吳 瓊 陳啟夢 王 哲 趙梓朝 劉子琦

（1.長春理工大學(xué)光電工程學(xué)院，吉林 長春 130022；2.長春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130022；3.吉林省計量科學(xué)研究院幾何量測量室，吉林 長春 130022）

2016 年9 月，中國建立了 一座全面的國家基因庫，它可以收集、存儲和分析大量物種的基因信息，并將其應(yīng)用到醫(yī)學(xué)、氣候變化以及生物多樣性等領(lǐng)域。隨著高通量基因測序技術(shù)迅猛發(fā)展，它已成為實現(xiàn)各種研究任務(wù)的關(guān)鍵工具。其中，最重要的技術(shù)是高通量熒光顯微成像技術(shù)，它從高信息密度基因芯片中快速獲取大量熒光標記信號并將其傳輸至高分辨率相機，經(jīng)過數(shù)據(jù)分析處理最終得到準確的基因序列[1]。

盡管顯微成像技術(shù)在不斷發(fā)展，但是基因測序的快速發(fā)展導(dǎo)致測序通量已經(jīng)不能滿足市場的發(fā)展需求[2]。一方面，研究人員需要更多基因數(shù)據(jù)來破譯更多的基因密碼；另一方面，全球醫(yī)療衛(wèi)生水平提高，基因測序普及程度變大導(dǎo)致測序需求快速增長，同時基因生物學(xué)研究的不斷發(fā)展又擴展了基因測序的應(yīng)用領(lǐng)域。因此，基因測序市場的各個廠商都聚焦具有高通量測序產(chǎn)品的研發(fā)工作中[3]。

1 基因生物成像儀的基本原理

熒光顯微成像是一類使用熒光蛋白或分子標記后對特定樣本標記物成像的光學(xué)顯微成像技術(shù)，被廣泛應(yīng)用在生物、醫(yī)藥領(lǐng)域[4]。它的工作原理為當(dāng)帶有熒光探針的樣品受到特定波長的激發(fā)光照射時，熒光探針標記的樣品產(chǎn)生熒光團塊，吸收激光能量并發(fā)射熒光。這種觀察方法可以提高熒光圖像本身的真實對比度[5]。熒光顯微成像技術(shù)可以利用熒光探針對特定樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)進行標記，可以在保證生物樣本活性的同時對組織內(nèi)特定生物結(jié)構(gòu)特性進行精確識別。

如圖1 所示，以激光探針為檢測光源，將光源針孔和被檢測樣品針孔共軛，再使用激光進行三維立體掃描或?qū)晒鈽悠繁砻孢M行三維斷層立體掃描，從而得到檢測高分辨率光學(xué)切片圖像的熒光顯微鏡。

圖1 共聚焦系統(tǒng)原理圖

共聚焦系統(tǒng)具有以下3 個優(yōu)點：1） 具備三維成像能力。將樣品沿Z軸方向移動，使用共聚焦顯微鏡可以對樣品某一層進行成像，從而可以對樣本進行三維成像，最終得到三維圖像。2） 有效提高信噪比。探測針孔能夠阻止雜散光進入探測器，從而提高共聚焦系統(tǒng)的圖像對比度和準確度。3） 提高圖像分辨率。共聚焦系統(tǒng)比普通的成像系統(tǒng)具備更強的圖像分辨能力。通過與相同數(shù)值孔徑的成像系統(tǒng)對比，共聚焦系統(tǒng)的圖像分辨能力比普通成像系統(tǒng)高，最高可達普通成像系統(tǒng)的1.4 倍。在熒光共聚焦系統(tǒng)中，激發(fā)光的波長、功率以及光束本身的質(zhì)量與檢測到的熒光強度都會影響成像質(zhì)量和檢測結(jié)果。

2 光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計

為了保證光學(xué)系統(tǒng)的成像質(zhì)量，首先要選擇合適的照明方式，以實現(xiàn)在探測過程中均勻照明的功能[6]。其次，在根據(jù)共聚焦式面陣掃描基因生物成像儀光學(xué)系統(tǒng)特點選定激發(fā)光源和高精度相機后，結(jié)合激發(fā)光源的中心波長以及成像相機的分辨率等系統(tǒng)參數(shù)，從照明光路和發(fā)射光路2 個方面進行光學(xué)結(jié)構(gòu)設(shè)計，并結(jié)合基因生物成像儀的裝配質(zhì)量要求，初步搭建共聚焦式面陣掃描基因生物成像系統(tǒng)。

按照其激發(fā)發(fā)光物質(zhì)到達目標樣本時的傳播路徑將顯微成像系統(tǒng)的照明方式分為透射式照明方式和半落射式照明方式，根據(jù)照明環(huán)境又可分為明場和半暗場照明。通過對比各種照明方式的優(yōu)、缺點，最終選擇落射式明場照明方式。

探測器主要分為線陣探測器和面陣探測器。當(dāng)用于生物基因芯片檢測時，需要使用熒光亮度較強的光源，同時在不影響生物細胞的活性的情況下適當(dāng)延長曝光時間，以保證成像的清晰度。如果采用線陣探測器進行掃描成像，一次曝光就只能獲得1 行像素，為了保證足夠的熒光強度，還要保證曝光時間不能太短，那么整張載片的掃描時間就會過長，不能滿足細胞快速檢測的需求。因此，采用面陣探測器，1 次曝光就可以獲得幾千行像素，當(dāng)熒光強度、曝光時間相同時，面陣探測器比線陣探測器的掃描速度快幾千倍。面陣探測器又有CCD 和CMOS，與傳統(tǒng)的CCD 相比，CMOS 芯片具有體積小、質(zhì)量輕、集成度高以及直接數(shù)字圖像輸出的特點，因此該文選用Manta-G1236 型高分辨率成像相機。

根據(jù)面陣掃描基因生物成像儀光學(xué)系統(tǒng)的設(shè)計要求，采用透射與反射結(jié)合的光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計，高精度熒光成像系統(tǒng)采用透射式，激光顯微照明系統(tǒng)采用反射式。

激光共聚焦光學(xué)系統(tǒng)的設(shè)計主要分為照明光路設(shè)計和發(fā)射光路設(shè)計2 個部分。激光器輸出的激光束經(jīng)過由鏡組、透鏡組成的準直擴束透鏡組后變成1 束平行光束，平行光束照射到二向色鏡上，被二向色鏡反射到物鏡，經(jīng)過物鏡聚焦到樣品表面。激光會與生物組織樣本中的熒光物質(zhì)相互作用產(chǎn)生熒光，部分熒光信號會沿著入射光路相反方向通過物鏡后進入二向色鏡，再通過高通濾波片、聚焦透鏡以及探測針孔，最終到達探測器，被探測器收集并傳到計算機進行圖像處理分析，如圖2 所示。由于針孔與樣品的焦平面處形成共軛關(guān)系，因此焦平面以外的反射信號會被針孔濾除，使共聚焦顯微鏡具有一定的層析能力。光電倍增管可以放大熒光信號并轉(zhuǎn)換為電信號，然后電信號傳輸?shù)接嬎銠C，利用計算機對接收的電信號進行分析，最后得到基因芯片的圖像信息。該文設(shè)計的激光準直擴束系統(tǒng)由鏡組和透鏡組成，通過適當(dāng)?shù)馗淖兺哥R光束束腰直徑，可以大幅提高透鏡激光束照明透鏡的準直性、光束平行度。

圖2 激光共聚焦光學(xué)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖

在整個顯微成像系統(tǒng)設(shè)計中，顯微物鏡是顯微成像系統(tǒng)中最重要的光學(xué)部件，直接決定了光學(xué)系統(tǒng)的主要成像參數(shù)和成像質(zhì)量。而其光學(xué)數(shù)值孔徑尺寸又通常用來表征顯微物鏡表面本身的表面聚光能力，增強物鏡的聚光能力，從而提高物鏡的分辨率。在設(shè)計過程中，采用2 路激光作為激發(fā)光源，從而對2 種生物熒光信號進行檢測。

在一定濃度下，激發(fā)光的光強越大，激發(fā)熒光物質(zhì)所發(fā)出的熒光強度就越大[7]。常用的熒光激發(fā)光源有汞燈、氙燈、金屬鹵素?zé)?、大功率LED 以及激光器等。該文選擇比較常用的HEX 和FAM 通道作為熒光染料，并采用THORLABS Mounted LED 作為熒光激發(fā)的光源。其中，HEX 通道采用具體型號為M530L4 的綠光LED，其發(fā)射中心波長為530 nm，帶寬為26 nm。FAM 通道以具體型號為M470L4 的藍光LED作為激發(fā)光源，其發(fā)射中心波長為470 nm，帶寬僅為26 nm。

顯微成像系統(tǒng)的設(shè)計需要同時考慮光學(xué)分辨率和成像視場，再根據(jù)設(shè)計要求平衡光學(xué)分辨率和成像視場。要實現(xiàn)大視場、高分辨的顯微成像，就要在保證分辨率的情況下增加成像視場。根據(jù)設(shè)計指標和要求，計算得出光學(xué)系統(tǒng)的初始結(jié)構(gòu)，通過仿真分析并結(jié)合像差理論進行像差矯正，從而得到最終設(shè)計結(jié)果。在共聚焦成像系統(tǒng)中，光學(xué)分辨率和成像視場決定于成像物鏡的數(shù)值孔徑NA，物鏡的焦距越長，后備孔徑處入射光束角度越大，成像視場就越大。

該文選用Manta-G1236 型高分辨率成像相機，最高分辨率可達4112 px×3008 px，像元尺寸為3.45 μm，由此可以得到光學(xué)系統(tǒng)的相關(guān)參數(shù)如下：1） 像高2h。=10mm。2） 截止頻率。由（N為極限分辨率；a為像元尺寸）可知，截止頻率為

隨著顯微物鏡視場增大，其邊緣區(qū)域的圖像質(zhì)量也會受到相應(yīng)的影響。因此，一般要求線視場2y不超過物鏡焦距的1/20，即。因此，線視場y=5，系統(tǒng)焦距為200 mm。

根據(jù)設(shè)計指標和要求，計算得出光學(xué)系統(tǒng)的初始結(jié)構(gòu)，通過利用ZEMAX 進行仿真分析，再結(jié)合像差理論進行像差矯正，經(jīng)過反復(fù)優(yōu)化得到最終設(shè)計結(jié)果。光學(xué)系統(tǒng)工作距離為300 mm，物鏡放大率β為5 倍，數(shù)值孔徑NA為0.3，線視場物高2y為10 mm。

整個系統(tǒng)的像差校正分為2 步，先在前、后組透鏡中分別進行校正像差，然后再對整個光學(xué)系統(tǒng)進行綜合平衡。通過分析各個面球差、設(shè)置操作數(shù)SPHA和LONA對球差進行矯正，不斷調(diào)整各個面所占權(quán)重。同時，結(jié)合賽德爾圖和點列圖的優(yōu)化，經(jīng)過多次調(diào)整，最終達到球差公差的要求，從而滿足系統(tǒng)的設(shè)計指標參數(shù)和性能要求。

3 ZEMAX 仿真試驗

在完成初步的光學(xué)結(jié)構(gòu)設(shè)計后，利用ZEMAX 光學(xué)軟件對光學(xué)結(jié)構(gòu)進行仿真設(shè)計、誤差分析以及優(yōu)化。當(dāng)進行像差校正時，可以忽略對成像系統(tǒng)的影響相對較小的像差，例如像散、場曲、畸變以及高級像差等，將重點放在控制球差、彗差以及位置色差等對成像系統(tǒng)影響較大的像差上[8]。通過優(yōu)化可以得到如圖3 所示的光學(xué)系統(tǒng)整體結(jié)構(gòu)，通過一些像質(zhì)指標對光學(xué)系統(tǒng)的成像質(zhì)量進行評價，結(jié)果表明，該文設(shè)計的光學(xué)系統(tǒng)符合設(shè)計要求。

圖3 整體結(jié)構(gòu)三維圖

在該文設(shè)計的點列圖中，艾里斑的半徑為5.048 μm，即位于芯片上的點通過該成像裝置后被相機所收集到的像為5.048 μm，大于像元尺寸，成像效果可以滿足需求。場曲和畸變圖表征了整個光學(xué)系統(tǒng)具有較高的圖像質(zhì)量，在畸變圖分析中還可以進一步發(fā)現(xiàn)，全圖觀察的場畸變率不足1%，表示整個光學(xué)系統(tǒng)中的畸變像差得到了矯正。各個視場下的MTF曲線皆接近衍射極限，當(dāng)空間頻率為72.46 lp/mm 時，MTF模值大約為0.35，大于0.30。說明該文所設(shè)計的光學(xué)成像系統(tǒng)在對比度方面可以滿足需求。

4 面陣掃描式基因生物成像系統(tǒng)成像試驗

根據(jù)共聚焦式面陣掃描基因生物成像儀光學(xué)系統(tǒng)特點和裝配質(zhì)量需求，搭建面陣掃描基因生物成像試驗裝置。

采用微滴生成儀生成微滴，將微滴生成芯片固定到基因生物成像系統(tǒng)試驗裝置的載物臺上，打開白光光源，對微滴生成芯片進行觀察。打開FAM 通道的光源，對微滴生成芯片進行觀察，采用高精度相機采集成像結(jié)果，對圖像中所有半徑的微滴進行識別和計數(shù)[9]。

為了驗證所設(shè)計基因生物芯片微滴成像掃描系統(tǒng)能夠滿足使用要求，利用搭建的裝置對3 種條件下的基因樣本成像效果準確性進行測試。由測試結(jié)果可知，設(shè)計的基因生物芯片微滴成像掃描系統(tǒng)能夠檢測出樣本中位點的3 種突變類型，分辨率小于或等于10 μm/px，并且可以識別出陰性的基因組DNA 沒有陽性擴增點，達到了設(shè)計效果。使用搭建的試驗裝置對已經(jīng)擴增好的基因成像芯片進行成像，由成像結(jié)果可知，增大白光曝光定位液滴數(shù)變多，HEX 熒光點識別數(shù)變多，拷貝數(shù)下降了0.05%。2 個陽性樣本的最低檢出限小于10 個熒光分子/m2，樣本檢測的重復(fù)性小于或等于10%，符合前期試驗設(shè)計結(jié)果。

5 結(jié)語

該文提出一種基于落射照明方式面陣掃描基因生物成像儀光學(xué)系統(tǒng)的設(shè)計思路，建立了由共聚焦光學(xué)顯微成像和落射照明方式組成的實時面陣高通量熒光生物成像儀光學(xué)系統(tǒng)。使用面陣式掃描方法進行基因成像，與傳統(tǒng)的線掃描方法相比，該系統(tǒng)縮短了掃描時間。同時，使用共聚焦光學(xué)系統(tǒng)保證了高分辨率成像。采用2 路激光作為生物芯片的激發(fā)光源，可以自動切換平臺，實現(xiàn)對不同生物熒光信號進行檢測的功能，提高了基因熒光成像效率及精準性。采用落射式臨界照明可以更好地實現(xiàn)光學(xué)系統(tǒng)均勻照明的功能。結(jié)果表明，該文設(shè)計的基因生物成像顯微系統(tǒng)符合前期試驗設(shè)計結(jié)果，可以滿足快速高分辨率基因成像的要求，還可以為研究高精度基因生物成像技術(shù)提供技術(shù)支撐。