文麗芳 丁潔

1山西醫(yī)科大學汾陽學院（山西汾陽 032200）；2山西省汾陽醫(yī)院（山西汾陽 032200）

宮頸癌是婦科常見惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在女性腫瘤中均位列前茅，手術和放化療是目前采取的主要治療方法。雖然宮頸/陰道脫落細胞學和人乳頭瘤病毒檢查的普及大大提升早期診斷和治療率，患者預后得到一定改善［1］，但術后復發(fā)仍舊是嚴重困擾醫(yī)患的難題，死亡率也并未明顯降低，加上近年來年輕化的發(fā)病趨勢，宮頸癌防治形勢依然十分嚴峻［2］。繼續(xù)研究發(fā)現生物標記物對于降低復發(fā)率、有效控制病情發(fā)展意義重大。神經軸突導向因子SLITs 是一個分泌蛋白家族，成員包括SLIT1-3，通過Robo 受體結合發(fā)出信號，在腫瘤細胞轉移等多種生理過程中發(fā)揮作用［3］。有研究發(fā)現，SPARCL1 是9 個與宮頸癌發(fā)生有關的基因之一，在宮頸癌的發(fā)展中發(fā)揮核心作用，也與癌前病變和腫瘤細胞遷移過程有關［4］。目前關于SLIT3、SPARCL1 與宮頸癌的研究較少，本研究通過對107 例宮頸癌患者癌細胞SLIT3、SPARCL1 蛋白表達進行觀察和研究，探討其表達水平與根治術后復發(fā)的相關性。報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2019年10月至2021年4月在醫(yī)院接受宮頸癌根治術治療的107 例患者作為研究對象，另選取子宮肌瘤等子宮良性病變行手術切除的30 例患者正常宮頸組織作為對照組。納入標準：（1）首次接受根治術治療，經病理組織學確診為宮頸癌；（2）年齡超過18歲；（3）臨床資料完整；（4）術前未采用化療、放療等其他抗腫瘤治療，術后采用相同的抗腫瘤方案；（5）FIGO 2018 分期Ⅰ-Ⅱa 期。排除標準：（1）合并心、肝、腎、肺等其他重要臟器功能不全；（2）合并其他惡性腫瘤；（3）合并免疫系統(tǒng)疾?。唬?）術后未經病理組織學確診。107例患者年齡25～78歲，平均（52.65±11.57）歲；臨床分期：Ⅰa 期23 例，Ⅰb 期39 例，Ⅱa 期45 例；病理分級：低分化27 例，中分化43 例，高分化37 例；病理類型：鱗癌78 例，腺癌29 例；淋巴結轉移25 例，未轉移82 例；腫瘤最大徑未超過4 cm 共72 例，超過4 cm 共35 例；基質浸潤深度：> 50%共84 例，≤ 50%共23 例。本次研究獲得醫(yī)院倫理委員會會議表決通過后實施。

1.2 治療方法和標本采集所有患者均符合手術指征，根據患者腫瘤大小、臨床分期、病理分級等采取標準及個體化的手術及術后輔助治療［5］。術中采集患者宮頸癌組織液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實驗方法（1）提取組織總RNA：標本組織剪碎加入Trizol 試劑（福州飛凈生物科技有限公司，貨號：PH1420）600 μL 和400 μL 充分研磨組織；1.5 mL EP 管收集研磨液，5427R 超低溫離心機（德國艾本德公司）4 ℃、12 000 r/min 離心15 min；離心后取上清液轉移至新EP 管中，按1：1 體積加入異丙醇，充分混勻后靜置10 min 再次離心分離；去上清后加入75%酒精1 mL，充分混勻后離心；再次去上清，冰上晾干殘留酒精，加入適量DEPC水，吹打混勻后溶解提取RNA；使用UV5Nano 超微量分光光度計（梅特勒-托利多國際有限公司）測定樣本RNA 濃度，A260/280 在1.8～2.0 區(qū)間內為合格，-20 ℃冰箱保存待用。（2）根據試劑盒說明書準備逆轉錄反應體系，將FastKing RT Enzyme Mix 加到cDNA 去除步驟反應中，充分混勻后42 ℃孵育15 min；95 ℃孵育3 min 后合成的cDNA 反應液-20 ℃保存待下游熒光定量檢測。（3）實時熒光定量檢測（PCR）：采用FastKing 一步法RT-PCR試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司，目錄號：KR123］，配制擴增反應體系；待測溶液離心后于7500 Fast 實時熒光定量PCR 系統(tǒng)（美國賽默飛公司）中檢測，參數設置：95 ℃預變性15 min，95 ℃10 s 退火，60 ℃ 32 s 延伸，40 cycles。反應結束后收集數據，計算相對表達水平。SLIT3 引物序列：上游：ATCAACTGCCTGCGGGTAAA；下游：CAAGTGGCAGTCGCAAACAA；SPARCL1 引物序列：上游：TTGGCTCCTGGTGTTAGTTC，下游：ATCCTGCTCTTGG-TTTCCTT。（4）免疫組化檢測：標本組織固定于載玻片上，經烘烤、二甲苯浸泡、風干后置于濃度遞減的乙醇中靜置，每個濃度5 min；高溫抗原修復后將切片洗滌3 次；分別加入一抗兔抗人重組抗體（SLIT3 和SPARCL1，美國Abcam 公司，貨號：ab198726、ab255597），4 ℃冰箱孵育過夜；次日組織表面滴加即用型山羊抗兔二抗；加入預先調制好的DAB 顯色液進行顯色。蘇木素染色，按組織按照濃度由低到高排列，分別在不同濃度乙醇、二甲苯、甲苯中靜置5 min，樹膠封片。根據著色程度和面積進行評分，著色按照強、中、弱、無分別計3 分、2 分、1 分和0 分；視野面積超過75%計4 分，超過50%計3 分，超過25%計2 分，未超過25%計1 分。將二種評分方法得出的分數相乘作為最終分數（0～12 分）。5～12 分為高表達，1～4 分為低表達，0 分為不表達。高表達為高表達組，低表達或不表達為低表達組。

1.4 隨訪以術后第1天作為隨訪起點，術后12個月期滿或患者復發(fā)作為隨訪終點；每3 個月通過電話、門診、住院等多種方式結合的方法進行1 次隨訪；所有患者未失訪。

1.5 統(tǒng)計學方法采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件進行數據分析。計量資料經檢驗符合正態(tài)分布采用“±s”表示，獨立樣本間差異采用t檢驗，多組間比較采用方差分析；不符合正態(tài)分布采用非參數檢驗。采用COX 回歸模型分析術后復發(fā)因素。P< 0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 隨訪結果所有患者均隨訪1 年，其中25 例患者復發(fā)，82 例患者未復發(fā)。

2.2 SLIT3、SPARCL1 mRNA 在宮頸癌、正常宮頸組織中表達宮頸癌組SLIT3、SPARCL1 mRNA表達顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

表1 SLIT3、SPARCL1 mRNA 在宮頸癌、正常宮頸組織中表達Tab.1 Expression of SLIT3 and SPARCL1 mRNA in cervical cancer and normal cervical tissues ±s

組別宮頸癌組對照組t值P值例數107 30 SLIT3 mRMA 0.24±0.18 1.27±0.05 30.934 0.000 SPARCL1 mRNA 0.15±0.18 1.35±0.21 31.087 0.000

圖1 免疫組化檢測SLIT3、SPARCL1 在宮頸癌及正常宮頸組織中的表達Fig.1 Immunohistochemical detection of the expression of SLIT3 and SPARCL1 in cervical cancer and normal cervical tissue

2.3 SLIT3、SPARCL1 mRNA 在復發(fā)、未復發(fā)患者宮頸癌組織中表達復發(fā)組患者宮頸癌組織SLIT3、SPARCL1 mRNA 水平顯著低于未復發(fā)患者，差異有統(tǒng)計學意義（P< 0.05）。見表2。

表2 SLIT3、SPARCL1 mRNA 在復發(fā)、未復發(fā)患者宮頸癌組織中表達Tab.2 Expression of SLIT3 and SPARCL1 mRNA in cervical cancer tissues of recurrent and non-recurrent patients ±s

表2 SLIT3、SPARCL1 mRNA 在復發(fā)、未復發(fā)患者宮頸癌組織中表達Tab.2 Expression of SLIT3 and SPARCL1 mRNA in cervical cancer tissues of recurrent and non-recurrent patients ±s

組別復發(fā)組未復發(fā)組t值P值例數25 82 SLIT3 mRMA 0.12±0.11 0.28±0.15 5.946 0.000 SPARCL1 mRNA 0.09±0.08 0.17±0.15 2.552 0.012

2.4 宮頸癌組織 SLIT3、SPARCL1 蛋白表達與術后復發(fā)107 例根治術患者中25 例患者術后復發(fā)，復發(fā)率為23.36%；根據SLIT3、SPARCL1 免疫組化檢測結果分為SLIT3 低表達組（61 例）、SLIT3高表達組（46 例）、SPARCL1 低表達組（65 例）、SPARCL1 高表達組（42 例）。SLIT3 低表達患者術后復發(fā)率（31.15%）顯著高于SLIT3 高表達患者術后復發(fā)率（13.04%），SPARCL1 低表達患者術后復發(fā)率（32.31%）顯著高于SPARCL1 高表達患者術后復發(fā)率（9.52%），差異有統(tǒng)計學意義（P< 0.05）。見表3。

表3 宮頸癌組織 SLIT3、SPARCL1 蛋白表達與術后復發(fā)Tab.3 Expression of SLIT3 and SPARCL1 proteins in cervical cancer tissue and postoperative recurrence

2.5 宮頸癌組織 SLIT3、SPARCL1 蛋白表達與臨床病理特征相關性宮頸癌組織SLIT3、SPARCL1蛋白表達與分化程度、臨床分期、淋巴結轉移、基質浸潤深度相關，與年齡、病理類型、腫瘤最大徑無關。見表4。

表4 宮頸癌組織 SLIT3、SPARCL1 表達與臨床病理特征相關性Tab.4 Correlation between the expression of SLIT3，SPARCL1 and clinicopathological characteristics in cervical cancer 例

2.6 影響宮頸癌患者根治術后復發(fā)的危險因素將SLIT3 蛋白高表達、SPARCL1 蛋白高表達、間質浸潤深度≤ 50%、無淋巴結轉移、低分化程度、Ⅰa/Ⅰb 分期賦值為0，SLIT3 低表達、SPARCL1 低表達、基質浸潤深度> 50%、淋巴結轉移、中/高分化程度、Ⅱa 分期賦值為1。COX 單因素分析顯示，分化程度、臨床分期、淋巴結轉移、基質浸潤深度、SLIT3 表達、SPARCL1 表達與宮頸癌患者根治術后復發(fā)相關（P< 0.05），見表5；COX 多因素分析顯示，中/高分化、Ⅱa 分期、淋巴結轉移、基質浸潤深度 > 50%、SLIT3 低表達、SPARCL1 低表達是影響宮頸癌患者根治術后復發(fā)的獨立危險因素（P<0.05），見表6。

表5 COX 單因素分析Tab.5 COX single factor analysis

表6 COX 多因素分析Tab.6 COX Multi-factor Analysis

3 討論

作為早期宮頸癌的主要治療方法，宮頸癌根治術有效提高了患者總生存率［6-7］，但是術后復發(fā)率尤其是局部復發(fā)居高不下，術后復發(fā)和轉移仍舊是臨床面臨的重要難題。術后輔助放療、化療及同步放化療是宮頸癌患者生存獲益的主要方式。通過更多的特異性指標預測患者術后復發(fā)對于患者預后意義重大。

神經導向因子是一種在神經系統(tǒng)發(fā)育過程中調控神經元的發(fā)生與遷移、對神經元軸突傳達吸引或排斥信號的生物分子，包括SLITS、Ephrins、Semaphorins 等諸多分子家族［8-10］。許多神經導向因子和炎癥、腫瘤發(fā)展等病理過程密切相關。相關研究發(fā)現，SLIT/Robo 信號通路可調控腫瘤細胞的增殖、侵襲、侵襲、粘附等，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉移中發(fā)揮巨大作用［11］。有研究指出，SLIT3 在多種腫瘤組織中的表達顯著低于正常組織，且SLIT3低或過表達會影響腫瘤增殖、侵襲等行為［12］。NARAYAN 等［13］研究顯示，SLIT3/Robo 信號通路相關蛋白在宮頸癌組織中低表達或不表達，可能是由于DNA 甲基化調控導致的。

SPARCL1 是細胞基質蛋白（SPARC）中富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白家族成員。SPARCL1 蛋白是具有抗粘附、抗增殖和抗致癌效果的細胞基質蛋白，調控細胞間粘附、遷移和侵襲，可通過調節(jié)腫瘤生長和分化參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展［14］。近年來相關研究顯示，SPARCL1 在多種惡性腫瘤組織中的表達下調甚至缺失，這也加快了腫瘤的侵襲和轉移［15］。相關研究發(fā)現SPARCL1 與宮頸癌發(fā)病過程中的癌前病變和遷移過程有關，可能是一種新的癌癥預測標志物，也是宮頸癌發(fā)生和發(fā)展的潛在治療靶點［16］。

本研究中，宮頸癌組織SLIT3、SPARCL1 mRNA表達明顯低于正常宮頸組織，且與術后未復發(fā)患者比較，術后復發(fā)患者宮頸癌組織SLIT3、SPARCL1 mRNA 表達明顯偏低，同時宮頸癌組織SLIT3、SPARCL1 蛋白表達與分化程度、臨床分期、淋巴結轉移、基質浸潤深度相關，提示宮頸癌組織SLIT3、SPARCL1在宮頸癌病情發(fā)展和預后中有重要參與。對SLIT3、SPARCL1 蛋白表達分組患者研究顯示，低表達患者術后復發(fā)率明顯高于高表達患者，提示SLIT3、SPARCL1 蛋白表達與患者術后復發(fā)密切相關。通過COX 單因素和多因素分析顯示，中/高分化、Ⅱa 分期、淋巴結轉移、基質浸潤深度> 50%、SLIT3 低表達、SPARCL1 低表達是影響宮頸癌患者根治術后復發(fā)的獨立危險因素，可作為宮頸癌根治術預后預測的有效指標。

綜上所述，宮頸癌組織SLIT3、SPARCL1 蛋白表達與宮頸癌患者臨床病理特征和術后復發(fā)關系密切，具有成為宮頸癌病情和預后評估的生物標志物的潛力。