孟迪,邵璇,侯潤蘭,曹愛青,李玉潔,劉前程

(商丘師范學(xué)院 特色微生物資源開發(fā)與應(yīng)用河南省工程研究中心,河南 商丘 476000)

毒死蜱(Chlorpyrifos,CAS:2921-88-2)是美國陶氏化學(xué)公司研制的一種高效、中等毒性的廣譜型有機(jī)磷殺蟲殺螨劑[1].自1965年問世以來,毒死蜱迅速成為全世界生產(chǎn)和銷售量最大的殺蟲劑品種之一.據(jù)統(tǒng)計(jì),毒死蜱的全球需求量以每年10%的速度增長,到2015年,需求量超過200000 t[2].由于毒死蜱水溶解度較低(2.0 mg/L)、土壤吸附系數(shù)較高(360-31000)、且在土壤中的半衰期較長(10-240 d),長期不合理的使用對(duì)環(huán)境和生態(tài)系統(tǒng)造成潛在的毒害作用,如:破壞土壤結(jié)構(gòu)和功能、影響土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)等[2-6].此外,環(huán)境中的毒死蜱可通過呼吸、皮膚接觸、食物等途徑進(jìn)入人體并抑制體內(nèi)乙酰膽堿酯酶的活性,造成生物體中毒[2,7].

環(huán)境中殘留毒死蜱的處理方式主要包括物理降解、化學(xué)降解和生物降解[8].其中,生物降解特別是微生物降解以其具有高效、廉價(jià)、無二次污染等優(yōu)點(diǎn)成為降解毒死蜱的主要方法[5,7].目前,國內(nèi)外已篩選出多種毒死蜱降解微生物[3,5,9].然而微生物種類不同且降解效率易受環(huán)境因子的影響[5,10],因此篩選出高效降解毒死蜱的菌株,并研究不同條件對(duì)菌株降解毒死蜱的影響,對(duì)菌株在環(huán)境中的應(yīng)用具有重要的理論和實(shí)踐指導(dǎo)意義.

基于此,本研究以商丘睢縣一家廢棄的農(nóng)藥廠土壤樣品為篩選源,通過富集、分離、純化等一系列步驟篩選出高效降解毒死蜱的菌株,對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定并優(yōu)化其降解條件,為環(huán)境中毒死蜱的生物降解提供菌種資源.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

土壤樣品采集于河南省商丘市睢縣一個(gè)廢棄十多年的農(nóng)藥生產(chǎn)廠家(緯度:34.43;經(jīng)度:115.02;海拔:26.21～43.28 m).采集方法參照魏志文[11]中所述.

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基:3 g 牛肉膏,5 g 蛋白胨,5 g 氯化鈉,去離子水1000 mL,pH 7.0-7.2.

LB培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10.0,酵母粉5.0,NaCl 10.0,pH 7.0-7.2.

以毒死蜱為唯一碳源(M-1)培養(yǎng)基、以毒死蜱為唯一磷源(M-2)培養(yǎng)基和以毒死蜱為唯一碳源和磷源(M-3)培養(yǎng)基,配制方法參照孟迪[12]中所述.

1.1.3 試劑與儀器

毒死蜱(Sigma),Taq 酶(TaKaRa),DL2000 DNA Marker(TaKaRa),通用引物27F和1492R由金維智公司合成;液相所用試劑為色譜純,其他均為國產(chǎn)分析純.

高壓蒸汽滅菌器,培養(yǎng)箱,搖床,ABI Thermal Cycler 2720 PCR儀,Smart View Pro 1100凝膠成像儀,島津LC-20A高效液相色譜儀.

1.2 方法

1.2.1 毒死蜱降解菌株的篩選

a.富集馴化

稱取1 g左右土壤樣品至含有毒死蜱的富集培養(yǎng)基中,于30 ℃,180 r/min條件下,7 d一周期,并不斷提升培養(yǎng)基中毒死蜱的終濃度(25-200 mg/L)[13].

b.初篩

將富集馴化的菌液,4 ℃,8000×g離心5 min,除去上清,之后用無菌水清洗3次,并用無菌水重懸,分別涂布在M-1、M-2和M-3平板上(毒死蜱濃度為50 mg/L),30 ℃培養(yǎng)并觀察.將培養(yǎng)皿上長出的菌落在超凈工作臺(tái)中用接種環(huán)以三區(qū)劃線法接種在新的同種培養(yǎng)基中,反復(fù)4次劃線,得到較純的毒死蜱降解菌株[14].

c.復(fù)篩

將篩選到的菌株接種至相應(yīng)的液體培養(yǎng)基(毒死蜱濃度為50 mg/L)中,30 ℃,200 r/min培養(yǎng)7 d,并用高效液相色譜法檢測(cè)毒死蜱含量,計(jì)算出降解效率.以相同條件下不接入菌液但添加等量的相應(yīng)培養(yǎng)基為對(duì)照,培養(yǎng)條件同上,每個(gè)樣品重復(fù)3次[13].

1.2.2 毒死蜱降解菌株的鑒定

根據(jù)復(fù)篩結(jié)果選取高效降解毒死蜱的菌株,并參照朱云鵬[15]中所述的方法提取分離菌株的基因組.以提取的基因組為模板,27F和1492R為引物擴(kuò)增16S rRNA基因片段,擴(kuò)增片段在凝膠成像儀下成像觀察,并送至金維智公司進(jìn)行測(cè)序.測(cè)序完成后進(jìn)行序列比對(duì),然后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹.進(jìn)化樹的構(gòu)建使用MEGA6.0軟件,采用鄰近法(Neighbour-Joining)并對(duì)樹的穩(wěn)定性進(jìn)行自展值檢驗(yàn)(Bootstrap,1000個(gè)重復(fù))[16].

1.2.3 毒死蜱降解菌株的降解條件優(yōu)化

a.不同培養(yǎng)基對(duì)降解菌降解率的影響

配制3種不同的培養(yǎng)基M-1、10%LB培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基,毒死蜱終濃度為50 mg/L.取1 mL過夜培養(yǎng)的菌液接種到3種不同培養(yǎng)基中,30 ℃,180 r/min培養(yǎng)7 d.分別以相同條件下不接種菌液但添加等量的相應(yīng)培養(yǎng)基為對(duì)照,上述實(shí)驗(yàn)所有處理組和對(duì)照組均重復(fù)3次.發(fā)酵結(jié)束后,測(cè)定液體培養(yǎng)基中毒死蜱含量并計(jì)算降解效率.

b.接種量對(duì)降解菌降解率的影響

分別按1%、3%、5%、7%和9%的接種量接種至a中降解效率較高的培養(yǎng)基中,培養(yǎng)基中毒死蜱終濃度為50 mg/L,30 ℃,pH 7,180 r/min培養(yǎng)7 d.分別以相同條件下不接種菌液但添加等量的培養(yǎng)基為對(duì)照,上述實(shí)驗(yàn)所有處理組和對(duì)照組均重復(fù)3次.發(fā)酵結(jié)束后,測(cè)定液體培養(yǎng)基中毒死蜱含量并計(jì)算降解效率.

c.溫度對(duì)降解菌降解率的影響

按b中結(jié)果接種至a中降解效率較高的培養(yǎng)基中,培養(yǎng)基中毒死蜱終濃度為50 mg/L.不同溫度(15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃),pH 7,180 r/min培養(yǎng)7 d.以相同條件下不接種菌液但添加等量的培養(yǎng)基為對(duì)照,上述實(shí)驗(yàn)所有處理組和對(duì)照組均重復(fù)3次.發(fā)酵結(jié)束后,測(cè)定液體培養(yǎng)基中毒死蜱含量并計(jì)算降解效率.

d.pH值對(duì)降解菌降解率的影響

按b中結(jié)果接種至a中降解效率較高的培養(yǎng)基中,培養(yǎng)基中毒死蜱終濃度為50 mg/L.培養(yǎng)溫度根據(jù)c中結(jié)果選定,調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值分別為5、6、7、8和9,180 r/min培養(yǎng)7 d.以相同條件下不接種菌液但添加等量的培養(yǎng)基為對(duì)照,上述實(shí)驗(yàn)所有處理組和對(duì)照組均重復(fù)3次.發(fā)酵結(jié)束后,測(cè)定液體培養(yǎng)基中毒死蜱含量并計(jì)算降解效率.

1.2.4 HPLC檢測(cè)

樣品前處理和液相檢測(cè)條件參照孟迪[12]液相檢測(cè)方法.

其中,降解率方程如下:

C:對(duì)照中農(nóng)藥含量(mg/L);T:發(fā)酵液中農(nóng)藥殘留量(mg/L).

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選

經(jīng)平板初篩和搖瓶復(fù)篩,得到17株毒死蜱降解菌株,包括7個(gè)以毒死蜱為唯一碳源(M-1)生長的菌株,5個(gè)以毒死蜱為唯一磷源(M-2)生長的菌株,5個(gè)以毒死蜱為唯一碳源和磷源(M-3)生長的菌株(圖1).由圖1可知,M-1中生長的降解菌株對(duì)毒死蜱的降解效率顯著高于其他兩類(M-2和M-3),其中OP1和OP7對(duì)毒死蜱的降解效率最高,由于OP1另行研究,本文則選擇OP7進(jìn)行后續(xù)研究.

圖1 不同菌株對(duì)毒死蜱的降解能力

2.2 菌株的鑒定

菌株OP7的16S rRNA序列經(jīng)PCR擴(kuò)增、測(cè)序、Blast比對(duì)后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2),發(fā)現(xiàn)菌株OP7與糞產(chǎn)堿桿菌Alcaligenesfaecalissubsp.parafaecalis G (AJ242986)位于同一個(gè)分支,且相似度高達(dá)100%.因此,可將菌株OP7初步鑒定為Alcaligenesfaecalis,并命名為AlcaligenesfaecalisOP7.

圖2 基于16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 培養(yǎng)基類型對(duì)菌株降解毒死蜱的影響

如圖3所示,培養(yǎng)基類型對(duì)菌株OP7降解毒死蜱的影響順序?yàn)?0%LB>M-1>LB.可能是OP7在營養(yǎng)豐富的LB培養(yǎng)基中主要進(jìn)行繁殖,不利用毒死蜱;在貧瘠的M-1培養(yǎng)基中,菌株OP7為了生存利用毒死蜱,而毒死蜱降解菌株可利用的碳源需要復(fù)雜的過程,因此降解效率較低;而處于營養(yǎng)適中的10%LB,既能夠滿足菌株的生長,同時(shí)為該菌利用毒死蜱提供足夠的時(shí)間,因此降解效率最高[5,17].

圖3 培養(yǎng)基類型對(duì)菌株OP7降解毒死蜱的影響

2.4 接種量對(duì)菌株降解毒死蜱的影響

由圖4可知,不同的接種量下,菌株OP7對(duì)毒死蜱的降解率也不同,但總體表現(xiàn)為先增加后平緩的趨勢(shì).當(dāng)接種量達(dá)到3%以后,菌株對(duì)毒死蜱的降解效率基本不變.因此,選擇3%作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的接種量.

圖4 接種量對(duì)菌株OP7降解毒死蜱的影響

2.5 溫度對(duì)菌株降解毒死蜱的影響

由圖5可以看出,隨著溫度增加菌株OP7對(duì)毒死蜱的降解率呈現(xiàn)上升的趨勢(shì).研究表明在15-35 ℃的溫度范圍內(nèi),微生物降解毒死蜱的降解效率隨溫度的升高有的呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì),有的呈現(xiàn)上升趨勢(shì)[5,18-21],這可能是微生物對(duì)毒死蜱的降解主要是各種酶促反應(yīng)[22,23],而菌株OP7的主要降解酶的最適溫度可能偏高.

圖5 溫度對(duì)菌株OP7降解毒死蜱的影響

2.6 pH對(duì)菌株降解毒死蜱的影響

研究表明,大部分降解微生物對(duì)毒死蜱的最適降解pH在6-8之間[3,20,21,24],而菌株OP7對(duì)毒死蜱的降解率隨pH的增加呈現(xiàn)上升趨勢(shì)(圖6),這可能是一方面較高的堿性條件改變了毒死蜱的形態(tài)及生物毒性,從而影響菌株的降解效率[21,25],另一方面是菌株OP7的主要降解酶的最適pH偏高.

圖6 pH對(duì)菌株OP7降解毒死蜱的影響

3 結(jié) 論

本研究從商丘睢縣一家廢棄的農(nóng)藥廠土壤中分離出一株高效降解毒死蜱菌株OP7,經(jīng)16S rRNA測(cè)序分析,將其鑒定為糞產(chǎn)堿桿菌Alcaligenesfaecalis,并命名為AlcaligenesfaecalisOP7.通過對(duì)菌株OP7降解毒死蜱的條件分析,該菌株具有較強(qiáng)的抗逆性,即在較低的營養(yǎng)、較高的溫度和pH條件下均能降解毒死蜱,因此在環(huán)境中殘留毒死蜱的生物修復(fù)方面具有應(yīng)用價(jià)值.