蔡銳娜 陳 乾 趙 哲 胡仕祥△

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450008；2.河南省中醫(yī)院，河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450002）

急性胰腺炎（AP）是臨床常見急腹癥［1］，AP 發(fā)病急，進(jìn)展快，常呈自限性，但仍有約20%～30%的患者雖積極治療發(fā)展為單個(gè)或多臟器功能障礙，其中死亡率可高達(dá)30%～50%［2-3］，嚴(yán)重威脅人類的健康。近年來的臨床實(shí)踐與基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)［4-6］，中醫(yī)藥對(duì)AP 的治療具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，西醫(yī)常規(guī)治療與中醫(yī)藥并用的中西醫(yī)結(jié)合治療能取得滿意的臨床療效。

課題組根據(jù)臨床治療AP的經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)出中藥復(fù)方清胰化瘀通腑湯，組方：生大黃10 g（后下），茵陳蒿15 g，芒硝10 g（沖），桃仁10 g，柴胡10 g，厚樸10 g，木香5 g，丹參10 g，紅花10 g，延胡索15 g，金銀花10 g，連翹10 g。以清熱利濕、化瘀通腑為法，應(yīng)用于臨床能有效減輕AP患者不同嚴(yán)重程度的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)患者臨床癥狀恢復(fù)。但其治療AP 的機(jī)制因復(fù)方成分復(fù)雜無法全面闡述，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)來探討清胰化瘀通腑方治療AP的主要成分及靶點(diǎn)，并利用分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，為后續(xù)更深層次地探討清胰化瘀通腑方的主要調(diào)控靶點(diǎn)及作用機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 清胰化瘀通腑方活性成分的篩選和靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 將清胰化瘀通腑方中的藥物輸入到中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫分析平臺(tái)TCMSP［7］中，篩選條件設(shè)置為口服生物利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18［8］，從而獲得藥物活性成分，并根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)篩選結(jié)果進(jìn)行補(bǔ)充，避免遺漏。將藥物活性成分導(dǎo)入Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫中得到對(duì)應(yīng)的SMILES，再通過SwissTargetPrediction［9］數(shù)據(jù)庫將物種限定為“Homo sapiens”，對(duì)清胰化瘀通腑方活性成分進(jìn)行潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)（因TCMSP 中沒有礦石類中藥，故用BATMAN-TCM［10］數(shù)據(jù)庫補(bǔ)充篩選芒硝的活性成分及靶點(diǎn)）。對(duì)上述結(jié)果匯總?cè)ブ夭⑼ㄟ^UniProt（https：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫對(duì)靶點(diǎn)信息進(jìn)行規(guī)范，獲得清胰化瘀通腑方活性成分的潛在靶點(diǎn)。

1.2 AP 疾病靶基因的篩選 以“AcutePancreatitis”為關(guān)鍵詞在GeneCards［11］、DrugBank［12］、OMIM［13］、TTD［14］疾病數(shù)據(jù)中檢索AP 的潛在靶點(diǎn)，將4 個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫得到的靶點(diǎn)匯總?cè)ブ睾蟮玫紸P 靶點(diǎn)。將清胰化瘀通腑方潛在靶點(diǎn)與AP 靶點(diǎn)輸入Venny 在線軟件，繪制韋恩圖獲取清胰化瘀通腑方-AP 交集靶點(diǎn)，得到的交集靶點(diǎn)即為清胰化瘀通腑方治療AP的作用靶點(diǎn)。

1.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與關(guān)鍵靶點(diǎn)的篩選 將清胰化瘀通腑方—急性胰腺炎交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫，按物種為“Homo sapiens”，最小互相作用閾值“highest confidence”（＞0.9）［15］為檢測(cè)條件，剔除游離靶點(diǎn)后得到蛋白互作信息，通過Cytoscape3.7.2 軟件的Network Analyzer 工具分析其網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，并繪制PPI網(wǎng)絡(luò)模型。運(yùn)用CytoNCA［16］拓?fù)浞治龈鱾€(gè)節(jié)點(diǎn)的屬性值，包括中介中心性（BC）、接近中心性（CC）、度中心性（DC）、網(wǎng)絡(luò)中心性（NC）和局部邊連通性（LAC），選出同時(shí)滿足BC、CC、DC、NC、LAC＞中位數(shù)的所有節(jié)點(diǎn)作為關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.4 清胰化瘀通腑方治療AP 的富集分析 將清胰化瘀通腑方治療AP 的作用靶點(diǎn)的基因Symbol 通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)換為基因ID，利用R 語言以P≤0.05為篩選條件進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析，并將結(jié)果繪制成條形圖和氣泡圖。

1.5 建立清胰化瘀通腑方“藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)”調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 通過Cytoscape3.7.2 構(gòu)建“藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，運(yùn)用Network Analyzer 工具拓?fù)浞治龌钚猿煞趾妥饔冒悬c(diǎn)，篩選出發(fā)揮藥效的核心成分，可供使用的篩選條件包括連接度（Degree）、BC 及CC等。

1.6 分子對(duì)接 從PubChem 中下載“藥物-有效成分-作用靶點(diǎn)”拓?fù)浞治雠琶? 的核心成分的小分子結(jié)構(gòu)，應(yīng)用Chem3D 軟件進(jìn)行優(yōu)化，并轉(zhuǎn)換為3D 格式。在PDB 數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/）中篩選PPI網(wǎng)絡(luò)中拓?fù)浞治雠琶? 的核心靶點(diǎn)的蛋白結(jié)構(gòu)，用PyMOL軟件對(duì)其脫水并剔除原配體，利用AutoDockTools1.5.6和AutoDock Vina 完成分子對(duì)接，對(duì)部分對(duì)接結(jié)果用PyMOL軟件進(jìn)行可視化。

2 結(jié) 果

2.1 清胰化瘀通腑方有效活性成分篩選及靶點(diǎn)獲取 見表1。從TCMSP 中下載大黃、茵陳蒿、桃仁、柴胡、厚樸、木香、丹參、紅花、延胡索、金銀花、連翹中符合OB 值及DL 值篩選條件的所有活性成分，從BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫篩選芒硝活性成分，剔除重復(fù)值后剩余230 個(gè)活性成分。將柴胡、丹參、紅花成分標(biāo)記為A，柴胡、紅花、延胡索、金銀花、木香共有成分標(biāo)記為B，柴胡、紅花、延胡索、連翹、茵陳蒿、金銀花共有成分標(biāo)記為C，柴胡、紅花、連翹、金銀花共有成分標(biāo)記為D，柴胡、茵陳蒿共有成分標(biāo)記為E，大黃、紅花、連翹、桃仁、茵陳蒿、金銀花共有成分標(biāo)記為F，丹參、紅花共有成分標(biāo)記為G，丹參、紅花、連翹、金銀花共有成分標(biāo)記為H，紅花、金銀花共有成分標(biāo)記為I，連翹、木香共有成分標(biāo)記為J，連翹、延胡索共有成分標(biāo)記為K，木香、延胡索共有成分標(biāo)記為L。通過Swiss Target Prediction預(yù)測(cè)活性成分的相關(guān)靶點(diǎn)（芒硝1 個(gè)活性成分的相關(guān)靶點(diǎn)通過BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫補(bǔ)充），對(duì)結(jié)果匯總?cè)ブ睾笫Ｓ?34個(gè)靶點(diǎn)。

表1 藥物中存在的共有活性成分

2.2 AP 相關(guān)靶點(diǎn)的預(yù)測(cè) 見圖1。從Genecards、DrugBank、OMIM、TTD 疾病數(shù)據(jù)庫得到AP 靶點(diǎn)個(gè)數(shù)分別為9 072、6、185、6，匯總?cè)ブ睾蟮玫紸P 相關(guān)靶點(diǎn)1 269 個(gè)。將2.1 得到的清胰化瘀通腑方潛在靶點(diǎn)與AP 靶點(diǎn)輸入Venny 在線工具，繪制韋恩圖，并獲取清胰化瘀通腑方-AP交集靶點(diǎn)179個(gè)。

圖1 清胰化瘀方通腑方-AP交集靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 PPI 的構(gòu)建與核心靶點(diǎn)的篩選 見圖2、表2。將清胰化瘀通腑方-AP交集靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫，剔除25個(gè)游離靶點(diǎn)后得到蛋白互作信息，將其導(dǎo)入Cytoscape3.7.2 軟件，PPI 網(wǎng)絡(luò)模型見圖2A，圖中共154 個(gè)節(jié)點(diǎn)，723 條邊，節(jié)點(diǎn)面積越大、顏色越深Degree 值越高，邊越粗相關(guān)性越強(qiáng)。經(jīng)CytoNCA 計(jì)算網(wǎng)絡(luò)中各個(gè)節(jié)點(diǎn)的屬性值，并按中位數(shù)進(jìn)行2 次篩選，得到包括STAT3、PIK3R1、PIK3CA、RHOA、RAC1 等14 個(gè)靶點(diǎn)，見圖2B，靶點(diǎn)的拓?fù)浞治鰠?shù)見表2。這些靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)大、顏色深，相關(guān)性強(qiáng)，可能在清胰化瘀通腑方治療AP中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

圖2 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和核心靶點(diǎn)

表2 清胰化瘀通腑方作用AP核心靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)

2.4 GO和KEGG通路富集分析 見圖3、圖4。將179個(gè)作用靶點(diǎn)的Uniprot 號(hào)通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)換為entrez 號(hào)，然后利用R 語言根據(jù)P≤0.05 對(duì)GO 的BP（biological process）、CC（celluar component）、MF（molecular function）及KEGG 通路進(jìn)行富集分析。清胰化瘀通腑方參與的BP 條目主要包含肽基-酪氨酸磷酸化、肽基-酪氨酸修飾和激酶活性的正向調(diào)節(jié)等2 398 個(gè)；CC 條目主要包含膜筏、膜微區(qū)、黏著斑等89 個(gè)；MF 條目主要包含蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、內(nèi)肽酶活性、跨膜受體蛋白激酶活性等184 個(gè)。根據(jù)P 值分別選取BP、CC、MF 排名前10 的生物過程繪制條形圖。清胰化瘀通腑方參與的通路主要包括PI3K-Akt、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、癌癥中蛋白多糖等169 條，選取P 值排名前20的通路繪制氣泡圖。

圖3 清胰化瘀通腑方治療AP的GO分析

圖4 清胰化瘀通腑方治療AP的KEGG分析

2.5 清胰化瘀通腑方“藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 見表3、圖5。將藥物、活性成分及清胰化瘀通腑方治療AP 的作用靶點(diǎn)輸入CytoScape3.7.2中，得到“藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，并用內(nèi)置的NetworkAnalyzer 插件分析清胰化瘀通腑方治療AP的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，網(wǎng)絡(luò)圖見圖5。圖5由345個(gè)節(jié)點(diǎn)和2280 條邊組成，其中藥物用圓形節(jié)點(diǎn)表示，活性成分以六邊形表示，靶點(diǎn)以菱形表示；面積越大、顏色越深說明Degree 值越大，提示該節(jié)點(diǎn)越重要。分析結(jié)果表明，槲皮素（quercetin）的Degree 值為32，且為柴胡、紅花、延胡索、連翹、茵陳蒿、金銀花共有成分；山柰酚（kaempferol）的Degree 值為31，且為柴胡、紅花、連翹、金銀花共有成分；木樨草素（luteolin）的Degree值為30，且為丹參、紅花、連翹、金銀花共有成分；氧雜蒽酮（Onjixanthone I）的Degree 值為30；異鼠李素（isorhamnetin）的Degree 值為29，且為柴胡、茵陳蒿共有成分，所以預(yù)測(cè)這5 種藥物成分可能為清胰化瘀通腑方治療AP的核心成分。

圖5 藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

表3 清胰化瘀通腑方核心成分網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)

2.6 分子對(duì)接 見圖6、圖7。將清胰化瘀通腑方核心成分quercetin、kaempferol、luteolin、Onjixanthone I 及isorhamnetin 分別與2.3 中PPI 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治雠琶?的核心靶點(diǎn)STAT3、PIK3R1、PIK3CA、RHOA、RAC1 進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)合自由能＜-5 kcal/mol，表明受體與配體之間具有良好的結(jié)合活性，結(jié)合活性結(jié)果統(tǒng)計(jì)如圖6 所示，熱圖中顏色越紅，代表結(jié)合活性越高。并用PyMOL軟件對(duì)部分對(duì)接結(jié)果進(jìn)行圖片展示。

圖6 核心成分-核心靶點(diǎn)分子對(duì)接熱圖

圖7 核心活性成分與核心靶點(diǎn)部分對(duì)接

3 討 論

中醫(yī)學(xué)并無AP之名，但根據(jù)其臨床表現(xiàn)及疼痛部位，將其歸屬于“腹痛”“脾心痛”“胰癉”等范疇［17］，胰腺根據(jù)其部位，當(dāng)屬中醫(yī)六腑范圍，按照“六腑以通為用，以降為順”的理論，將通里攻下法貫穿本病治療的始終，采用清熱通腑、祛瘀通腑、通腑祛濕等治法，不局限于胰腺局部，而是注重于整體功能的調(diào)節(jié)，不僅可以針對(duì)AP 的病因進(jìn)行治療，同時(shí)可以有效緩解AP 引起的一系列并發(fā)癥。近年來的臨床實(shí)踐與基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，西醫(yī)常規(guī)治療與中醫(yī)藥并用的中西醫(yī)結(jié)合治療AP能取得滿意的臨床療效［18-20］。

課題組總結(jié)多年臨床經(jīng)驗(yàn)，綜合各醫(yī)家所長，認(rèn)為AP患者雖然癥狀各異，但其病機(jī)相同，皆由飲食不節(jié)、外感六淫之邪等，導(dǎo)致脾胃健運(yùn)失司，氣機(jī)升降失常，腑氣不暢，進(jìn)而逐漸演變成為以熱、濕、瘀、毒等蘊(yùn)結(jié)中焦的病變，因此，在疾病早中晚期，毒瘀互結(jié)是其主要病機(jī)，“毒”為病機(jī)，“瘀”為演變。清胰化瘀通腑方清熱利濕、化瘀通腑，以大黃、芒硝、茵陳蒿、桃仁為君，大黃、芒硝具有瀉熱存陰之功，茵陳蒿清利濕熱、桃仁活血化瘀，四藥共奏通腑泄熱、利濕化瘀、釜底抽薪之效；柴胡、厚樸、木香理氣并助硝黃通腑，丹參、紅花活血化瘀助桃仁解瘀滯共為臣藥；金銀花、連翹助大黃、芒硝清熱解毒、透邪外出，延胡索助桃仁、柴胡活血理氣止痛共為佐使藥。

本研究中網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步篩選出清胰化瘀通腑方治療AP 的活性成分主要包括槲皮素、山柰酚、木樨草素、氧雜蒽酮、異鼠李素等，且部分活性成分多味藥物的重復(fù)成分，如槲皮素重復(fù)6 次，山柰酚、木犀草素重復(fù)4 次，異鼠李素重復(fù)2 次。研究顯示，槲皮素是一類對(duì)炎癥預(yù)防有積極作用的黃酮化合物，調(diào)節(jié)各種參與致癌和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的蛋白，可通過上調(diào)miR-216b來抑制腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及p38/MAPK 信號(hào)通路從而對(duì)AP 具有保護(hù)作用［21］，并抑制表皮生長因子誘導(dǎo)的胰腺癌細(xì)胞的遷移活性［22］。山柰酚可抑制NFκB 信號(hào)通路的激活來減少炎癥因子的產(chǎn)生，減輕AP的炎癥反應(yīng)，改善AP 預(yù)后［23］，也以劑量依賴的方式抑制人胰腺癌細(xì)胞（PANC-1）增值及NF-κB、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）蛋白表達(dá)水平而誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡并抑制其侵襲［24］。木樨草素通過誘導(dǎo)血紅素加氧酶（HO-1）介導(dǎo)的抗炎和抗氧化作用來抑制NFκB 通路的活性、降低脂質(zhì)過氧化作用、降低TNF-α、丙二醛（MDA）的表達(dá)來保護(hù)胰腺組織［25-26］，也可通過抑制白細(xì)胞介素-6（IL-6）、STAT3 通路、EGFR-ras 通路和SOX9 蛋白，從而抑制因AP 誘導(dǎo)的與胰腺癌關(guān)系密切的腺泡導(dǎo)管化生、細(xì)胞增殖和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，減緩胰腺炎進(jìn)展為胰腺癌的過程［27］。異鼠李素可抑制NF-κB 信號(hào)通路的活性、減少炎癥因子的釋放來發(fā)揮抗炎作用［28］，并可降低Ras/MAPK 通路中MEK 和ERK的磷酸化水平，阻滯胰腺癌細(xì)胞系PANC-1 中的細(xì)胞生長，從而預(yù)防胰腺癌的發(fā)生［29］。由此可見，以槲皮素、山柰酚、木樨草素、異鼠李素為代表的活性成分在清胰化瘀通腑方治療AP中發(fā)揮了重要作用。

在PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中，篩選出清胰化瘀通腑方治療AP的核心靶點(diǎn)主要包括STAT3、PIK3R1、PIK3CA等。胰腺組織中STAT3 的活化與AP 的病變危重程度密切相關(guān)［30］，STAT3 在包括胰腺癌在內(nèi)的多種癌癥中呈現(xiàn)出過表達(dá)，并導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移［31］，且AP 可激活I(lǐng)L-6 和TNF-α 誘導(dǎo)的STAT3 信號(hào)通路，促進(jìn)炎癥反應(yīng)、胰腺纖維化和細(xì)胞凋亡［32］，導(dǎo)致肺損傷甚至多器官功能障礙［33-35］，抑制STAT3 活性是緩解AP 進(jìn)展的潛在靶標(biāo)［35］。PI3K 所參與的PI3K/Akt信號(hào)通路可通過調(diào)控腺泡細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、凋亡、自噬、氧化應(yīng)激等，對(duì)AP 的發(fā)生發(fā)展及治療起重要作用［36］，而分別編碼PI3K 催化亞基p110α、調(diào)節(jié)亞基p85α 的PIK3CA 和PIK3R1 均參與PI3K/Akt 通路，兩個(gè)基因的功能缺陷均可導(dǎo)致PI3K/Akt 通路異常［37-38］。富集分析作用靶點(diǎn)的結(jié)果顯示，清胰化瘀通腑方治療AP 可能通過PI3K/Akt、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、癌癥中蛋白多糖等信號(hào)通路。PI3K/Akt控制著多種信號(hào)傳導(dǎo)通路，以往的許多實(shí)驗(yàn)中已證實(shí)了其在炎癥反應(yīng)中的作用，而且它與NF-κB、IL-6 也密切相關(guān)［39］，是AP 發(fā)生發(fā)展過程中的重要信息通路。PI3K 通過影響AP 疾病過程中胰蛋白酶原激活、鈣超載和NF-κB 通路，從而對(duì)胰腺腺泡細(xì)胞的病理反應(yīng)進(jìn)行調(diào)控［40］，并通過調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子密切影響著AP 的嚴(yán)重程度［41］。激活PI3K/Akt 下游通路NF-κB 可引起腺泡細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，并誘導(dǎo)細(xì)胞自噬［42］，加強(qiáng)胰腺損傷和壞死程度［43-44］。而抑制PI3K/Akt 信號(hào)通路的激活可抑制NF-κB 通路，阻止細(xì)胞凋亡，減輕炎癥反應(yīng)［45-46］，同時(shí)阻止活性氧（ROS）的產(chǎn)生，減輕AP 中甲狀腺的損傷［47］。故推測(cè)清胰化瘀通腑方可能通過抑制PI3K/Akt 信號(hào)通路來治療AP。本研究分子對(duì)接結(jié)果顯示，槲皮素、山柰酚、木樨草素、異鼠李素與STAT3、PIK3R1、PIK3CA等均具有良好的結(jié)合活性。

本研究發(fā)現(xiàn)，清胰化瘀通腑方可能通過槲皮素、山柰酚、木樨草素等多種活性成分，調(diào)控STAT3、PIK3R1、PIK3CA 等多個(gè)靶點(diǎn)，干預(yù)PI3K/Akt 等多條信號(hào)通路，從抗炎、抗細(xì)胞凋亡、抗氧化應(yīng)激等方面來治療AP，為臨床應(yīng)用清胰化瘀通腑方治療AP 提供了科學(xué)依據(jù)。后續(xù)將在此基礎(chǔ)上繼續(xù)深入研究，進(jìn)行動(dòng)物或細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，更深層次地探討清胰化瘀通腑方的主要調(diào)控靶點(diǎn)及作用機(jī)制，以期為開發(fā)利用中醫(yī)藥治療AP提供新思路。