王贊嘉，錫林高娃，吳金花，布日額，邢家輝，代牡蘭

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué) 生命科學(xué)與食品學(xué)院，通遼 028043；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)乳源性致病菌防控工程技術(shù)研究中心，通遼 028043；3.內(nèi)蒙古民族大學(xué) 乳源性致病菌研究所，通遼 028043）

糞腸球菌（Enterococcusfaecalis）是革蘭氏陽(yáng)性兼性厭氧卵形球菌，其形成不同長(zhǎng)度的鏈條狀；糞腸球菌生存能力強(qiáng)，種類多樣。具有在惡劣條件下（包括高鹽環(huán)境）和寬幅度溫度下（從10℃～45℃）生存的能力[1]。該細(xì)菌屬于人及動(dòng)物腸道中的常在菌，但同時(shí)也是一種機(jī)會(huì)致病菌，在動(dòng)物免疫力低時(shí)可引起感染[2]。腸球菌屬中有50多種成員，而且分布廣泛，其中以糞腸球菌和屎腸球菌為主要成員，占環(huán)境分離菌株的80%以上，已成為僅次于金黃色葡萄球菌的第二大醫(yī)源性感染致病菌[3]。

糞腸球菌的毒力基因聚集在一個(gè)毒力島上。毒力島基因長(zhǎng)度在不同菌株之間只有微小差異，其長(zhǎng)度約為150 kb，GC含量比基因組的其余部分低，兩側(cè)有末端重復(fù)序列[4]。盡管糞腸球菌具有致病潛力，但通常表現(xiàn)出較低的毒性水平，這可以從糞腸球菌作為大多數(shù)人類和動(dòng)物胃腸道的天然定植菌，以及作為益生菌在人類和動(dòng)物已使用了幾十年實(shí)踐來(lái)證明。在其毒力島上，最主要的致病因子是cylA溶血素（Cytolysin,cylA），又稱溶細(xì)胞素，在革蘭氏陽(yáng)性菌中較普遍存在，cylA溶血素對(duì)真核和原核細(xì)胞都具有殺傷作用[5]?？梢允购型醚沫傊囵B(yǎng)基上出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。在各種動(dòng)物模型中，攜帶cylA致病因子的糞腸球菌比不攜帶cylA菌株致病性更強(qiáng)[6]。

糞腸球菌在以往曾被用作“益生菌”菌株在使用，但是由于發(fā)現(xiàn)其攜帶重要致病因子cylA溶血素后，被重新審視其“益生性”而關(guān)注其“致病性”。導(dǎo)致糞腸球菌存在致病性的基因除cylA外，還有多種毒力因子，可以引起多種疾病，致病機(jī)制復(fù)雜，各種毒力因子共同協(xié)作，其毒力因子主要分為兩種，其一為胞外分泌因子，如：絲氨酸蛋白酶（serine protease,sprE）、明膠酶（gelatinase,gelE），對(duì)宿主起到直接殺傷作用；另一種為表面蛋白，如：糞腸球菌表面蛋白（enterococcal surface protein,esp）、聚集物質(zhì)（aggregation substance,AS）、膠原蛋白黏附素（adhesin of collagen,Ace）、腸球菌屬亮氨酸富集蛋白（enterococcal leucine-rich protein A,elrA）、心內(nèi)膜炎抗原（endocarditis antigen,efaA），多為黏附素并且參與生物膜的形成，負(fù)責(zé)細(xì)菌的粘附與定植。作為機(jī)會(huì)性致病菌，引起炎癥反應(yīng)需要具備相應(yīng)的條件，免疫的第一道防線皮膚和黏膜會(huì)保護(hù)機(jī)體，不易被糞腸球菌感染。這時(shí)需要胞外分泌因子為糞腸球菌的粘附創(chuàng)造條件，而溶血素是分泌因子中最具殺傷力的，可以裂解真核細(xì)胞，使組織的完整性遭到破壞，為感染提供條件。因此，溶血素是使糞腸球菌具有致病性的主要毒力因子。

單核巨噬細(xì)胞是動(dòng)物機(jī)體先天免疫系統(tǒng)的“第二道防線”[7]，在動(dòng)物機(jī)體抵御病原感染中發(fā)揮重要的吞噬、殺滅作用，對(duì)于維護(hù)機(jī)體的健康扮演著重要的角色，同時(shí)具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用。單核巨噬細(xì)胞在遇到致病菌侵染時(shí)可以分泌IL-4、IL-10、TNF-α和NOS2等多種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子中有的作為前炎性細(xì)胞因子，具有關(guān)鍵的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。糞腸球菌是乳腺炎的病原菌之一，通過(guò)未經(jīng)巴氏殺菌的鮮牛乳的銷售，有將致病性和耐藥性的糞腸球菌通過(guò)食物鏈傳遞到人類的風(fēng)險(xiǎn)。因此，本實(shí)驗(yàn)擬觀察牛乳腺炎糞腸球菌cylA基因?qū)w外培養(yǎng)的牛單核巨噬細(xì)胞吞噬作用的影響，為研究糞腸球菌的免疫逃逸機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與細(xì)胞 奶牛乳腺炎糞腸球菌臨床分離菌株BME1708和奶牛乳腺炎糞腸球菌cylA基因缺失突變株BME1708ΔcylA由“內(nèi)蒙古自治區(qū)乳源性致病菌防控工程技術(shù)研究中心”保存?zhèn)溆?；牛外周血單核巨噬?xì)胞BMC-7購(gòu)買自青旗（上海）生物技術(shù)發(fā)展有限公司。

1.2 主要試劑 DMEM、澳洲胎牛血清（FBS）購(gòu)自GIBCO；臺(tái)酚藍(lán)、胰蛋白酶、PBS、100×三抗（青霉素、鏈霉素、兩性霉素B）、DMSO、BHI培養(yǎng)基購(gòu)自索萊寶公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備 BSC-1100生物安全柜購(gòu)自北京東聯(lián)哈爾儀器制造公司；SHP-150智能生化培養(yǎng)箱購(gòu)自上海鴻都電子科技公司；CKX41倒置顯微鏡、日本奧林巴斯、BPN-50CH CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自上海一恒科技有限公司；DM500光學(xué)顯微鏡購(gòu)自德國(guó)萊卡。

1.4 牛乳腺炎糞腸球菌的鑒定 配制BHI固體及液體培養(yǎng)基，取出-80℃冰箱凍存?zhèn)溆玫募S腸球菌菌株，于BHI液體培養(yǎng)基中活化。將活化后的糞腸球菌菌株于鮮血固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，12 h后觀察結(jié)果是否出現(xiàn)溶血表型。挑取出現(xiàn)溶血表型的菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基中，擴(kuò)增后進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢和糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。同時(shí)對(duì)cylA基因缺失突變株進(jìn)行溶血活性檢測(cè)。

1.5 牛外周血單核巨噬細(xì)胞的復(fù)蘇 按90%DMEM+10%FBS+1% 100×三抗（青霉素、鏈霉素、兩性霉素B）配制完全培養(yǎng)基。將凍存管從液氮罐中取出，直接浸入37℃溫水中，并不時(shí)搖動(dòng)令其盡快融化。用移液槍吸出細(xì)胞懸液，加到離心管并滴加5倍以上完全培養(yǎng)基混勻，1000 ×g離心10 min。棄去上清液，重懸離心管底部細(xì)胞沉淀，在T25培養(yǎng)瓶中加入5～6 mL完全培養(yǎng)基，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，接種培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。

1.6 牛外周血單核巨噬細(xì)胞的培養(yǎng) 將細(xì)胞分裝至T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加入完全培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每48 h換液一次。細(xì)胞愈合度達(dá)到80%時(shí)，進(jìn)行傳代，吸出完全培養(yǎng)基，PBS緩沖液輕沖洗3遍，加入胰酶2 mL消化（具體時(shí)間視細(xì)胞而定），待細(xì)胞成球形用完全培養(yǎng)基終止消化并將細(xì)胞沖洗下來(lái)。1000 ×g離心10 min，棄上清液收集細(xì)胞。重懸細(xì)胞，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。按每孔1.0×106個(gè)細(xì)胞，接種至12孔板，培養(yǎng)至貼壁。

1.7 牛外周血單核巨噬細(xì)胞的凍存 按90%FBS+10%DMSO配置細(xì)胞凍存液（現(xiàn)用現(xiàn)配）。取待凍存的細(xì)胞用2.0 mL胰酶消化2 min，用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞沖洗下來(lái)。1000 ×g離心10 min，棄上清液收集細(xì)胞。加入1.0 mL細(xì)胞凍存液制成細(xì)胞懸液，裝入3支凍存管中。凍存管在4℃下存放30 min，轉(zhuǎn)放-20℃下放置1.5～2 h，再轉(zhuǎn)入-70℃下放置4～12 h 后即可轉(zhuǎn)移到液氮內(nèi)（-196℃）。

1.8 糞腸球菌侵染牛外周血單核巨噬細(xì)胞臺(tái)酚藍(lán)染色觀察 將糞腸球菌以100∶1的比例稀釋后對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行侵染，吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入1×108個(gè)BME1708或BME1708ΔcylA，37℃侵染30 min，加入三抗，PBS清洗兩次，加入完全培養(yǎng)基。按照時(shí)間梯度2、4、8、12、24、48 h取樣，臺(tái)酚藍(lán)染色，觀察。計(jì)算吞噬率（phagocytic rate,PR）和吞噬指數(shù)（phagocytic index,PI）[8]。PR（%）=噬菌細(xì)胞數(shù)÷細(xì)胞總數(shù)×100%；PI=被噬菌總數(shù)÷噬菌細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 糞腸球菌溶血表型鑒定結(jié)果 野生型糞腸球菌在含有兔血的固體培養(yǎng)基上出現(xiàn)明顯的β溶血圈，符合攜帶cylA溶血素基因的糞腸球菌溶血特性，cylA基因缺失突變株，無(wú)溶血素表達(dá)，無(wú)β溶血圈（圖1）。

圖1 糞腸球菌溶血表型鑒定Fig.1 Identification of hemolysis of Enterococcus faecalis

2.2 革蘭氏染色鏡檢觀察結(jié)果 活化后的BME1708菌株，經(jīng)革蘭氏染色后于光學(xué)顯微鏡油鏡下觀察，細(xì)菌呈紫色、橢圓形，形成長(zhǎng)度不等的鏈條狀排列（圖2）。

圖2 糞腸球菌革蘭氏染色鏡檢觀察結(jié)果（2000×）Fig.2 Gram staining results of Enterococcus faecalis（2000×）

2.3 糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果 BME1708菌株對(duì)木糖、棉子糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性，對(duì)葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、山梨醇和水楊素發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，與糞腸球菌糖發(fā)酵特性相符。

2.4 牛外周血單核巨噬細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果 用倒置顯微鏡觀察巨噬細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈梭形、圓形及橢圓形（圖3）。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)0.25%的胰酶不易消化貼壁細(xì)胞，符合巨噬細(xì)胞具有強(qiáng)大貼壁能力的特點(diǎn)。

圖3 巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)觀察結(jié)果（1000×）Fig.3 Results of macrophage culture in vitro（1000×）

2.5 糞腸球菌侵染巨噬細(xì)胞臺(tái)酚藍(lán)染色觀察結(jié)果 經(jīng)利用BME1708和BME1708ΔcylA菌株對(duì)牛體外培養(yǎng)的單核巨噬細(xì)胞侵染實(shí)驗(yàn)后，結(jié)果表明，被巨噬細(xì)胞吞噬的糞腸球菌可以在細(xì)胞內(nèi)存活，形成明顯的吞噬泡，隨著侵染時(shí)間的延長(zhǎng)有部分巨噬細(xì)胞死亡（圖4）。而且巨噬細(xì)胞對(duì)BME1708ΔcylA的吞噬率和吞噬指數(shù)明顯高于BME1708，吞噬率和吞噬指數(shù)具有顯著差異（P＜0.05），表明牛乳腺炎糞腸球菌cylA基因?qū)εＭ庵苎獑魏司奘杉?xì)胞的完全吞噬功能具有一定的負(fù)調(diào)控作用。吞噬指數(shù)及吞噬率見表1和圖5。

表1 吞噬率和吞噬指數(shù)Table 1 Phagocytic rate and phagocytic index

圖4 糞腸球菌侵染巨噬細(xì)胞Fig.4 Enterococcus faecalis infection of macrophages

圖5 BME1708及BME1708ΔcylA菌株侵染巨噬細(xì)胞的吞噬率（PR/%）和吞噬指數(shù)（PI）Fig.5 Phagocytosis rate（PR/%）and phagocytosis index（PI）of BME1708 and BME1708ΔcylA infected macrophages

3 討論

過(guò)去，糞腸球菌在食品工業(yè)中被用作發(fā)酵劑，一些可以產(chǎn)生腸球素的菌株被用作生物防腐劑[9]。糞腸球菌的致病機(jī)制依賴于多種因素[10]。隨著抗生素的過(guò)度使用，糞腸球菌的耐藥性也逐漸增強(qiáng)，耐藥性增強(qiáng)導(dǎo)致感染后的治療難度加大，同時(shí)毒力基因更容易使糞腸球菌在宿主體內(nèi)定植，使得近年來(lái)糞腸球菌感染率呈明顯的上升趨勢(shì)。

與其他致病菌不同的是糞腸球菌編碼的毒力因子主要對(duì)宿細(xì)胞具有黏附作用。Ró?ańska等[11]研究發(fā)現(xiàn)，從2000份患有乳腺炎的牛奶樣本中分離出的腸球菌屬的細(xì)菌中，糞腸球菌占85%，其中有45%的糞腸球菌具有3種以上的耐藥表型。Yun等[12]對(duì)乳制品公司的散裝牛奶中乳腺炎病原體的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，糞腸球菌的含量?jī)H次于葡萄球菌位居第二。Yoon等[13]從乳制品公司的散裝牛奶中分離腸球菌，其中糞腸球菌占90.23%。這些研究成果表明，該致病菌在牛乳中的存在，足以構(gòu)成牛乳及其產(chǎn)品的生物危害風(fēng)險(xiǎn)和公共衛(wèi)生危害。

糞腸球菌現(xiàn)已成為奶牛乳腺炎的主要致病菌，根據(jù)對(duì)內(nèi)蒙古自治區(qū)東部地區(qū)奶牛乳腺炎乳樣的菌株篩查發(fā)現(xiàn)，糞腸球菌的分離率高達(dá)70%。在本研究中采用的奶牛乳腺炎糞腸球菌臨床分離菌株BME1708的全基因組測(cè)序中發(fā)現(xiàn)，該菌具有27種抗生素耐藥基因和82個(gè)相關(guān)毒力因子，并且發(fā)現(xiàn)了p38-MAPK信號(hào)通路的存在[14]。我們主要研究其中的關(guān)鍵毒力因子溶血素，而cylA基因編碼的蛋白在溶血素的形成過(guò)程中起到最關(guān)鍵的激活功能[15]。本研究以糞腸球菌cylA基因陽(yáng)性野生型菌株和cylA基因缺失突變株侵染巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)cylA基因可以抑制單核巨噬細(xì)胞對(duì)糞腸球菌的吞噬作用。在48 h后野生型菌株在巨噬細(xì)胞內(nèi)仍有“內(nèi)生”的現(xiàn)象，推測(cè)cylA與糞腸球菌被單核巨噬細(xì)胞吞噬后的“內(nèi)生”現(xiàn)象有關(guān)。

本研究為下一步利用BME1708和BME1708ΔcylA基因缺失突變株侵染巨噬細(xì)胞，根據(jù)IL-4、IL-10、TNF-α和NOS2等多種細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)差異情況，以及p38-MAPK信號(hào)通路的激活情況，來(lái)獲得糞腸球菌“逃逸”單核巨噬細(xì)胞的吞噬及清除功能的分子機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。為有效防控該致病菌提供新的思路。