(hù)保養(yǎng)，保證測定時儀器處于最佳狀態(tài)；提高檢測人員的操作水平，配合多種質(zhì)控手段，有效控制和提高實驗室的數(shù)據(jù)質(zhì)量，為藥物殘留量測量結(jié)果的科學(xué)性提供依據(jù)。