徐晴晴，王 峰，王文秀，莫 玲，沈志強(qiáng)1,

（1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 博士后科研工作站，濱州 256600；2.揚(yáng)州大學(xué) 博士后科研流動(dòng)站，揚(yáng)州 225009；3.太倉(cāng)廣東溫氏家禽有限公司，太倉(cāng) 215488；4.山東省院士工作站，濱州 256600））

禽白血病病毒（Avian leukosis virus,ALV）屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒，其通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶形成cDNA，在整合酶的幫助下插入宿主的基因組中形成前病毒引起患病禽的腫瘤性疾病和免疫抑制[1]。當(dāng)前主要根據(jù)gp85基因序列的同源性將ALV分為A-K共11個(gè)亞群，在無(wú)有效疫苗和藥物的情況下，主要通過(guò)及時(shí)淘汰陽(yáng)性雞來(lái)建立無(wú)外源性ALV感染的種雞群[2]。我國(guó)于2012年首次發(fā)現(xiàn)并分離到了K亞群禽白血病病毒（Avian leukosis virus subgroup,ALV-K）[3]。近年來(lái)，ALV-K在我國(guó)不同地區(qū)和多個(gè)地方品種雞的檢出率呈上升趨勢(shì)且超過(guò)了經(jīng)典的ALV-A和ALV-B[4-6]。因此，在實(shí)施ALV凈化時(shí)應(yīng)加強(qiáng)對(duì)地方品種雞中ALV-K的調(diào)查和監(jiān)測(cè)，避免重組進(jìn)化出新的ALV亞群毒株而帶來(lái)更加復(fù)雜的感染情況[7]。

有規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）存在于絕大多數(shù)細(xì)菌和古細(xì)菌中，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的CRISPR-RNA（crRNA）與反式激活的tracr RNA（trans-activating CRISPR tracr RNA）共同構(gòu)成引導(dǎo)RNA（guide RNA,gRNA），gRNA可引導(dǎo)核酸內(nèi)切酶Cas蛋白（CRISPR associated protein）對(duì)噬菌體的基因片段進(jìn)行切割，構(gòu)成細(xì)菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。Cas13a是一種RNA核酸內(nèi)切酶，屬于第2類(lèi)CRISPR/Cas系統(tǒng)中的Ⅵ型[8]，能在crRNA的引導(dǎo)下特異性切割靶標(biāo)RNA，并在切割完成后仍保持活性，繼續(xù)切割其他非靶標(biāo)RNA，即具有“附帶切割”能力[9]。利用Cas13識(shí)別靶序列后的附帶切割效應(yīng)，2017年，Gootenberg等[10]開(kāi)發(fā)了特異性高靈敏度酶解報(bào)告基因解鎖（specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking,SHERLOCK）檢測(cè)系統(tǒng)?；贑RISPR/Cas13a的SHERLOCK反應(yīng)系統(tǒng)在1~2 h內(nèi)便可肉眼觀測(cè)病原體的檢測(cè)及分型結(jié)果，特別是在野外和醫(yī)療設(shè)備欠缺的地區(qū)。本研究建立了ALV-K的CRISPR/Cas13a檢測(cè)體系，配合試紙條的應(yīng)用使檢測(cè)結(jié)果可視化，為臨床病例的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 病毒核酸PCR鑒定為陽(yáng)性的禽白血病病毒A/B/J亞群毒株（ALV-A/B/J）、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒（Reticuloendotheliosis virus,REV）、雞馬立克氏病病毒（Marek’s disease virus,MDV）、雞傳染性貧血病毒（Chicken infectious anemia virus,CIAV）、雞傳染性法氏囊病毒（Infectious bursal disease virus,IBDV）、雞傳染性支氣管炎病毒（Avian infectious bronchitis virus,IBV）和雞新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）的病料由本實(shí)驗(yàn)室保存，按照AxyGen DNA/RNA提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)制備這些病毒的核酸備用。

1.2 主要試劑DNA提取試劑盒購(gòu)自AxyGen公司；pMD18-T載體、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、DL2000 DNA marker均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；rNTP solution mix、Murine RNase inhibitor、HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit均為New England Biolabs產(chǎn)品購(gòu)自國(guó)內(nèi)代理商；TwistAmp Basic、Milenia HybriDetect 1均購(gòu)自TwistDx產(chǎn)品。

1.3 RPA引物的設(shè)計(jì)RPA引物一般長(zhǎng)30~35個(gè)核苷酸，引物短會(huì)影響重組酶的活性。5'端的前3個(gè)核苷酸應(yīng)當(dāng)避免聚鳥(niǎo)嘌呤，3'末端是鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶可以提升引物的擴(kuò)增性能。參照GenBank中已經(jīng)發(fā)表的ALV-K全基因組序列，使用DNAStar軟件尋找一段在K亞群毒株的gp85基因中比較保守，而與其他亞群ALV毒株差異性大的核酸序列作為目標(biāo)區(qū)域，按照上述原則來(lái)設(shè)計(jì)RPA引物表1，在上游引物的5'端加入25 bp的T7啟動(dòng)子序列，使RPA擴(kuò)增后的目的片段能轉(zhuǎn)錄為Cas13a的靶標(biāo)RNA。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

表1 設(shè)計(jì)的引物和crRNATable 1 Designed primers and crRNA

1.4 RPA反應(yīng)條件的優(yōu)化根據(jù)TwistAmp?Basic kit的說(shuō)明書(shū)來(lái)優(yōu)化RPA反應(yīng)體系，每個(gè)RPA酶預(yù)混粉劑可以配置4個(gè)反應(yīng)體系，先計(jì)算好待測(cè)樣品的數(shù)量，再加上陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照來(lái)配置總的預(yù)混液，混勻后分裝為9 μL/管，最后分別加入1 μL的DNA模板。測(cè)試反應(yīng)體系在不同溫度、引物濃度、反應(yīng)時(shí)間下的擴(kuò)增效果。

1.5 crRNA的設(shè)計(jì)及體外轉(zhuǎn)錄RPA擴(kuò)增得到的目的基因片段大小一般為100~200 bp，在目的基因片段中選擇與上、下游引物均不重疊的28 bp作為crRNA的靶向序列，應(yīng)用NCBI BLAST進(jìn)一步確定該序列的特異性。通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄來(lái)產(chǎn)生crRNA單鏈的DNA序列組成為：25 bp T7啟動(dòng)子序列（GAAATTAATACGACTCA CTATAGGG）+36 bp與LwCas13a蛋白結(jié)合的錨定序列（GATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACT AAAAC）+28 bp目的基因靶向序列的反向互補(bǔ)序列。通過(guò)引物合成后退火及T7 Quick High Yield RNA Synthesis kit轉(zhuǎn)錄為crRNA，得到的crRNA利用Agencourt RNAClean XP磁珠進(jìn)行純化。

1.6 LwCas13a蛋白的表達(dá)與純化構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-LwCas13a并轉(zhuǎn)化至Rosetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，優(yōu)化條件使其為可溶性表達(dá)。按照NTA-Ni柱說(shuō)明書(shū)進(jìn)行親和層析純化LwCas13a蛋白并進(jìn)行透析和超濾濃縮。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中利用SDSPAGE進(jìn)行蛋白大小分析，確保純化后得到的是目的蛋白。

1.7 CRISPR/Cas13a反應(yīng)體系的建立先通過(guò)RPA擴(kuò)增ALV-K的cDNA，再將RPA擴(kuò)增產(chǎn)物、crRNA、LwCas13a蛋白、RNA報(bào)告分子等成分制備CRISPR/Cas13a反應(yīng)體系，每個(gè)反應(yīng)體系有10 μL。實(shí)際應(yīng)用時(shí)需數(shù)好待測(cè)樣品的數(shù)量，加上陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照來(lái)配置總的預(yù)混液，混勻后分裝為9 μL/管，再分別加入1 μL的RPA擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板。將反應(yīng)管置于水浴鍋或PCR儀等能保持恒溫的儀器中，37℃孵育適當(dāng)時(shí)間后向各反應(yīng)管中分別加入50 μL HybriDetect 1 assay buffer（來(lái)自Milenia HybriDetect 1 kit），移液器上下吹吸混勻，插入試紙條進(jìn)行顯色。

1.7.1 反應(yīng)的特異性 分別以感染雞的其他常見(jiàn)病毒ALV-A/B/J、REV、MDV、CIAV、IBDV、IBV、NDV的DNA或cDNA為模板，使用所建立的CRISPR/Cas13a方法進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證其與其他病毒是否存在交叉反應(yīng)。

1.7.2 反應(yīng)的敏感性 設(shè)計(jì)并合成一對(duì)PCR引物（C1/C2）擴(kuò)增包含了RPA目的基因區(qū)域的一段DNA，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后膠回收并克隆至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑單菌落活化，將PCR鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒送測(cè)序。驗(yàn)證后的重組質(zhì)粒pMD18-T-K作為標(biāo)準(zhǔn)品，NanoDrop2000可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)定其濃度為190 ng/μL，用無(wú)RNA酶的水進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)截悢?shù)計(jì)算公式為：（6.02×1023）×（DNA濃度ng/μL×10-9）/（DNA長(zhǎng)度×660）=拷貝數(shù)（copies/μL）。得到的含有不同拷貝數(shù)（107~101copies/μL）的質(zhì)粒溶液作為模板進(jìn)行CRISPR-Cas13a反應(yīng)，檢測(cè)該體系的敏感性。

1.7.3 反應(yīng)的符合性 將臨床上PCR檢測(cè)為ALV-K陽(yáng)性的15份病料組織提取DNA后，分別用建立的CRISPR/Cas13a反應(yīng)體系檢測(cè)，驗(yàn)證該方法的符合性。

2 結(jié)果

2.1 RPA反應(yīng)和crRNA應(yīng)用DNAStar對(duì)ALV-K的基因組進(jìn)行比對(duì)分析后，針對(duì)其gp85基因設(shè)計(jì)了相應(yīng)的RPA引物、標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建所需引物（C1/C2）和crRNA（表1），將設(shè)計(jì)的RPA引物進(jìn)行不同的組合優(yōu)化，并通過(guò)CRISPR/Cas13a反應(yīng)得到了特異性好敏感性高的RPA引物對(duì)（K2F/K3R擴(kuò)增產(chǎn)物為118 bp，表1中斜體加粗標(biāo)記），優(yōu)化后的RPA反應(yīng)體系（10 μmol/L K2F/K3R 3 μL，TwistAmp Rehydration Buffer 30 μL，280 mmol/L醋酸鎂3 μL，ddH2O 6 μL）混勻后分裝為9 μL/管，最后分別加入1 μL的DNA模板，37℃孵育30 min快速擴(kuò)增目的基因。

2.2 LwCas13a蛋白的表達(dá)與純化優(yōu)化后重組質(zhì)粒pET28a-LwCas13a的表達(dá)條件為：0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)，18℃搖床160 rpm，培養(yǎng)16 h。離心收獲菌體，超聲破碎后收集蛋白上清液，用0.45 μm濾膜過(guò)濾。上清液用NTA-Ni柱純化（圖1）。純化后蛋白在透析液中（50 mmol/L Tris-HCl,600 mmol/L NaCl,5%glycerol,2 mmol/L DTT）4℃透析過(guò)夜，超濾管濃縮至終濃度為2 mg/mL，分裝為5 μL/管存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

圖1 純化后的LwCas13a蛋白Fig.1 Purif ied LwCas13a protein

2.3 CRISPR/Cas13a反應(yīng)體系的建立優(yōu)化后的CRISPR/Cas13a反應(yīng)體系（ddH2O 6.25 μL，0.25 μL HEPES pH6.8 1 mol/L，0.1 μL MgCl21 mol/L，0.4 μL rNTP solution mix 25 mmol/L，1.0 μL LwaCas13a 63.3 μg/mL，0.5 μL Murine RNase inhibitor 40 U/μL，0.25 μL T7 RNA polymerase 5 U/μL，0.5 μL crRNA 10 ng/μL，0.1 μL RNA 報(bào)告分子100 μmol/L）再分別加入1 μL的待測(cè)RPA擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，37℃孵育50 min來(lái)檢測(cè)目的基因。RNA報(bào)告分子兩端分別標(biāo)記了5/6-羧基熒光素（FAM）和生物素（Biotin）。Milenia HybriDetect試紙條 上劃有與Biotin結(jié)合的鏈霉親和素作為對(duì)照線(xiàn)（C線(xiàn)）和用于捕獲與膠體金偶聯(lián)的抗FAM一抗的檢測(cè)線(xiàn)（T線(xiàn)）。CRISPR/Cas13a反應(yīng)產(chǎn)物流經(jīng)納米金標(biāo)抗FAM抗體時(shí)，體系中RNA報(bào)告分子的FAM端會(huì)標(biāo)記上納米金。若樣本中含有ALV-K，則crRNA、LwCas13a蛋白和RPA擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄后的RNA形成復(fù)合體激活LwCas13a蛋白的RNA酶活性，切割體系中的RN A（包括RNA報(bào)告分子）。若RNA報(bào)告分子被全部切斷則其FAM端會(huì)流過(guò)C線(xiàn)到達(dá)T線(xiàn)被抗抗體捕捉而顯色；當(dāng)只有一部分RNA報(bào)告分子被切斷時(shí)，C和T線(xiàn)都會(huì)顯色，這兩種情況都表明樣本中含有ALV-K判定為陽(yáng)性。若樣本中無(wú)ALV-K，crRNA和LwCas13a蛋白形成的復(fù)合體則不能激活蛋白的RNA酶活性來(lái)切割RNA。RNA報(bào)告分子未被剪切時(shí)，其Biotin端會(huì)被攔截在C線(xiàn)上顯色而T線(xiàn)不顯色判定為陰性（圖2）。

圖2 CRISPR/Cas13a檢測(cè)體系的反應(yīng)流程Fig.2 Experimental workf low of the CRISPR/Cas13a detection system

2.4 CRISPR/Cas13a反應(yīng)的特異性、敏感性和符合性用建立的ALV-K CRISPR/Cas13a體系檢測(cè)樣品，只有ALV-K的cDNA作為RPA反應(yīng)模板的T線(xiàn)顯色為陽(yáng)性，其他的核酸檢測(cè)只有C線(xiàn)顯色為陰性（圖3）。結(jié)果表明，本方法具有很高的特異性與其他感染雞的常見(jiàn)病毒不存在交叉反應(yīng)。應(yīng)用1 μL含有不同拷貝數(shù)（107~101copies/μL）的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒溶液作為模板，按照1.4和2.1來(lái)配置RPA反應(yīng)體系。再分別取1 μLRPA反應(yīng)產(chǎn)物作為模板按照1.7和2.3的方法進(jìn)行CRISPR/Cas13a檢測(cè)。結(jié)果表明，該方法檢測(cè)ALV-K的靈敏度為50 copies/μL（圖4）。用建立的ALV-K CRISPR/Cas13a方法檢測(cè)15份PCR鑒定為ALV-K核酸陽(yáng)性的樣品，結(jié)果顯示，15份樣品全部為陽(yáng)性，符合率為100 %（圖5）。

圖3 CRISPR/Cas13a檢測(cè)體系的特異性Fig.3 Specif icity of CRISPR/cas13a detection system

圖4 CRISPR/Cas13a檢測(cè)體系的敏感性Fig.4 Sensibility of CRISPR/cas13a detection system

圖5 CRISPR/Cas13a檢測(cè)體系的符合性Fig.5 Conformity of CRISPR/Cas13a detection system

3 討論

根據(jù)傳播的特征和方式，ALV可分為外源性和內(nèi)源性病毒。感染雞的內(nèi)源性ALV為E亞群，主要以cDNA的形式嵌合在雞的染色體基因組中，干擾外源性ALV的檢測(cè)為該病的凈化帶來(lái)很大的困難[1]。感染雞的外源性ALV包括A、B、C、D、J和K亞群，盡管ALV-K的復(fù)制能力較弱且很少引起腫瘤，但發(fā)現(xiàn)其與其他亞群ALV混合感染的情況時(shí)常發(fā)生，而不同亞群毒株的共感染加大了ALV的基因重組及突變[11]。因此，應(yīng)加強(qiáng)地方品種雞中ALV-K的調(diào)查和監(jiān)測(cè)，建立特異、準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)方法。

國(guó)內(nèi)外已經(jīng)建立了多種ALV-K的診斷方式，包括病毒分離、ELISA、LAMP、PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR等[12-16]，這些技術(shù)都有其適用性，但均存在流程繁瑣，時(shí)間較長(zhǎng)的缺點(diǎn)，比如病毒分離操作繁瑣且周期長(zhǎng)，ELISA敏感性低，LAMP易出現(xiàn)假陽(yáng)性，而實(shí)時(shí)熒光定量PCR需要昂貴的設(shè)備和有一定生物技術(shù)的人員才能完成。CRISPR/Cas系統(tǒng)憑借其簡(jiǎn)單、高效的基因編輯能力，已被廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)等多個(gè)研究領(lǐng)域。自2015以來(lái)CRISPR/Cas13a系統(tǒng)的研究突飛猛進(jìn)[17]，被開(kāi)發(fā)為一種快速、便攜、低成本、高靈敏度的分子檢測(cè)體系，在病原體檢測(cè)、耐藥性分析和腫瘤基因突變檢測(cè)等方面取得了顯著突破，具體的被應(yīng)用于寨卡病毒、登革熱病毒、EB病毒、H7N9禽流感病毒、埃博拉病毒、新型冠狀病毒、致病細(xì)菌株及其耐藥基因和SNP分型等多種靶標(biāo)檢測(cè)[18-22]。相比先前的研究，RPA的引入顯著提高了該方法的靈敏度。同時(shí)，基于Cas13a的檢測(cè)體系擁有高靈敏度和高錯(cuò)配敏感性，其特異性的crRNA識(shí)別目標(biāo)序列時(shí)只允許一個(gè)堿基的錯(cuò)配，能準(zhǔn)確的區(qū)分ALV各亞群毒株。商品化試劑盒提取樣品核酸大約10 min，CRISPR/Cas13a體系檢測(cè)ALV-K需要80 min左右，因此2 h內(nèi)便可肉眼觀測(cè)病原體的檢測(cè)及分型結(jié)果。本研究建立了ALV-K的CRISPR/Cas13a檢測(cè)方法，為ALV-K的早期快速診斷、流行病學(xué)調(diào)查和防控提供了技術(shù)支撐。