程多 褚菲菲 張楠 王晶晶 陳夢閣 岳文莉 郜輝 梁芳

鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院 1腫瘤康復(fù)科病區(qū)，2消化內(nèi)科 （鄭州 450000）

結(jié)腸癌（colon cancer，CC）是人類常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率逐年升高，全世界每年新增120 萬例結(jié)腸癌患者，死亡60 萬例［1］。結(jié)腸癌發(fā)病機制復(fù)雜，致癌途徑的激活以及防御機制的抑制是導(dǎo)致腫瘤的重要原因，其不但影響消化系統(tǒng)功能，且遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移可累及肝臟、肺部等器官［2］。當(dāng)結(jié)腸癌被早期診斷時，可以手術(shù)治愈，被診斷為晚期時，化療藥物的療效便十分有限［3］。因此，發(fā)現(xiàn)新的治療手段和治療靶點至關(guān)重要。果糖二磷酸醛縮酶C（fructose?bisphosphate aldol?ase C，ALDOC）作為一種糖酵解酶，也是ATP 合成過程中必須需要的酶，其主要存在紅細(xì)胞和骨骼肌當(dāng)中［4?5］，既往研究顯示ALDOC 不僅能夠參與糖酵解過程，還在細(xì)胞形態(tài)位置以及自身免疫疾病當(dāng)中扮演重要角色［6］，隨著研究的不斷深入，多數(shù)學(xué)者證實糖代謝異常在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程起著至關(guān)重要作用，目前已成為腫瘤熱點研究方向［7?8］。因此本研究擬討ALDOC 在結(jié)腸癌組織和細(xì)胞中的表達和對結(jié)腸癌細(xì)胞SW620 侵襲轉(zhuǎn)移的影響，以期為結(jié)腸癌的臨床靶向治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料選擇2021 年1 月到2022 年8 月在鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院診治的90 例結(jié)腸癌患者，收集患者的病歷資料（包括年齡、性別、腫瘤直徑等）及手術(shù)切除的結(jié)腸癌組織標(biāo)本及癌旁標(biāo)本。采集的標(biāo)本保存于液氮。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）入選患者均經(jīng)病理切片確診為結(jié)腸癌；（2）原發(fā)性結(jié)腸癌，并未經(jīng)放化療干預(yù)；（3）病理資料均完整；（4）癌旁組織均為遠(yuǎn)離病灶位置2 cm 以上的組織，且經(jīng)病理證實正常的組織。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴隨有其他惡性腫瘤的患者。

1.2 研究材料人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞株FHC、結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620、SW480、HT?29、HCT?116（北納生物科技有限公司）；RPMI 1640 培養(yǎng)液、胰蛋白酶（美國Gibco 公司）；胎牛血清（中國四季青生物公司）；NC inhibitor、ALDOC inhibitor（上海生物工程有限公司）；LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑盒（美國Invitrogen 公司）；ALDOC、U6、GAPDH 引物（上海華大基因科技有限公司）；BCA 試劑盒、ECL 顯影劑（中國碧云天公司）；ALDOC 抗體（美國Abcam公司）；基質(zhì)金屬蛋白酶2/9（matrix metalloprotein?ase?2/9，MMP?2/9）抗體（美國CST 公司）；二抗（北京博爾西科技有限公司）；Thermo 酶標(biāo)儀（上海熱電儀器有限公司）；冷凍離心機（美國Beckman 公司）；Bio?Rad 蛋白電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、凝膠成像儀（美國伯樂公司）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組細(xì)胞培養(yǎng)：FHC、SW620、SW480、HT?29、HCT?116 細(xì)胞株，培養(yǎng)基為RPOM1640 培養(yǎng)基，含有10%的胎牛血清，然后置于恒溫培養(yǎng)箱當(dāng)中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：37℃、5% CO2，每間隔2 d 更換一次培養(yǎng)基，然后觀察細(xì)胞融合度，當(dāng)達到80%時，加入胰蛋白酶，將細(xì)胞消化分散，然后進行傳代。

細(xì)胞分組：將SW620 細(xì)胞分為對照組（未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞）、NC inhibitor 組（轉(zhuǎn)染NC inhibitor 的細(xì)胞）、ALDOC inhibitor 組（轉(zhuǎn)染ALDOC inhibitor 的細(xì)胞）。根據(jù)LipofectamineTM2000 說明書，將ALDOC模擬物及陰性對照轉(zhuǎn)染各組SW620、HCT?116 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染4 h 后更換培養(yǎng)基，24 h 后通過qRT?PCR及Western blot 檢測是否轉(zhuǎn)染成功。

1.3.2 在線生物數(shù)據(jù)庫分析使用GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析ALDOC 在正常結(jié)腸組織和結(jié)腸癌組織中的表達水平及對患者預(yù)后生存期的影響。

1.3.3 RT?qPCR檢測結(jié)腸癌組織及細(xì)胞中ALDOC mRNA 的表達采用Trizol 試劑從細(xì)胞中提取總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并使用SYBR Green 法進行擴增，U6 作內(nèi)參。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃ 60 s，60℃ 30 s，共40個循環(huán)。使用2?ΔΔCT公式計算ALDOC 的相對表達水平。PCR 引物序列：ALDOC?F：5′?AAACCGA?AGTCATAGCCACA?3′，ALDOC?R：5′?TCTCCTAA?GCGATGCTCAAA?3′；GAPDH?F：5′?GAAGGTGA?AGGTCGGAGT?3′，GAPDH?R：5′?GAAGATGGTG?ATGGGATTTC。

1.3.4 MTT法和細(xì)胞單克隆形成檢測細(xì)胞增殖細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，置于培養(yǎng)箱當(dāng)中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：37℃，5% CO2，轉(zhuǎn)染24 h 之后，加入胰蛋白酶來對細(xì)胞進行消化，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量為1 × 103，接著接種至96 孔板，置于恒溫培養(yǎng)箱當(dāng)中培養(yǎng)，在24、48、72、96 h 時，每個時間點取三個孔均加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心丟棄培養(yǎng)液上清，采用離心DMSO 將細(xì)胞重懸，檢測吸光度值（450 nm）。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入消化酶調(diào)整各組細(xì)胞濃度為1 × 103/孔，接種到6 孔板當(dāng)中，置于恒溫培養(yǎng)箱當(dāng)中繼續(xù)培養(yǎng)10 d，取出各組細(xì)胞，加入4%的多聚甲醛溶液，將細(xì)胞充分固定，加入結(jié)晶紫進一步的染色，采用磷酸緩沖液將多余的結(jié)晶紫清除，置于顯微鏡下觀察計數(shù)，同時進行拍照。

1.3.5 劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力將各組細(xì)胞接種于6 孔板，細(xì)胞培養(yǎng)48 h，加入胰蛋白酶消化細(xì)胞，然后計數(shù)，同時采用培養(yǎng)基將細(xì)胞的密度調(diào)整為1 × 103，接種到6 孔板中繼續(xù)進行培養(yǎng)，每組設(shè)3 個復(fù)孔，觀察所有的細(xì)胞呈現(xiàn)單臂生長時，采用200 μL 移液器的槍頭進行劃線，然后采用磷酸緩沖液將游離的細(xì)胞洗去，將無血清培養(yǎng)液加入進去繼續(xù)培養(yǎng)，同時顯微鏡拍照記錄劃痕寬度，培養(yǎng)24 h 再次拍照記錄劃痕寬度。細(xì)胞遷移率=（0 h 劃痕寬度?24 h 劃痕寬度）/0 h 劃痕寬度×100%。

1.3.6 Transwell 小室實驗檢測細(xì)胞侵襲能力取50 μL 的matrigel 基質(zhì)膠，將其平鋪在Transwell 小室平板中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 × 103，加入到Tran?swell 上室，同時加入無血清的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，在Transwell 下室當(dāng)中加入含有10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基，然后將整個Transwell 小室放置到培養(yǎng)箱當(dāng)中培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2，取出細(xì)胞采用磷酸緩沖液將游離細(xì)胞去除，加入甲醛進行固定，加入1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下拍照，同時計數(shù)。

1.3.7 Western blot 檢測細(xì)胞ALDOC、MMP?2、MMP?9 的表達各組細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液，離心所得的上清即為蛋白樣品，用BCA 蛋白檢測并調(diào)整蛋白濃度進行上樣，蛋白定量變性后SDS?PAGE電泳分離，然后進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，加入TBST溶液（含有5%的脫脂奶粉）進行封閉120 min，之后加入經(jīng)過稀釋的一抗ALDOC、MMP?2、MMP?9（濃度為1∶2 000），置于4℃冰箱當(dāng)中過夜，次日采用TBST 洗滌3 次后，加入二抗（濃度為1∶10 000），室溫下繼續(xù)孵育120 min，之后加入ECL 顯色液，避光孕育30 min，以GAPDH 作為內(nèi)參，凝膠成像儀下拍照，進行定量分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 26.0，畫圖采用Graphpad5.01，其中計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨立t檢驗，計數(shù)資料以例（%）表示，采用χ2檢驗，P< 0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ALDOC 在結(jié)腸癌組織中的表達GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析顯示結(jié)腸癌組織的ALDOC 表達水平明顯高于正常組織（圖1A），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.05），說明ALDOC 的表達在結(jié)腸癌中具有研究意義。同時本研究分析90 例結(jié)腸癌患者組織中ALDOC mRNA（圖1B）和蛋白（圖1C）水平發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，結(jié)腸癌組織中ALDOC mRNA和蛋白水平明顯升高（P< 0.05）。將90 例患者按照ALDOC mRNA 相對表達量（中位數(shù)）分為高表達組（58 例）（ALDOC mRNA > 中位數(shù)）、低表達組（32例）（ALDOC mRNA ≤ 中位數(shù)）。結(jié)果（表1）顯示，ALDOC 的表達水平與年齡、性別、腫瘤直徑等無明顯相關(guān)性（P> 0.05），而與腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有明顯的相關(guān)性（P< 0.05）。說明ALDOC 在結(jié)腸癌組織中表達上調(diào)，且扮演致癌基因的角色。

圖1 ALDOC 在結(jié)腸癌組織中的表達Fig.1 The expression of aldoc in colon cancer

表1 ALDOC mRNA 表達水平與結(jié)腸癌患者臨床病理因素的關(guān)系Tab.1 Relationship between ALDOC mRNA expression level and clinicopathological factors in patients with colon cancern 例（%）

2.2 ALDOC 在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達與正常結(jié)腸上皮細(xì)胞FHC 相比，結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620、SW480、HT?29、HCT?116 中ALDOC mRNA 表達量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.05），見圖2A。將ALDOC inhibitor 及其陰性對照轉(zhuǎn)染SW620 細(xì)胞后，RT?qPCR、Western blot 檢測SW620細(xì)胞中ALDOC mRNA 和蛋白表達水平發(fā)現(xiàn)，與NC inhibitor 組相比，ALDOC inhibitor 組ALDOC mRNA和蛋白水平下調(diào)（P< 0.05），見圖2B?C，提示成功構(gòu)建了穩(wěn)定下調(diào)ALDOC 表達的結(jié)腸癌細(xì)胞系。

圖2 ALDOC 在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達Fig.2 the expression of aldoc in colon cancer cells

2.3 下調(diào)ALDOC 抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力與NC inhibitor 組相比，ALDOC inhibitor組單克隆形成數(shù)目減少（圖3B），24、48、72、96 hOD值降低（圖3A），劃痕變寬，愈合率降低（圖3C），細(xì)胞侵襲數(shù)減少（圖3D），MMP?2、MMP?9 表達下調(diào)（圖3E）。說明下調(diào)ALDOC 抑制結(jié)腸癌細(xì)胞SW620 的增殖、遷移和侵襲。

圖3 下調(diào)ALDOC 抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力Fig.3 Down?regulates the ability of ALDOC to inhibit the proliferation，migration and invasion of colon cancer cells

2.4 ALDOC 影響結(jié)腸癌細(xì)胞惡性表型的作用機制通過檢測結(jié)腸癌組織和癌細(xì)胞中ALDOC 水平，發(fā)現(xiàn)ALDOC mRNA 和蛋白水平在結(jié)腸癌組織和細(xì)胞中表達上調(diào)，且ALDOC mRNA 水平與患者腫瘤分化程度、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有明顯的相關(guān)性，ALDOC 扮演致癌基因的角色。說明ALDOC與結(jié)腸癌進展相關(guān)。為了進一步觀察ALDOC 對結(jié)腸癌細(xì)胞惡性行為的影響，檢測癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力。發(fā)現(xiàn)下調(diào)ALDOC 抑制細(xì)胞增殖；通過下調(diào)金屬基質(zhì)蛋白酶MMP?2、MMP?9 水平抑制細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。由此推斷ALDOC1 通過調(diào)節(jié)MMP?2、MMP?9 調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。見圖4。

圖4 ALDOC1 影響結(jié)腸癌細(xì)胞惡性表型的作用機制Fig.4 the mechanism of ALDOC1 affecting the malignant phenotype of colon cancer cells

3 討論

結(jié)腸癌作為我國常見的消化道腫瘤，其發(fā)病率以每年4%遞增。雖然結(jié)腸癌的臨床治療手段有了突破性的進展，但是結(jié)腸癌的治療已進入瓶頸期，開展個體化的分子靶向治療已經(jīng)刻不容緩［9］。因此對結(jié)腸癌的早期診斷和治療至關(guān)重要。在有氧條件下，正常細(xì)胞中線粒體進行有氧代謝，而腫瘤細(xì)胞氧氣充足情況下，卻以糖酵解形式產(chǎn)生能量，而不是以氧化磷酸化形成，學(xué)者們將這一現(xiàn)象稱之為Warburg 效應(yīng)［10］。研究已經(jīng)證實［11］Warburg 效應(yīng)不僅能夠產(chǎn)生能量來滿足腫瘤細(xì)胞的增殖，還能夠為核苷酸、脂質(zhì)等合成提供物質(zhì)基礎(chǔ)，維持異常增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、耐藥和免疫逃逸等多種惡性生物學(xué)行為。此外，糖酵解過程當(dāng)中會產(chǎn)生中間體，其在大分子生物合成過程當(dāng)中扮演著極其重要角色，即使處于營養(yǎng)供應(yīng)減少的環(huán)境中，癌細(xì)胞也具有更高的生長優(yōu)勢［12］。因此，降低腫瘤細(xì)胞的糖酵解能力對抑制其增殖、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為有重要的意義。近期有研究證實ALDOC 過表達后將會加速糖酵解進程，且其在癌組織和細(xì)胞當(dāng)中高表達，與增殖密切相關(guān)，下調(diào)ALDOC 將會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的ATP 減少，細(xì)胞膜破壞，從而抑制腫瘤增殖［13?16］。本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織及細(xì)胞中ALDOC 表達明顯高于癌旁組織和正常結(jié)腸上皮細(xì)胞，且發(fā)現(xiàn)ALDOC 表達水平與TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度存在正相關(guān)的關(guān)系（P< 0.05）。同時細(xì)胞學(xué)實驗顯示，敲低ALDOC水平后，SW620 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力明顯減弱，說明ALDOC 在結(jié)腸癌中發(fā)揮促癌作用。

由于結(jié)腸與許多相鄰結(jié)構(gòu)接觸，結(jié)腸癌細(xì)胞也傾向于積極攻擊相鄰組織［17］。因此，確定結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的潛在機制至關(guān)重要?；|(zhì)金屬蛋白酶是一類能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的蛋白水解酶，在腫瘤細(xì)胞突破基底膜屏障而浸潤轉(zhuǎn)移中起重要作用，在許多腫瘤組織中，都發(fā)現(xiàn)MMP?2、MMP?9 高表達［18?19］。DEGIRMENCI 等［20］報道蛋白激酶B2（protein kinase B2，AKT2）在結(jié)腸癌組織中表達升高，AKT2 提高了結(jié)腸癌細(xì)胞中MMP?2/9 的表達，從而促進了細(xì)胞遷移、侵襲。柳雅雯［21］發(fā)現(xiàn)miR?141?3p 通過靶向UNC 家族5C（uncoordinated 5C，UNC5C）促進MMP?2、MMP?9 表達，從而促進結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。本研究中下調(diào)ALDOC 后，MMP?2、MMP?9 表達下降，同時劃痕實驗和Transwell 小室實驗顯示細(xì)胞的侵襲和遷移能力下降，說明下調(diào)ALDOC 通過下調(diào)MMP?2、MMP?9 水平抑制細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

綜上所述，ALDOC 水平在結(jié)腸癌組織和細(xì)胞中表達上調(diào)，且與結(jié)腸癌患者的不良預(yù)后緊密相關(guān)。ALDOC 通過調(diào)節(jié)MMP?2、MMP?9 表達調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。為MMP?2、MMP?9作為結(jié)腸癌的診斷標(biāo)志物和治療靶點奠定了理論及實驗基礎(chǔ)。