張 寧，劉 偉，吳銘潔，夏霖亞，王 蕾，殷玉和，石 晶，吳叢梅

（1.長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春 130000；2.長(zhǎng)春西諾生物科技有限公司，長(zhǎng)春 130000）

弓形蟲(chóng)是一種胞內(nèi)的原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)，感染幾乎所有溫血?jiǎng)游铮澜绱蠹s有30%的人口感染弓形蟲(chóng)[1-2]。在沒(méi)有弓形蟲(chóng)疫苗上市的情況下，弓形蟲(chóng)給人類和畜牧業(yè)造成了嚴(yán)重的威脅。因此，弓形蟲(chóng)抗體的檢測(cè)對(duì)于弓形蟲(chóng)病的早期診斷和治療具有重要意義。

目前，王釗哲等[3]利用大腸桿菌對(duì)弓形蟲(chóng)表面抗原SAG1-SAG2重組抗原進(jìn)行表達(dá)并純化，將此蛋白作為檢測(cè)抗原制備了膠體金試紙。朱傳剛等[4]利用大腸桿菌BL21將GRA1-GRA7蛋白進(jìn)行表達(dá)及純化，并將GRA1-GRA7蛋白為標(biāo)記抗原制備膠體金試紙檢測(cè)豬弓形蟲(chóng)抗體。研究表明，弓形蟲(chóng)多種蛋白均可刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，所以篩選出敏感高、特異性強(qiáng)的抗原是研制弓形蟲(chóng)檢測(cè)試劑的關(guān)鍵[5]。因此，本研究擬采用大腸桿菌表達(dá)GRA1-GRA7、SAG1和GRA6-GRA2三種蛋白，通過(guò)ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)比較，選擇具有較強(qiáng)敏感性的蛋白制備成膠體金免疫層析試紙，以期制備出敏感性高和特異性強(qiáng)的檢測(cè)貓弓形蟲(chóng)抗體的試紙，為弓形蟲(chóng)病的早期治療提供切實(shí)可行的檢測(cè)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 感受態(tài)細(xì)胞ER2566由吉林大學(xué)艾滋病疫苗國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室提供和保存；DNA marker購(gòu)自TaKaRa公司和北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和HindⅢ購(gòu)自TaKaRa公司；氯金酸購(gòu)自生工生物工程（上海）技術(shù)有限公司；硝酸纖維素膜（NC膜）購(gòu)自德國(guó)賽多利斯公司；HRP標(biāo)記羊抗貓IgG抗體、金黃色葡萄球菌A蛋白（SPA）、BSA購(gòu)自Sigma公司；弓形蟲(chóng)間接血凝試劑盒購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所。貓弓形蟲(chóng)陽(yáng)性血清由事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所提供。貓細(xì)小病毒陽(yáng)性血清、貓杯狀病毒陽(yáng)性血清和貓皰疹病毒陽(yáng)性血清由長(zhǎng)春西諾生物科技有限公司提供。

1.2 表達(dá)載體的鑒定 為了在大腸桿菌中表達(dá)和純化GRA1-GRA7、SAG1和GRA6-GRA2蛋白，利用GeneOptimizer軟件對(duì)弓形蟲(chóng)RH蟲(chóng)株的GRA1（GenBank登錄號(hào)：HM067753.1）、GRA7（GenBank登錄號(hào)：DQ459443.2）、SAG1（GenBank登錄號(hào)：X14080）、GRA6（GenBank登錄號(hào)：MH675993.1）和GRA2（GenBank登錄號(hào)：HM014012.1）基因序列進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，由南京金斯瑞生物有限公司合成后連入載體pET-28a中，重組質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和HindⅢ酶切鑒定以及測(cè)序分析確認(rèn)。

1.3 GRA1-GRA7、SAG1和GRA6-GRA2蛋白的表達(dá)和純化 將重組質(zhì)粒pET28a-GRA1-GRA7、pET28a-SAG1和pET28a-GRA6-GRA2分別轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞ER2566中，將重組質(zhì)粒菌液分別接種于5 mL含卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基中，37℃、220 rpm搖菌過(guò)夜。以1∶100比例接種于500 mL含卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基中，37℃條件下220 rpm至OD600值為0.7左右。加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）使其終濃度為1 mmol/L，繼續(xù)25℃、220 rpm培養(yǎng)16 h。10 000 ×g離心10 min，收集上清液和沉淀，采用His親和層析柱對(duì)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行純化，最后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析和Western blot鑒定。

1.4 ELISA檢測(cè)蛋白敏感性 每孔加入3 μg/mL的目的蛋白100 μL，4℃包被過(guò)夜；PBST洗板3次，5 min/次，加入5%BSA封閉2 h；洗板后將貓弓形蟲(chóng)陽(yáng)性血清作分別按1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1024、1∶2048進(jìn)行稀釋，每孔加樣100 μL，37℃孵育2 h；二抗選用HRP標(biāo)記羊抗貓IgG抗體，最后檢測(cè)三種蛋白敏感性，分別設(shè)置空白對(duì)照和陰性血清對(duì)照。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果選擇出具有較好敏感性的蛋白。

1.5 膠體金最適pH和最適蛋白標(biāo)記量的確定

1.5.1 最適pH的確定 用0.2 mol/L的K2CO3調(diào)節(jié)1 mL膠體金，分別加3、6、9、12 μL充分混勻，再向各管中加50 μL目的蛋白，混勻，靜置30 min。再加入10%NaCl，充分混勻，靜置2 h。觀察顏色變化。選擇開(kāi)始無(wú)聚集膠體金顏色為紅色的離心管，作為膠體金溶液最適K2CO3量，即最適pH值。

1.5.2 最適蛋白標(biāo)記量的確定 用PBS緩沖液將待標(biāo)記的1 mg/mL目的蛋白2倍稀釋至1∶256，每個(gè)稀釋度各取30 μL，并且加入調(diào)好pH的膠體金溶液125 μL，15 min后，每個(gè)稀釋度加入125 μL 100 mg/mL的NaCl溶液，靜置15 min，觀察膠體金的顏色變化。

1.6 目的蛋白的膠體金標(biāo)記 取調(diào)好pH值的膠體金溶液100 mL，快速攪拌下加入375 μL目的蛋白至膠體金溶液中，繼續(xù)攪拌1 h。加入濃度為100 mg/mL的牛血清白蛋白使終濃度為10 g/L，封閉2 h。以7500 ×g離心20 min，吸取上清液溶液，沉淀物為初步純化的金標(biāo)抗原結(jié)合物，將沉淀用重懸液溶解，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 膠體金試紙條的制備

1.7.1 組裝 將標(biāo)記好的金標(biāo)抗原結(jié)合物用噴金劃膜儀均勻的噴在300 mm×5 mm的玻璃纖維上，制成金標(biāo)墊，37℃鼓風(fēng)干燥2 h后，加入干燥劑于室溫密封保存，選用的NC膜用噴金劃膜儀將SPA作為檢測(cè)線（T線）、兔抗弓形蟲(chóng)目的蛋白IgG作為質(zhì)控線（C線），置于37℃ 2 h后，密封保存?zhèn)溆?；然后按照包被好的NC膜、膠體金標(biāo)記的玻璃纖維和吸水紙的順序，依次貼在PVC底板上。

1.7.2 檢測(cè)結(jié)果判定 首先將組裝好的試紙條平放于桌面上，吸取適量待測(cè)血清于加樣孔，室溫靜置10 min，判定結(jié)果。當(dāng)T線和C線出現(xiàn)紅色線時(shí)，結(jié)果判定為陽(yáng)性；當(dāng)T線未有紅色線，C線處出現(xiàn)紅色線，結(jié)果判定為陰性；當(dāng)C線不出現(xiàn)紅色線時(shí)，說(shuō)明此試紙條無(wú)效。

1.8 膠體金試紙條的評(píng)價(jià)

1.8.1 試紙條敏感性檢測(cè) 將陽(yáng)性血清進(jìn)行不同倍數(shù)稀釋，按照上述1.7.2檢測(cè)方法操作，每個(gè)稀釋度檢測(cè)3次，觀察試紙條檢測(cè)結(jié)果。

1.8.2 試紙條特異性檢測(cè) 用組裝好的試紙條檢測(cè)已知的貓細(xì)小病毒陽(yáng)性血清、貓杯狀病毒陽(yáng)性血清和貓皰疹病毒陽(yáng)性血清，并根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定。

1.9 臨床樣本檢測(cè) 用組裝好的膠體金試紙對(duì)長(zhǎng)春地區(qū)某寵物醫(yī)院的289份貓血清進(jìn)行檢測(cè)，并與間接血凝法（indirect heamagglutination assay,IHA）進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建 將優(yōu)化的GRA1-GRA7、SAG1和GRA6-GRA2基因序列連入載體pET-28a，用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和Hind Ⅲ分別對(duì)pET28a-GRA1-GRA7、pET28a-SAG1和pET28a-GRA6-GRA2進(jìn)行雙酶切。結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pET28a-GRA1-GRA7、pET28a-SAG1和pET28a-GRA6-GRA2構(gòu)建正確（圖1）。

圖1 重組質(zhì)粒pET28a-GRA1-GRA7（A）、pET28a-SAG1（B）和pET28a-GRA6-GRA2（C）雙酶切鑒定Fig.1 Identification of recombinant plasmids pET28a-GRA1-GRA7 (A),pET28a-SAG1 (B) and pET28a-GRA6-GRA2 (C)

2.2 GRA1-GRA7、SAG1和GRA6-GRA2蛋白的表達(dá)和純化 pET28a-GRA1-GRA7、pET28a-SAG1和pET28a-GRA6-GRA2經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后收集菌體，進(jìn)行SDS-PAGE，以pET-28a載體為對(duì)照，GRA1-GRA7蛋白在約50 kDa處可見(jiàn)特異性條帶（圖2），SAG1蛋白在約56 kDa處可見(jiàn)特異性條帶（圖3），GRA2-GRA6蛋白在約64 kDa處可見(jiàn)特異性條帶（圖4），分子質(zhì)量與目的蛋白一致，并且收獲到的蛋白純度高于85%。Western blot結(jié)果顯示目的蛋白能與鼠源弓形蟲(chóng)陽(yáng)性血清產(chǎn)生特異性反應(yīng)（圖2B、圖3B、圖4B），證明表達(dá)產(chǎn)物有較好的抗原特異性。

圖2 GRA1-GRA7蛋白SDS-PAGE和Western blot鑒定Fig.2 SDS-PAGE and Western blot analysis of GRA1-GRA7 protein

圖3 SAG1蛋白SDS-PAGE和Western blot鑒定Fig.3 SDS-PAGE and Western blot analysis of SAG1 protein

2.3 ELISA檢測(cè)蛋白敏感性結(jié)果 分別利用GRA1-GRA7、SAG1和GRA6-GRA2蛋白進(jìn)行包被，倍比稀釋貓弓形蟲(chóng)陽(yáng)性血清作為一抗進(jìn)行孵育，ELISA檢測(cè)三種蛋白的敏感性，結(jié)果可知，GRA6-GRA2蛋白具有較好的抗原反應(yīng)性（表1）。

表1 ELISA檢測(cè)蛋白敏感性結(jié)果Table1 The result of protein sensitivity of ELISA test

表2 臨床樣本膠體金免疫層析檢測(cè)試紙檢測(cè)結(jié)果Table 2 The results of colloidal gold immunochromatographic test strip in clinical samples

2.4 膠體金最適pH和最適蛋白標(biāo)記量的確定 用0.2 mol/L K2CO3調(diào)節(jié)膠體金的pH值，1 mL膠體金當(dāng)加入12 μL的0.2 mol/L K2CO3時(shí)，膠體金溶液的顏色由藍(lán)色變紅色，結(jié)果可知，最終結(jié)果表明1 mL膠體金加入12 μL 0.2 mol/L K2CO3為最適pH值（圖5）。調(diào)節(jié)膠體金pH值后，加入GRA6-GRA2蛋白，用蛋白濃度梯度的方法，結(jié)果可知，在第6到第7個(gè)孔處溶液有紅變藍(lán)，最終表明第6孔處為最適標(biāo)記蛋白標(biāo)記量，蛋白標(biāo)記量為3.75 μg/mL（圖6）。

圖5 膠體金標(biāo)記GRA6-GRA2蛋白最適pH值確定Fig.5 Determination of the optimal pH value of GRA6-GRA2 protein labeled with colloidal gold

圖6 最適標(biāo)記蛋白標(biāo)記量的測(cè)定Fig.6 Determination of optimal labeling protein labeling amount

2.5 敏感性檢測(cè) 將貓弓形蟲(chóng)陽(yáng)性血清倍比稀釋，如圖7所示，檢測(cè)弓形蟲(chóng)陽(yáng)性血清稀釋至1∶256時(shí)，試紙條的檢測(cè)結(jié)果判定為陽(yáng)性，弓形蟲(chóng)陽(yáng)性血清稀釋至1∶1024時(shí)，檢測(cè)結(jié)果為陰性。本試紙條可檢測(cè)稀釋至1∶256的弓形蟲(chóng)陽(yáng)性血清。

圖7 弓形蟲(chóng)抗體膠體金免疫層析試紙條敏感性的檢測(cè)結(jié)果Fig.7 The detection result of sensitivity test of Toxoplasma antibody colloidal gold immunochromatographic test strip

2.6 特異性檢測(cè) 用弓形蟲(chóng)抗體膠體金免疫層析試紙條對(duì)已知的貓弓形蟲(chóng)陽(yáng)性血清、貓細(xì)小病毒陽(yáng)性血清、貓杯狀病毒陽(yáng)性血清和貓皰疹病毒陽(yáng)性血清進(jìn)行特異性檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖8，試紙條檢測(cè)貓細(xì)小病毒陽(yáng)性血清、貓杯狀病毒陽(yáng)性血清和貓皰疹病毒陽(yáng)性血清時(shí)，只有質(zhì)控線出現(xiàn)一條紅的線，檢測(cè)線不出現(xiàn)紅色條帶，為陰性結(jié)果，說(shuō)明試紙?zhí)禺愋粤己谩?/p>

圖8 弓形蟲(chóng)抗體膠體金免疫層析試紙條特異性的檢測(cè)結(jié)果Fig.8 The detection result of specificity test of Toxoplasma antibody colloidal gold immunochromatographic test strip

2.7 臨床樣本檢測(cè)結(jié)果 對(duì)長(zhǎng)春6家寵物醫(yī)院共289份貓待檢血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，采用膠體金試紙條檢出7份陽(yáng)性血清，陽(yáng)性率為2.42%；IHA檢出6份陽(yáng)性血清，陽(yáng)性率為2.07%，二者檢測(cè)的符合率為99.5%，這可能與貓?zhí)幱诠蜗x(chóng)感染早期抗體水平低有關(guān)，由于檢測(cè)樣本為臨床樣本，很難追蹤貓個(gè)體情況，因此未對(duì)此差異樣本進(jìn)行進(jìn)一步的分析檢測(cè)。

3 討論

研究表明可作為診斷抗原的有SAG1、SAG2、SAG3、GRA1、GRA7、GRA6和GRA2蛋白等。SAG1為弓形蟲(chóng)的表面蛋白，是誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答的主要靶抗原，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IgG、IgM、IgA、IgE等多種抗體，也是目前國(guó)內(nèi)外研究較多的具有強(qiáng)免疫原性的診斷分子[6]。GRA1、GRA7、GRA2和GRA6蛋白都屬于致密顆粒蛋白（dense granule，GRAs），它們參與弓形蟲(chóng)在宿主細(xì)胞內(nèi)的納蟲(chóng)空泡(PV)和PV膜的修飾以維持細(xì)胞內(nèi)寄生，保護(hù)納蟲(chóng)泡內(nèi)蟲(chóng)體的存活[7]。本研究選擇SAG1、GRA1-GRA7和GRA6-GRA2蛋白進(jìn)行篩選，結(jié)果表明GRA6-GRA2蛋白的敏感性高于SAG1、GRA1-GRA7蛋白的敏感性，最高可檢測(cè)稀釋至1∶1024的貓弓形蟲(chóng)陽(yáng)性血清，因此，GRA6-GRA2蛋白檢測(cè)弓形蟲(chóng)抗體具有良好的抗原反應(yīng)性。

GRA2蛋白在弓形蟲(chóng)的緩殖子時(shí)期和速殖子時(shí)期均存在，是潛在的抗原標(biāo)記物，可誘發(fā)較強(qiáng)的抗體反應(yīng)[8]。GRA2是由185個(gè)氨基酸組成的多肽，其中185個(gè)氨基酸中包含3個(gè)α螺旋的兩性區(qū)域，其中一個(gè)α螺旋區(qū)域可以結(jié)合該蛋白的C端和N端，從而誘導(dǎo)納蟲(chóng)泡的形成[9]。目前研究表明GRA2在感染弓形蟲(chóng)急慢性期中是普遍存在的，它至少有3個(gè)B細(xì)胞表位和1個(gè)T細(xì)胞表位，可以誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生一系列的抗體，激活CD4+T細(xì)胞，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)[10]。Ching等[11]用重組蛋白GRA2蛋白采用Western blot方法對(duì)弓形蟲(chóng)陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明GRA2蛋白抗原能區(qū)分近期感染和既往感染。GRA6蛋白具有比較強(qiáng)的抗原活性，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，在緩殖子和速殖子期均可表達(dá)，它不含內(nèi)含子，是單拷貝基因，有一個(gè)開(kāi)放閱讀框大小為735 bp，可以編碼230個(gè)氨基酸。Lecordier等[12]將GRA6開(kāi)放閱讀框序列基因全部導(dǎo)入pGEX表達(dá)載體中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有編碼N端的重組抗原能被感染弓形蟲(chóng)的人血清所識(shí)別，表明GRA6 N端多肽含有抗原表位能被B淋巴細(xì)胞識(shí)別，用GRA6 N端的親水蛋白多肽構(gòu)建的重組抗原可以檢測(cè)弓形蟲(chóng)感染者血清IgG（ELISA）并且敏感性可達(dá)96%。而GRA2同GRA6可以形成一個(gè)多聚復(fù)合體，它是構(gòu)成納蟲(chóng)泡網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成的關(guān)鍵因子[13]。Amina等[14]研究結(jié)果表明GRA6可能通過(guò)穩(wěn)定GRA2誘導(dǎo)膜小管對(duì)納蟲(chóng)泡管網(wǎng)絡(luò)的形成起重要作用。因此，本研究獨(dú)特的選用了GRA6-GRA2進(jìn)行重組，對(duì)于貓弓形蟲(chóng)陽(yáng)性血清表現(xiàn)出較高的敏感性，可以作為弓形蟲(chóng)抗體檢測(cè)的特異性抗原，為弓形蟲(chóng)抗體檢測(cè)技術(shù)的開(kāi)發(fā)提供了保障。

弓形蟲(chóng)病是一種常見(jiàn)的人畜共患病。目前，對(duì)該病的診斷和檢測(cè)方法主要有IHA法，但此方法的敏感性較低，易出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象。而ELISA、PCR技術(shù)等雖然敏感性較高、特異性較強(qiáng)，但操作較復(fù)雜，不適合大規(guī)模篩查檢測(cè)，存在普遍的局限性。為了提高弓形蟲(chóng)檢測(cè)的敏感性，縮減檢測(cè)的時(shí)間，并減輕檢測(cè)人員的工作負(fù)擔(dān)，本研究利用GRA6-GRA2重組蛋白作為膠體金試紙的診斷抗原進(jìn)行貓弓形蟲(chóng)抗體檢測(cè)。此試紙可以檢測(cè)到陽(yáng)性血清稀釋至1∶256的結(jié)果，同時(shí)還具有良好的特異性，適用于弓形蟲(chóng)病的早期診斷。

經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查顯示，2016年，張啟龍等[15]對(duì)北京地區(qū)835份貓血清進(jìn)行檢測(cè)，檢出弓形蟲(chóng)陽(yáng)性率為1.92%；2017年，夏春芳等[16]針對(duì)伊寧市40份貓血清進(jìn)行檢測(cè)，檢出弓形蟲(chóng)陽(yáng)性率為33.3%；2018年，禹海杰等[17]對(duì)嘉興市256份貓血清進(jìn)行檢測(cè)，檢出弓形蟲(chóng)陽(yáng)性率為11.3%；2019年，韓云珍等[18]對(duì)福州城區(qū)221份貓血清進(jìn)行檢測(cè)，檢出弓形蟲(chóng)陽(yáng)性率為2.71%，說(shuō)明不同地區(qū)的貓都存在著一定的弓形蟲(chóng)流行率。本研究針對(duì)2020年長(zhǎng)春6家寵物醫(yī)院共289份貓血清進(jìn)行膠體金檢測(cè)，并與IHA進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果膠體金試紙條陽(yáng)性檢出率為2.42%，IHA陽(yáng)性檢出率為2.07%，二種方法的符合率為99.5%，這一結(jié)果與王艷華等[19]的比較膠體金試紙與IHA兩種方法的結(jié)果相符合，同時(shí)說(shuō)明長(zhǎng)春地區(qū)的貓存在著一定的弓形蟲(chóng)流行率，威脅著人與動(dòng)物的生命健康，因此對(duì)弓形蟲(chóng)病的診斷試劑盒的開(kāi)發(fā)和研究有著重要意義。

本研究結(jié)果表明，利用GRA6-GRA2重組蛋白制備的膠體金試紙，具有良好的敏感性和特異性，可以應(yīng)用于弓形蟲(chóng)病的早期診斷。