文麗芳 丁潔

1山西醫(yī)科大學(xué)汾陽(yáng)學(xué)院（山西汾陽(yáng) 032200）；2山西省汾陽(yáng)醫(yī)院（山西汾陽(yáng) 032200）

宮頸癌是婦科常見(jiàn)惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在女性腫瘤中均位列前茅，手術(shù)和放化療是目前采取的主要治療方法。雖然宮頸/陰道脫落細(xì)胞學(xué)和人乳頭瘤病毒檢查的普及大大提升早期診斷和治療率，患者預(yù)后得到一定改善［1］，但術(shù)后復(fù)發(fā)仍舊是嚴(yán)重困擾醫(yī)患的難題，死亡率也并未明顯降低，加上近年來(lái)年輕化的發(fā)病趨勢(shì)，宮頸癌防治形勢(shì)依然十分嚴(yán)峻［2］。繼續(xù)研究發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)記物對(duì)于降低復(fù)發(fā)率、有效控制病情發(fā)展意義重大。神經(jīng)軸突導(dǎo)向因子SLITs 是一個(gè)分泌蛋白家族，成員包括SLIT1-3，通過(guò)Robo 受體結(jié)合發(fā)出信號(hào)，在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等多種生理過(guò)程中發(fā)揮作用［3］。有研究發(fā)現(xiàn)，SPARCL1 是9 個(gè)與宮頸癌發(fā)生有關(guān)的基因之一，在宮頸癌的發(fā)展中發(fā)揮核心作用，也與癌前病變和腫瘤細(xì)胞遷移過(guò)程有關(guān)［4］。目前關(guān)于SLIT3、SPARCL1 與宮頸癌的研究較少，本研究通過(guò)對(duì)107 例宮頸癌患者癌細(xì)胞SLIT3、SPARCL1 蛋白表達(dá)進(jìn)行觀察和研究，探討其表達(dá)水平與根治術(shù)后復(fù)發(fā)的相關(guān)性。報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2019年10月至2021年4月在醫(yī)院接受宮頸癌根治術(shù)治療的107 例患者作為研究對(duì)象，另選取子宮肌瘤等子宮良性病變行手術(shù)切除的30 例患者正常宮頸組織作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）首次接受根治術(shù)治療，經(jīng)病理組織學(xué)確診為宮頸癌；（2）年齡超過(guò)18歲；（3）臨床資料完整；（4）術(shù)前未采用化療、放療等其他抗腫瘤治療，術(shù)后采用相同的抗腫瘤方案；（5）FIGO 2018 分期Ⅰ-Ⅱa 期。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并心、肝、腎、肺等其他重要臟器功能不全；（2）合并其他惡性腫瘤；（3）合并免疫系統(tǒng)疾??；（4）術(shù)后未經(jīng)病理組織學(xué)確診。107例患者年齡25～78歲，平均（52.65±11.57）歲；臨床分期：Ⅰa 期23 例，Ⅰb 期39 例，Ⅱa 期45 例；病理分級(jí)：低分化27 例，中分化43 例，高分化37 例；病理類(lèi)型：鱗癌78 例，腺癌29 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25 例，未轉(zhuǎn)移82 例；腫瘤最大徑未超過(guò)4 cm 共72 例，超過(guò)4 cm 共35 例；基質(zhì)浸潤(rùn)深度：> 50%共84 例，≤ 50%共23 例。本次研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)會(huì)議表決通過(guò)后實(shí)施。

1.2 治療方法和標(biāo)本采集所有患者均符合手術(shù)指征，根據(jù)患者腫瘤大小、臨床分期、病理分級(jí)等采取標(biāo)準(zhǔn)及個(gè)體化的手術(shù)及術(shù)后輔助治療［5］。術(shù)中采集患者宮頸癌組織液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)方法（1）提取組織總RNA：標(biāo)本組織剪碎加入Trizol 試劑（福州飛凈生物科技有限公司，貨號(hào)：PH1420）600 μL 和400 μL 充分研磨組織；1.5 mL EP 管收集研磨液，5427R 超低溫離心機(jī)（德國(guó)艾本德公司）4 ℃、12 000 r/min 離心15 min；離心后取上清液轉(zhuǎn)移至新EP 管中，按1：1 體積加入異丙醇，充分混勻后靜置10 min 再次離心分離；去上清后加入75%酒精1 mL，充分混勻后離心；再次去上清，冰上晾干殘留酒精，加入適量DEPC水，吹打混勻后溶解提取RNA；使用UV5Nano 超微量分光光度計(jì)（梅特勒-托利多國(guó)際有限公司）測(cè)定樣本RNA 濃度，A260/280 在1.8～2.0 區(qū)間內(nèi)為合格，-20 ℃冰箱保存待用。（2）根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)準(zhǔn)備逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，將FastKing RT Enzyme Mix 加到cDNA 去除步驟反應(yīng)中，充分混勻后42 ℃孵育15 min；95 ℃孵育3 min 后合成的cDNA 反應(yīng)液-20 ℃保存待下游熒光定量檢測(cè)。（3）實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)（PCR）：采用FastKing 一步法RT-PCR試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司，目錄號(hào)：KR123］，配制擴(kuò)增反應(yīng)體系；待測(cè)溶液離心后于7500 Fast 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 系統(tǒng)（美國(guó)賽默飛公司）中檢測(cè)，參數(shù)設(shè)置：95 ℃預(yù)變性15 min，95 ℃10 s 退火，60 ℃ 32 s 延伸，40 cycles。反應(yīng)結(jié)束后收集數(shù)據(jù)，計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平。SLIT3 引物序列：上游：ATCAACTGCCTGCGGGTAAA；下游：CAAGTGGCAGTCGCAAACAA；SPARCL1 引物序列：上游：TTGGCTCCTGGTGTTAGTTC，下游：ATCCTGCTCTTGG-TTTCCTT。（4）免疫組化檢測(cè)：標(biāo)本組織固定于載玻片上，經(jīng)烘烤、二甲苯浸泡、風(fēng)干后置于濃度遞減的乙醇中靜置，每個(gè)濃度5 min；高溫抗原修復(fù)后將切片洗滌3 次；分別加入一抗兔抗人重組抗體（SLIT3 和SPARCL1，美國(guó)Abcam 公司，貨號(hào)：ab198726、ab255597），4 ℃冰箱孵育過(guò)夜；次日組織表面滴加即用型山羊抗兔二抗；加入預(yù)先調(diào)制好的DAB 顯色液進(jìn)行顯色。蘇木素染色，按組織按照濃度由低到高排列，分別在不同濃度乙醇、二甲苯、甲苯中靜置5 min，樹(shù)膠封片。根據(jù)著色程度和面積進(jìn)行評(píng)分，著色按照強(qiáng)、中、弱、無(wú)分別計(jì)3 分、2 分、1 分和0 分；視野面積超過(guò)75%計(jì)4 分，超過(guò)50%計(jì)3 分，超過(guò)25%計(jì)2 分，未超過(guò)25%計(jì)1 分。將二種評(píng)分方法得出的分?jǐn)?shù)相乘作為最終分?jǐn)?shù)（0～12 分）。5～12 分為高表達(dá)，1～4 分為低表達(dá)，0 分為不表達(dá)。高表達(dá)為高表達(dá)組，低表達(dá)或不表達(dá)為低表達(dá)組。

1.4 隨訪以術(shù)后第1天作為隨訪起點(diǎn)，術(shù)后12個(gè)月期滿或患者復(fù)發(fā)作為隨訪終點(diǎn)；每3 個(gè)月通過(guò)電話、門(mén)診、住院等多種方式結(jié)合的方法進(jìn)行1 次隨訪；所有患者未失訪。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料經(jīng)檢驗(yàn)符合正態(tài)分布采用“±s”表示，獨(dú)立樣本間差異采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析；不符合正態(tài)分布采用非參數(shù)檢驗(yàn)。采用COX 回歸模型分析術(shù)后復(fù)發(fā)因素。P< 0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 隨訪結(jié)果所有患者均隨訪1 年，其中25 例患者復(fù)發(fā)，82 例患者未復(fù)發(fā)。

2.2 SLIT3、SPARCL1 mRNA 在宮頸癌、正常宮頸組織中表達(dá)宮頸癌組SLIT3、SPARCL1 mRNA表達(dá)顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

表1 SLIT3、SPARCL1 mRNA 在宮頸癌、正常宮頸組織中表達(dá)Tab.1 Expression of SLIT3 and SPARCL1 mRNA in cervical cancer and normal cervical tissues ±s

組別宮頸癌組對(duì)照組t值P值例數(shù)107 30 SLIT3 mRMA 0.24±0.18 1.27±0.05 30.934 0.000 SPARCL1 mRNA 0.15±0.18 1.35±0.21 31.087 0.000

圖1 免疫組化檢測(cè)SLIT3、SPARCL1 在宮頸癌及正常宮頸組織中的表達(dá)Fig.1 Immunohistochemical detection of the expression of SLIT3 and SPARCL1 in cervical cancer and normal cervical tissue

2.3 SLIT3、SPARCL1 mRNA 在復(fù)發(fā)、未復(fù)發(fā)患者宮頸癌組織中表達(dá)復(fù)發(fā)組患者宮頸癌組織SLIT3、SPARCL1 mRNA 水平顯著低于未復(fù)發(fā)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）。見(jiàn)表2。

表2 SLIT3、SPARCL1 mRNA 在復(fù)發(fā)、未復(fù)發(fā)患者宮頸癌組織中表達(dá)Tab.2 Expression of SLIT3 and SPARCL1 mRNA in cervical cancer tissues of recurrent and non-recurrent patients ±s

表2 SLIT3、SPARCL1 mRNA 在復(fù)發(fā)、未復(fù)發(fā)患者宮頸癌組織中表達(dá)Tab.2 Expression of SLIT3 and SPARCL1 mRNA in cervical cancer tissues of recurrent and non-recurrent patients ±s

組別復(fù)發(fā)組未復(fù)發(fā)組t值P值例數(shù)25 82 SLIT3 mRMA 0.12±0.11 0.28±0.15 5.946 0.000 SPARCL1 mRNA 0.09±0.08 0.17±0.15 2.552 0.012

2.4 宮頸癌組織 SLIT3、SPARCL1 蛋白表達(dá)與術(shù)后復(fù)發(fā)107 例根治術(shù)患者中25 例患者術(shù)后復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率為23.36%；根據(jù)SLIT3、SPARCL1 免疫組化檢測(cè)結(jié)果分為SLIT3 低表達(dá)組（61 例）、SLIT3高表達(dá)組（46 例）、SPARCL1 低表達(dá)組（65 例）、SPARCL1 高表達(dá)組（42 例）。SLIT3 低表達(dá)患者術(shù)后復(fù)發(fā)率（31.15%）顯著高于SLIT3 高表達(dá)患者術(shù)后復(fù)發(fā)率（13.04%），SPARCL1 低表達(dá)患者術(shù)后復(fù)發(fā)率（32.31%）顯著高于SPARCL1 高表達(dá)患者術(shù)后復(fù)發(fā)率（9.52%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）。見(jiàn)表3。

表3 宮頸癌組織 SLIT3、SPARCL1 蛋白表達(dá)與術(shù)后復(fù)發(fā)Tab.3 Expression of SLIT3 and SPARCL1 proteins in cervical cancer tissue and postoperative recurrence

2.5 宮頸癌組織 SLIT3、SPARCL1 蛋白表達(dá)與臨床病理特征相關(guān)性宮頸癌組織SLIT3、SPARCL1蛋白表達(dá)與分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、基質(zhì)浸潤(rùn)深度相關(guān)，與年齡、病理類(lèi)型、腫瘤最大徑無(wú)關(guān)。見(jiàn)表4。

表4 宮頸癌組織 SLIT3、SPARCL1 表達(dá)與臨床病理特征相關(guān)性Tab.4 Correlation between the expression of SLIT3，SPARCL1 and clinicopathological characteristics in cervical cancer 例

2.6 影響宮頸癌患者根治術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素將SLIT3 蛋白高表達(dá)、SPARCL1 蛋白高表達(dá)、間質(zhì)浸潤(rùn)深度≤ 50%、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、低分化程度、Ⅰa/Ⅰb 分期賦值為0，SLIT3 低表達(dá)、SPARCL1 低表達(dá)、基質(zhì)浸潤(rùn)深度> 50%、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、中/高分化程度、Ⅱa 分期賦值為1。COX 單因素分析顯示，分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、基質(zhì)浸潤(rùn)深度、SLIT3 表達(dá)、SPARCL1 表達(dá)與宮頸癌患者根治術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)（P< 0.05），見(jiàn)表5；COX 多因素分析顯示，中/高分化、Ⅱa 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、基質(zhì)浸潤(rùn)深度 > 50%、SLIT3 低表達(dá)、SPARCL1 低表達(dá)是影響宮頸癌患者根治術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P<0.05），見(jiàn)表6。

表5 COX 單因素分析Tab.5 COX single factor analysis

表6 COX 多因素分析Tab.6 COX Multi-factor Analysis

3 討論

作為早期宮頸癌的主要治療方法，宮頸癌根治術(shù)有效提高了患者總生存率［6-7］，但是術(shù)后復(fù)發(fā)率尤其是局部復(fù)發(fā)居高不下，術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍舊是臨床面臨的重要難題。術(shù)后輔助放療、化療及同步放化療是宮頸癌患者生存獲益的主要方式。通過(guò)更多的特異性指標(biāo)預(yù)測(cè)患者術(shù)后復(fù)發(fā)對(duì)于患者預(yù)后意義重大。

神經(jīng)導(dǎo)向因子是一種在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中調(diào)控神經(jīng)元的發(fā)生與遷移、對(duì)神經(jīng)元軸突傳達(dá)吸引或排斥信號(hào)的生物分子，包括SLITS、Ephrins、Semaphorins 等諸多分子家族［8-10］。許多神經(jīng)導(dǎo)向因子和炎癥、腫瘤發(fā)展等病理過(guò)程密切相關(guān)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，SLIT/Robo 信號(hào)通路可調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、侵襲、粘附等，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮巨大作用［11］。有研究指出，SLIT3 在多種腫瘤組織中的表達(dá)顯著低于正常組織，且SLIT3低或過(guò)表達(dá)會(huì)影響腫瘤增殖、侵襲等行為［12］。NARAYAN 等［13］研究顯示，SLIT3/Robo 信號(hào)通路相關(guān)蛋白在宮頸癌組織中低表達(dá)或不表達(dá)，可能是由于DNA 甲基化調(diào)控導(dǎo)致的。

SPARCL1 是細(xì)胞基質(zhì)蛋白（SPARC）中富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白家族成員。SPARCL1 蛋白是具有抗粘附、抗增殖和抗致癌效果的細(xì)胞基質(zhì)蛋白，調(diào)控細(xì)胞間粘附、遷移和侵襲，可通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤生長(zhǎng)和分化參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展［14］。近年來(lái)相關(guān)研究顯示，SPARCL1 在多種惡性腫瘤組織中的表達(dá)下調(diào)甚至缺失，這也加快了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［15］。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)SPARCL1 與宮頸癌發(fā)病過(guò)程中的癌前病變和遷移過(guò)程有關(guān)，可能是一種新的癌癥預(yù)測(cè)標(biāo)志物，也是宮頸癌發(fā)生和發(fā)展的潛在治療靶點(diǎn)［16］。

本研究中，宮頸癌組織SLIT3、SPARCL1 mRNA表達(dá)明顯低于正常宮頸組織，且與術(shù)后未復(fù)發(fā)患者比較，術(shù)后復(fù)發(fā)患者宮頸癌組織SLIT3、SPARCL1 mRNA 表達(dá)明顯偏低，同時(shí)宮頸癌組織SLIT3、SPARCL1 蛋白表達(dá)與分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、基質(zhì)浸潤(rùn)深度相關(guān)，提示宮頸癌組織SLIT3、SPARCL1在宮頸癌病情發(fā)展和預(yù)后中有重要參與。對(duì)SLIT3、SPARCL1 蛋白表達(dá)分組患者研究顯示，低表達(dá)患者術(shù)后復(fù)發(fā)率明顯高于高表達(dá)患者，提示SLIT3、SPARCL1 蛋白表達(dá)與患者術(shù)后復(fù)發(fā)密切相關(guān)。通過(guò)COX 單因素和多因素分析顯示，中/高分化、Ⅱa 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、基質(zhì)浸潤(rùn)深度> 50%、SLIT3 低表達(dá)、SPARCL1 低表達(dá)是影響宮頸癌患者根治術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可作為宮頸癌根治術(shù)預(yù)后預(yù)測(cè)的有效指標(biāo)。

綜上所述，宮頸癌組織SLIT3、SPARCL1 蛋白表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理特征和術(shù)后復(fù)發(fā)關(guān)系密切，具有成為宮頸癌病情和預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物的潛力。