史喜絹，申超超，張大俊，楊 博，張 婷，鄭海學(xué)，張克山

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室 國家口蹄疫參考實驗室，蘭州 730046）

牛傳染性鼻氣管炎（infection bovine rhinotrcheitis,IBR）是由牛傳染性鼻氣管炎病毒（Infection bovine rhinotracheitis virus,IBRV）引起的高度接觸性傳染病。主要表現(xiàn)為牛上呼吸道炎、結(jié)膜炎、傳染性膿皰性外陰道炎或龜頭包皮炎、新生胎牛的全身性感染，有時也可誘發(fā)小牛腦炎等其他類型的疾病[1-2]。該病具有廣泛的嗜組織性，且呈世界性分布，給養(yǎng)牛業(yè)和乳制品行業(yè)造成了不可估量的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。IBRV又稱牛Ⅰ型皰疹病毒（Bovine herpesvirus 1,BHV-1），屬于皰疹病毒科水痘病毒屬，只有1個血清型，分4個亞型[5]。該病毒是有囊膜的雙股DNA病毒，囊膜蛋白在病毒致病中發(fā)揮了重要作用。BHV-1基因組有70多種結(jié)構(gòu)蛋白，其中10種為糖蛋白[6]。gB作為最重要的結(jié)構(gòu)糖蛋白，在病毒吸附、進(jìn)入細(xì)胞及細(xì)胞間擴(kuò)散和融合中起著重要作用，可刺激機(jī)體產(chǎn)生大量的中和抗體，是BHV-1中最保守的抗原蛋白[7-8]，也是疫苗研發(fā)或診斷的主要靶點[9]。

IBR具有宿主特異性，雖然牛被認(rèn)為是該病毒唯一的宿主，但也有豬、羊等動物感染本病的報道[10]，病牛和帶毒牛為主要的傳染源，其中最危險的便為隱性帶毒動物[11]。目前，除少數(shù)國家徹底消滅了IBRV以外，其他大多數(shù)國家均有不同程度的IBRV的流行。1993年全球范圍內(nèi)IBRV的檢測率達(dá)到了60%，1995年對大型牛場進(jìn)行IBRV普查，結(jié)果表明了IBRV 的檢出率為50%，在意大利、新西蘭、英格蘭等對牛場進(jìn)行檢測，均發(fā)現(xiàn)IBRV[12]。我國于1982年首次在從大洋洲進(jìn)口的牛中分離得到IBRV，但當(dāng)時對該病毒的危害認(rèn)識不夠深，沒有采取及時有效的管控措施，導(dǎo)致該病毒在國內(nèi)流行[13]。

目前對于IBR的防控主要采用疫苗免疫和撲殺兩種措施，歐美一些國家多年堅持對帶病牛進(jìn)行撲殺的策略。而快速有效的診斷IBRV及其評估牛群體內(nèi)的IBRV抗體對該病的防控顯得尤為重要。目前臨床上普遍使用ELISA和VNT，在研究牛皰疹病毒4載體疫苗能否引起抗原特異性的保護(hù)性免疫反應(yīng)時，采用ELISA進(jìn)行BVDV和BoHV-1診斷，利用VNT試驗測定中和抗體滴度[14]。ELISA檢測靈敏度高易于操作，但ELISA抗體水平高并不能說明一定產(chǎn)生攻毒保護(hù)；VNT是評價抗體保護(hù)效力的重要方法之一，即VNT抗體水平高意味著能免受病毒攻擊，但VNT操作復(fù)雜耗時較長，對試驗人員及環(huán)境要求較高，不適用于臨床檢測。gB雖然可以作為IBRV診斷和治療研究的靶點，但目前尚無使用gB ELISA抗體水平評估牛群中IBRV抗體保護(hù)效果的報道。因此，本研究試對某牛場采集的50份血清進(jìn)行g(shù)B ELISA抗體檢測，利用VNT試驗對本次血清樣品進(jìn)行IBRV中和抗體的檢測，目的是探索IBRV gB抗體和中和抗體效價的相關(guān)性，為使用gB ELISA抗體評估牛群對IBRV抗體抵抗病毒感染能力及簡便評估疫苗保護(hù)效價提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 血清樣本采自某IBRV發(fā)病且康復(fù)奶牛場。牛腎細(xì)胞（madin-darby bovine kidney,MDBK）及IBRV由本實驗室提供。CIVTEST BOVIS IBRgB抗體試劑盒購自天科生物科技有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)用胎牛血清、鏈霉素，青霉素、0.25%Trypsin及MEM培養(yǎng)基均購自Gibco公司；血細(xì)胞計數(shù)儀購自SYSMIX公司；BioTek多功能酶標(biāo)儀購自美國伯騰儀器有限公司。

1.2 阻斷ELISA檢測方法 包被板上加入100 μL陽性、陰性對照及待檢血清樣品；在36℃～38℃條件下孵育60 min；棄去板中液體，洗板4次；加入100 μL酶標(biāo)記物，輕輕混勻后在36℃～38℃條件下孵育60 min；棄液洗4次；加入100 μL底物液，混勻2 s；在室溫20℃～25℃條件下避光孵育10 min；加入100 μL終止液。選擇酶標(biāo)儀450 nm波長進(jìn)行測定，陰性對照阻斷率（IN%）大于0.65%，陽性對照（IN%）大于60%時試驗成立。血清樣品結(jié)果判定：IN%＜35%，判定為IBRV抗體陰性；IN%＞35%，判定為IBRV抗體陽性。

1.3 血清VNT檢測方法 血清滅活，取IBRV陽性血清、陰性血清和待檢血清各650 μL，置56℃水浴30 min。血清稀釋：用維持培養(yǎng)液將待檢血清均作1∶2、1∶4、1∶8、1∶16稀釋，同時設(shè)標(biāo)準(zhǔn)陰陽性血清對照。毒株的稀釋：將IBRV用維持培養(yǎng)液稀釋至100 TCID50/0.1mL?；旌螴BRV分別與待檢血清和標(biāo)準(zhǔn)陰陽性血清等量混合，置37℃孵育4 h。接種細(xì)胞：將100 μL混合液加入單層MDBK細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，做4個重復(fù)，同時設(shè)陽性和陰性細(xì)胞對照，置37℃、5% CO2溫箱中培養(yǎng)，逐日觀察并記錄CPE，共觀察7 d。結(jié)果判定，在陰陽性對照成立的條件下，待檢血清以至少1/2孔均沒有出現(xiàn)CPE的血清最大稀釋度為中和抗體效價。

1.4 相關(guān)性分析 通過統(tǒng)計學(xué)的分析判斷IBRV gB ELISA抗體IN%值與中和抗體效價值的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)的計算公式[15]如下：

x為血清樣本中和抗體效價平均值的倒數(shù)；y為血清樣本gB ELISA抗體平均S/P值；n為gB ELISA抗體S/P值分段組。如果r＞0，表示其為正相關(guān)；r＜0，表示其為負(fù)相關(guān)。一般來說，相關(guān)系數(shù)取絕對值后，0.09為沒有相關(guān)性，0.1～0.3為弱相關(guān)，＞0.3～0.5為中等相關(guān)，＞0.5～1.0為強(qiáng)相關(guān)。

2 結(jié)果

2.1 ELISA檢測gB抗體結(jié)果 以50份待檢血清，陰性及陽性對照進(jìn)行阻斷IBRV gB-ELISA檢測，結(jié)果顯示，陽性19份，陰性31份（表1）。

表1 IBRV gB-ELISA檢測結(jié)果Table 1 IBRV gB-ELISA test results

2.2 VNT檢測中和抗體結(jié)果 對50份待檢血清進(jìn)行中和抗體檢測，結(jié)果顯示中和抗體＞2的有17份，＜2的有33份（表2）。

表2 IBRV中和抗體檢測結(jié)果Table 2 IBRV neutralizing antibody test results

2.3 血清中和抗體效價和gB抗體的相關(guān)性 在50份血清中，抗體IN%值大于0.35的有16份血清，平均IN%值為0.7739，相應(yīng)的血清中和抗體效價倒數(shù)平均值為9.17；gB抗體IN%值小于0.35的有34份血清，平均IN%值為0.1371，相應(yīng)的血清中和抗體效價倒數(shù)平均值為2（表3）。通過生物統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，gB抗體平均IN%值和中和抗體效價倒數(shù)平均值成正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為1.0，具有強(qiáng)相關(guān)性。

表3 gB ELISA抗體平均IN%值和中和抗體效價倒數(shù)平均值Table 3 The average IN% of gB ELISA antibody and the reciprocal average of neutralizing antibody titer

3 討論

IBR是一種免疫抑制病，感染牛群出現(xiàn)一系列呼吸道癥狀，使育肥牛群的生長延緩、奶牛產(chǎn)奶量降低甚至停乳、懷孕母牛流產(chǎn)等，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[16-17]。該病被世界動物衛(wèi)生組織（World Organisation for Animal Health,OIE）列為B類動物傳染病，據(jù)報道我國牛群IBRV血清陽性率約46%，時有IBRV局部流行，目前對該病的血清學(xué)診斷主要依靠實驗室的VNT或ELISA檢測，尚無自主研發(fā)的商品化的IBRV血清抗體檢測試劑盒[18]。因此省時省力的IBRV抗體檢測方法對該病的防控十分重要。

gB蛋白是IBRV主要的抗原蛋白，且高度保守[19]。gB蛋白主要參與病毒顆粒吸附到細(xì)胞表面以及入侵細(xì)胞的過程，并且gB 蛋白有2個T細(xì)胞識別表位和3個B細(xì)胞的識別表位，因此在病毒入侵過程中能夠誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的特異性免疫反應(yīng)，gB也能產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體[20]?；谝陨咸匦?，gB基因已成為IBRV診斷和治療研究的熱點[21]。本研究對某牛場50份血清進(jìn)行g(shù)B ELISA抗體檢測，陽性19份，陰性31份。隨后對這50份血清進(jìn)行中和抗體檢測，中和抗體大于2的有17份，中和抗體小于2的有33份。雖然目前IBRV的診斷試劑大多數(shù)是針對gB抗原表位，gB也有一定的免疫調(diào)節(jié)潛力[22]，但尚無使用gB ELISA抗體檢測IBRV保護(hù)效果的研究。ELISA方法由于在實際操作中簡便快捷、敏感性高、成本較低等諸多優(yōu)點，使其得到廣泛應(yīng)用；病毒中和試驗耗時較長，工作量較大，敏感性也參差不齊。因此本研究利用gB ELISA抗體評估疫苗的保護(hù)效果。

本研究對血清gB ELISA抗體和病毒中和試驗兩種方法檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)血清gB抗體平均阻斷率和中和抗體效價平均值具有較強(qiáng)的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為1.0。本研究發(fā)現(xiàn)gB ELISA抗體平均阻斷率和中和抗體效價平均值的相關(guān)系數(shù)為0.5～1.0，具有較強(qiáng)的正相關(guān)。IBRV 結(jié)構(gòu)蛋白gB、gC、gD，TK均能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，可以針對IBRV毒力與保護(hù)性相關(guān)成分，研發(fā)更安全和有效的IBRV疫苗[23]。中和抗體效價越高抗體保護(hù)的效果越好，使機(jī)體免受病毒的感染[24]，因此通過檢測gB抗體阻斷率來衡量牛群對IBRV的抵抗力強(qiáng)弱基本可以評估其保護(hù)效價的高低，這為使用gB ELISA抗體水平的方法快速簡便評估牛群中IBRV抗體保護(hù)效果提供數(shù)據(jù)支持，更有利于IBR的防控。