李 婧，葛春艷，李佳暖

（1.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，濰坊 261061；2.威海市文登區(qū)畜牧獸醫(yī)技術(shù)服務(wù)中心，威海 264400）

禽腺病毒（Fowl adenovirus,FAdV）屬于腺病毒科禽腺病毒屬，是雞、鴨、鵝等禽類體內(nèi)的常見病毒。根據(jù)群特異性抗原的不同可將FAV分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3個(gè)群，Ⅰ群禽腺病毒主要引起雞的心包積液綜合征和包涵體肝炎；Ⅱ群禽腺病毒主要引起火雞出血性腸炎和雞脾臟腫大；Ⅲ群禽腺病毒主要引起雞的產(chǎn)蛋下降綜合征。其中Ⅰ群又可分為A、B、C、D、E 5個(gè)種和12個(gè)血清型[1]。我國(guó)流行的血清型主要為FAV-11、FAV-4、FAV-8a、FAV-8b[2]。

心包積液綜合征（hydropericardium hepatitis syndrome,HHS）主要是由FAV-4引起的一種原發(fā)性傳染病，其典型特征為3～5周齡肉雞突然死亡，并伴有心包積液和肝炎，死亡率可達(dá)20%～60%[3-4]。該病于1987年在巴基斯坦的安卡拉地區(qū)首次發(fā)生（安卡拉?。?，隨后在多個(gè)國(guó)家呈暴發(fā)性流行。我國(guó)自2013年起出現(xiàn)該病的報(bào)道，2015年6月份以來(lái)，該病在我國(guó)大面積流行，主要集中在山東、河南、河北、遼寧、安徽、吉林等地區(qū)[5]。除肉雞外，也可見于雜交雞、麻雞、種雞和蛋雞，肉鴨也有發(fā)生。本病既可垂直傳播，又可水平傳播，雞感染后可終身帶毒，并間歇性排毒，該病是當(dāng)前國(guó)內(nèi)雞養(yǎng)殖戶最為關(guān)注的疫病之一。

2018年9月山東某雞場(chǎng)32日齡肉雞發(fā)病，臨床初步診斷為心包積液綜合征，本研究從臨床發(fā)病雞的肝臟、脾臟等病料組織中分離到1株病毒，并對(duì)分離株進(jìn)行鑒定、分析，最后確診此次病原為血清4型禽腺病毒，為控制病情還試驗(yàn)了肝組織滅活苗的預(yù)防與控制效果，本研究為該病的防控提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料采集、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試驗(yàn)材料 病料取自山東某雞場(chǎng)送檢的疑似禽腺病毒感染的白羽肉雞。SPF雞胚與SPF雞均購(gòu)自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院濟(jì)南家禽研究所。病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒、PCR通用rTaq試劑盒、凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、DL2000 DNA Marker等購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；克隆用宿主菌E.coliDH5α和載體pMD18-T購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 病料PCR檢測(cè) 根據(jù)GenBank已發(fā)表的FAV基因序列（EU177544），針對(duì)其Hexon基因設(shè)計(jì)并合成1對(duì)特異性引物（F：5'-CTTCCCCAAT CCCAACCAG-3'，R：5'-TAGTGATGMCGSGA CATCAT-3'），以病雞肝臟、脾臟等組織樣品所提取DNA為模板，進(jìn)行PCR檢測(cè)，預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度500 bp。

1.3 病毒的分離與傳代 取病變明顯的肝組織約2.0 g，置于無(wú)菌研磨器中，研磨過(guò)程中加入5 mL PBS，反復(fù)凍融3次，4℃、3000 ×g離心15 min，上清液用0.22 μm的細(xì)菌濾器過(guò)濾，經(jīng)卵黃囊接種于9日齡SPF雞胚，0.2 mL/胚，37℃孵育，棄掉24 h以內(nèi)死亡的雞胚，無(wú)菌收集72 ～120 h死亡的雞胚尿囊液及120 h未死亡雞胚尿囊液，按照上述方法盲傳3代，-80℃保存?zhèn)溆?，觀察雞胚病理變化。按常規(guī)方法對(duì)第3代雞胚尿囊液分離病毒進(jìn)行雞紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)，按常規(guī)方法進(jìn)行雞胚半數(shù)致死量（50% egg lethal dose,ELD50）測(cè)定。

1.4 分離株序列鑒定和遺傳進(jìn)化分析 利用PCR或RTPCR方法進(jìn)行IBDV、CIAV、REV的檢測(cè)[7-8]，排除混合感染情況。按1.2方法對(duì)分離株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收擴(kuò)增產(chǎn)物，送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。將測(cè)得的Hexon基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，并利用MEGA6.0生物學(xué)軟件進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。

1.5 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 將10只7日齡SPF雛雞平均分為兩組，實(shí)驗(yàn)組肌肉注射分離毒株第三代雞胚尿囊液0.2 mL/只（104.5ELD50/0.2 mL），對(duì)照組注射等量的滅菌生理鹽水，每日觀察并記錄各組雞的臨床表現(xiàn)以及發(fā)病死亡情況，解剖死亡雞，觀察病理變化。

1.6 免疫保護(hù)試驗(yàn)

1.6.1 組織滅活苗制備 無(wú)菌采集病死雞肝臟，按1∶5比例加入滅菌生理鹽水，高速勻漿后過(guò)濾，濾液中加入終濃度3 mL/L的甲醛溶液，37℃、24 h震蕩滅活，無(wú)菌檢驗(yàn)合格后，接種10只7日齡雞，2 mL/只，觀察5 d后接種雞均健活為合格。加入等量生理鹽水混勻后分裝備用。

1.6.2 抗體效價(jià)檢測(cè)與疫苗免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn) 將40只7日齡SPF雛雞平均分成2組，實(shí)驗(yàn)組腿部肌肉注射組織滅活疫苗0.2 mL/只，對(duì)照組注射滅菌生理鹽水0.2 mL/只，在免疫后第4、7、14、21 d各取5只實(shí)驗(yàn)雞、對(duì)照雞翅靜脈采血0.5 mL，分離血清，以10倍濃縮的分離株滅活抗原為檢測(cè)抗原，通過(guò)瓊擴(kuò)試驗(yàn)檢測(cè)抗體；采血后實(shí)驗(yàn)組肌肉注射分離病毒0.2 mL/只（104.5ELD50/0.2 mL），對(duì)照組注射等量滅菌生理鹽水，觀察并記錄死亡情況。

1.6.3 緊急接種保護(hù)試驗(yàn) 自采集病料的發(fā)病雞群（25日齡，發(fā)病5 d）隨機(jī)抽取200只尚未發(fā)病雞，平均分為2組，分別隔離飼養(yǎng)3 d，兩組各有部分雞只表現(xiàn)精神沉郁、食欲減退等癥狀，其中實(shí)驗(yàn)組通過(guò)胸部肌肉注射緊急接種組織滅活疫苗1 mL/只，對(duì)照組接種等量生理鹽水，兩組同時(shí)給予電解多維及維生素C等抗應(yīng)激藥物，觀察并記錄死亡情況。

2 結(jié)果

2.1 病料PCR檢測(cè)結(jié)果 對(duì)病變組織進(jìn)行血清4型FAdVHexon基因PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示在肝臟、脾臟組織中均擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符的特異性條帶（圖1）。

圖1 FAV-4目的基因PCR擴(kuò)增Fig.1 The PCR product of FAV-4 target gene

2.2 病毒分離傳代結(jié)果 接種雞胚均在接種后72～120 h內(nèi)死亡，死亡雞胚表現(xiàn)發(fā)育受阻，全身充血、出血，肝臟腫大、質(zhì)地變脆。常規(guī)方法檢測(cè)尿囊液不能凝集雞、鴨紅細(xì)胞。按Reed-Muench法計(jì)算,該分離毒株對(duì)雞胚的ELD50為10-4.5/0.2 mL。

2.3Hexon基因同源性分析 將測(cè)序得到的Hexon基因序列與GenBank上登錄的12個(gè)血清型進(jìn)行同源性比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離毒株與FAdV-4參考毒株同源性為99%，與近年來(lái)國(guó)內(nèi)流行的FAV-4毒株親緣關(guān)系較近，處于一個(gè)分支上，與FAdV 1～3、5～11血清型參考毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖2）。以上試驗(yàn)結(jié)果表明該分離株為FAdV-4血清型，將其命名為FAdV-4血清型LH株。

圖2 分離毒株（LH）與參考株的Hexon基因遺傳進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic tree based on the Hexon gene of the isolated virus (LH) and the reference strain

圖3 兩組死亡情況對(duì)照Fig.3 Comparison of mortality between the two groups

2.4 動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果 人工接種雛雞后，第2 d開始出現(xiàn)死亡，剖檢可見有心包積液，肝臟出血腫大，腎臟腫大出血，與臨床感染雞癥狀病變相似，并可再次分離到該病毒。對(duì)照組無(wú)明顯變化。表明雞胚接種獲得的分離株（LH株）即為引起臨床發(fā)病的病原。

2.5 抗體效價(jià)檢測(cè)與疫苗免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果 抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果顯示，免疫后14 d才可檢測(cè)到瓊擴(kuò)抗體，至21 d抗體陽(yáng)性率達(dá)100%。但攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，免疫后4 d即可產(chǎn)生一定保護(hù)（25%），隨后保護(hù)率逐漸上升，免疫后14 d可產(chǎn)生較強(qiáng)保護(hù)（80%），免疫后21 d攻毒，免疫組雞只無(wú)發(fā)病、死亡，表現(xiàn)100%保護(hù)，表明組織滅活疫苗對(duì)于預(yù)防本病具有較好的效果，在免疫后14 d即可產(chǎn)生足夠保護(hù)（80%），21 d可產(chǎn)生完全保護(hù)；而且還可產(chǎn)生早期保護(hù)，在抗體能檢測(cè)到甚至產(chǎn)生之前，疫苗即可提供一定保護(hù)作用（表1）。以上結(jié)果提示在FAdV-4感染發(fā)病初期可通過(guò)組織滅活疫苗緊急控制本病。

表1 免疫后抗體陽(yáng)性率與攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The positive rate of antibody and the results of protective test

2.6 緊急接種保護(hù)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組緊急免疫后統(tǒng)計(jì)死亡數(shù)顯示，免疫當(dāng)天死亡數(shù)高于對(duì)照組，此后一直低于對(duì)照組，且3 d后呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)，6 d左右病情得到完全控制；對(duì)照組死亡數(shù)量持續(xù)上升（圖4）。分析該結(jié)果表明，在發(fā)病初期（有癥狀，但暫無(wú)死亡）緊急接種組織滅活疫苗，免疫初期由于應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致發(fā)病數(shù)與死亡數(shù)有一定上升后免疫效果持續(xù)增強(qiáng)，6 d左右可完全控制本病。

3 討論

自2015年6月份以來(lái)，由腺病毒引起的心包積液綜合征在我國(guó)多個(gè)省份大面積暴發(fā)并呈區(qū)域性流行，給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。FAdV-4是雞HHS的主要病原[4-6]，但也有報(bào)道稱禽腺病毒的1、2、4和8型均能引起心包積液綜合征，且近年來(lái)山東等地的優(yōu)勢(shì)血清型以8b為主[9]。本研究中分離株LH為FAdV-Ⅰ群C種、血清4型，且同源性與近年來(lái)國(guó)內(nèi)報(bào)道的毒株極為相似，表明LH株仍為國(guó)內(nèi)普通流行株。

HHS多在發(fā)病3～5 d達(dá)到死亡高峰，并持續(xù)7～10 d，可造成較大損失，目前本病防治困難，國(guó)內(nèi)尚無(wú)商品化疫苗用于預(yù)防[10-11,15]；因病雞肝臟受損，肝功能紊亂，常規(guī)的藥物治療效果不佳[13]；據(jù)報(bào)道，卵黃抗體治療具有較好的療效[12-13]，但該病周期長(zhǎng)，有時(shí)能持續(xù)1個(gè)月以上，卵黃抗體作用多為7～10 d，不能完全控制該病[9]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)組織滅活疫苗對(duì)于預(yù)防與控制該病均具有良好的效果，免疫后4 d即可產(chǎn)生保護(hù)，21 d即可產(chǎn)生完全保護(hù)，可用于該病的預(yù)防接種；對(duì)發(fā)病雞群進(jìn)行緊急接種，可在6 d左右完全控制該病。