聶 凡 楊伊默 戴 穎 周廣航 遲慶雷 加 晶，*

（1微藻生物能源與資源北京市重點實驗室，北京 100142；2國家開發(fā)投資集團(tuán)有限公司，國投生物科技投資有限公司，國投微藻生物科技中心，北京 100034）

微藻富含蛋白質(zhì)、脂類、多糖、維生素、類胡蘿卜素、微量元素等，具有豐富且全面的營養(yǎng)，在水產(chǎn)動物（魚、蝦、蟹、貝等）的養(yǎng)殖過程中發(fā)揮著不可替代的作用［1-2］。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，水產(chǎn)品對保障21 世紀(jì)的糧食安全和營養(yǎng)做出了日益重要的貢獻(xiàn)［3］。2021 年我國海水養(yǎng)殖貝類、甲殼類和魚類產(chǎn)量分別達(dá)到1 526.07、185.49 和184.38 萬噸［4］。我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)對微藻的需求量巨大，僅魚、蝦、貝苗對微藻的需求量就達(dá)到近3 萬噸，每百萬只魚苗、蝦苗和貝苗養(yǎng)殖到市售規(guī)格，分別需要食用60、1 和7 kg（干物質(zhì)）的微藻［5］。微藻在水產(chǎn)養(yǎng)殖中不可或缺，是海洋和淡水水生食物鏈中的主要食物來源，充足且優(yōu)質(zhì)的微藻是保證水產(chǎn)養(yǎng)殖成功的前提。

目前水產(chǎn)養(yǎng)殖場常用的餌料微藻主要有等鞭金藻（Isochrysisspp.）、褐指藻（Phaeodactylumspp.）、角毛藻（Chaetocerosspp.）、海鏈藻（Thalassiosiraspp.）、四爿藻（Tetraselmisspp.）等。球等鞭金藻（Isochrysisgalbana）和三角褐指藻（Phaodactylumtricornutum）由于體積小、易消化、營養(yǎng)價值高，可滿足水產(chǎn)動物在幼苗期正常生長發(fā)育的營養(yǎng)需求，具有提高育苗存活率、保證幼苗正常變態(tài)和發(fā)育、提高生長速度及體長和體重等各項性狀指標(biāo)、提高免疫力等綜合作用［6-8］，并且能夠明顯強(qiáng)化輪蟲、鹵蟲、橈足類、枝角類等次級餌料中多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）和各種維生素的含量，進(jìn)而滿足水產(chǎn)動物幼體對優(yōu)質(zhì)次級餌料的需求［9-10］，在水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物的人工養(yǎng)殖中起著重要作用。微藻培養(yǎng)需要合適的溫度、光照、水體營養(yǎng)等條件，氣候、水質(zhì)、地域等差異經(jīng)常導(dǎo)致水產(chǎn)育苗場和養(yǎng)殖場的餌料微藻培養(yǎng)失敗，進(jìn)而導(dǎo)致水產(chǎn)動物因缺少餌料而養(yǎng)殖失敗。集約化工廠化生產(chǎn)微藻藻粉儲存使用可以有效解決水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)面臨的餌料微藻供應(yīng)不穩(wěn)定問題。

微生物的數(shù)量和營養(yǎng)成分含量是衡量餌料微藻藻粉質(zhì)量的重要指標(biāo)。目前餌料微藻粉在工廠化生產(chǎn)的過程中，一般采用冷凍干燥或噴霧干燥進(jìn)行微藻生物質(zhì)的干燥，微生物含量不能達(dá)到飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求（現(xiàn)行飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)［11］中沒有藻粉類產(chǎn)品微生物具體限量要求，參考飼料用螺旋藻粉［12］和藻類及其制品［13］微生物限量標(biāo)準(zhǔn)），因此需要做滅菌處理。輻照滅菌技術(shù)在食品加工［14-15］和飼料加工［16］中被廣泛使用，其原理是利用原子能照射微生物細(xì)胞，使微生物內(nèi)部的DNA、RNA 或蛋白質(zhì)等有機(jī)分子的化學(xué)鍵斷裂、分子交聯(lián)或堿基序列改變，導(dǎo)致細(xì)菌、病毒、微生物死亡，從而達(dá)到殺菌、減少損失、延長食品或飼料貯存時間的效果［17］。輻照滅菌技術(shù)具有非常高的安全性，是一種無污染、無殘留、能耗低、成本低、殺菌完全，并能充分保留產(chǎn)品風(fēng)味和營養(yǎng)成分的滅菌方法，而且輻照射線穿透能力強(qiáng)，無需開啟包裝便可直接滅菌，自動化水平高，操作簡便快捷［18-19］。目前雖然有一些關(guān)于輻照技術(shù)處理螺旋藻粉的研究報道［20-23］，但不同餌料微藻間的營養(yǎng)成分存在較大差別，截至目前還沒有輻照對球等鞭金藻粉和三角褐指藻粉滅菌效果和營養(yǎng)價值影響的報道。鑒于此，本研究采用不同輻照劑量對這兩種藻的滅菌效果和營養(yǎng)成分的影響進(jìn)行探索，以期為微藻水產(chǎn)飼料產(chǎn)品開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種及其培養(yǎng)收獲

球等鞭金藻和三角褐指藻藻種由國投生物科技投資有限公司和中國科學(xué)院水生生物研究所項目合作篩選獲得，原初藻株從自然海域中分離獲得，藻種由國投生物科技投資有限公司藻種庫保存，藻種編號分別為GT7和GT6。

球等鞭金藻藻粉和三角褐指藻藻粉由國投生物科技投資有限公司國投微藻生物科技中心生產(chǎn)，藻種通過室外玻璃管道式光生物反應(yīng)器培養(yǎng)，再經(jīng)過離心收獲、冷凍干燥、粉碎等一系列工藝流程制成藻粉，球等鞭金藻藻粉采用錫紙袋（200 g/袋）包裝，三角褐指藻藻粉采用鐵罐（200 g/罐）包裝。

1.2 主要儀器設(shè)備與試劑

Agilent 7890B-5977A 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、Agilent 7890B氣相色譜-氫火焰離子化檢測器（gas chromatographyflame ionization detector，GC-FID），美國安捷倫科技公司；Waters Alliance 高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）系統(tǒng)，包括e2695 高效液相色譜儀及2489紫外可見光檢測器，美國沃特世公司。

脂肪酸標(biāo)品及色素標(biāo)品，美國Sigma-Aldrich 公司；改良型Bradford 蛋白分析試劑盒，生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 輻照滅菌處理

輻照裝置為北京鴻儀四方輻射技術(shù)股份有限公司的60Co-γ 輻射源，劑量設(shè)4 和7 kGy 兩個梯度，對裝箱后的袋裝球等鞭金藻藻粉（80 袋/箱）和罐裝三角褐指藻藻粉（20 罐/箱）進(jìn)行輻照滅菌。每個處理2 個重復(fù)。輻照前和輻照后的樣品分別取樣，檢測樣品的脂肪酸、色素、粗蛋白含量以及菌落總數(shù)、霉菌總數(shù)、大腸菌群和沙門氏菌。

對于球等鞭金藻藻粉，取若干袋7 kGy 劑量輻照滅菌后的球等鞭金藻藻粉樣品，置于4 ℃冰箱中，于儲存0、3、6、9、12、18 月取樣，檢測樣品的菌落總數(shù)、霉菌總數(shù)、大腸菌群和沙門氏菌。

1.4 藻粉脂肪酸定性及定量分析方法

藻粉脂肪酸提取參考Jia 等［24］的方法。利用GCMS 進(jìn)行脂肪酸的定性分析，利用GC-FID 進(jìn)行定量分析。

1.5 藻粉色素定性及定量分析方法

藻粉色素提取參考Wang 等［25］的方法。利用Alliance HPLC定性定量分析藻粉中所含色素。

1.6 藻粉粗蛋白測定方法

藻粉粗蛋白提取參考Jia 等［24］的方法。粗蛋白含量使用改良型Bradford蛋白分析試劑盒測定。

1.7 藻粉微生物測定方法

樣品微生物指標(biāo)按照相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測，檢測指標(biāo)包括細(xì)菌總數(shù)［26］、霉菌總數(shù)［27］、大腸菌群［28］和沙門氏菌［29］。

1.8 數(shù)據(jù)分析

試驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，均值的比較采用Duncan 多重比較進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 26.0完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 輻照劑量對兩種餌料微藻的滅菌效果

由表1可知，球等鞭金藻藻粉經(jīng)過4和7 kGy兩種不同劑量輻照后，細(xì)菌總數(shù)從初始值105CFU·g-1數(shù)量級水平降至102CFU·g-1，霉菌總數(shù)從初始值450 CFU·g-1降至102CFU·g-1以下，大腸菌群從初始值2 400 MPN·100 g-1降至30 MPN·100 g-1以下，沙門氏菌均未檢出，微生物含量達(dá)到飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求，說明4～7 kGy 劑量輻照可有效殺滅球等鞭金藻藻粉微生物。

表1 不同輻照劑量對兩種餌料微藻藻粉微生物數(shù)量的影響Table 1 Effects of irradiation doses on microbial number of two kinds of microalgae powder

三角褐指藻藻粉在經(jīng)過4 和7 kGy 兩種不同劑量輻照后，細(xì)菌總數(shù)從初始值106CFU·g-1數(shù)量級水平降至102CFU·g-1，霉菌總數(shù)從初始值104CFU·g-1數(shù)量級水平降至101CFU·g-1，大腸菌群從初始值2 400 MPN·100 g-1降至30 MPN·100 g-1以下，沙門氏菌均未檢出，微生物含量也達(dá)到飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求（表1）。說明4～7 kGy 輻照劑量可有效殺滅三角褐指藻藻粉的微生物。

2.2 輻照劑量對兩種餌料微藻藻粉營養(yǎng)成分的影響

2.2.1 輻照劑量對兩種餌料微藻藻粉脂肪酸的影響球等鞭金藻藻粉的主要脂肪酸組分為C14∶0、C16∶0、C18∶1cis（Δ9）、C18∶3（Δ9，12，15）、C18∶4（Δ6，9，12，15）、C22∶6（Δ4，7，10，13，16，19）（DHA）。球等鞭金藻藻粉在經(jīng)過4 kGy 劑量輻照處理后，DHA、PUFA 及總脂肪酸含量顯著升高（P<0.05）；經(jīng)過7 kGy 劑量輻照處理后，DHA、PUFA 及總脂肪酸含量均未發(fā)生顯著變化（P>0.05）（表2）。

表2 球等鞭金藻藻粉脂肪酸組分含量隨輻照劑量的變化Table 2 Variation of fatty acid content of I. galbana powder with different irradiation dose/（mg·g-1）

三角褐指藻藻粉的主要脂肪酸組分為C14∶0、C16∶0、C16∶1cis（Δ9）、C20∶5（Δ5，8，11，14，17）（EPA）。三角褐指藻藻粉經(jīng)過4 和7 kGy 兩種不同劑量輻照處理后，EPA、PUFA 及總脂肪酸含量均未發(fā)生顯著變化（P>0.05）（表3）。

表3 三角褐指藻藻粉脂肪酸組分含量隨輻照劑量的變化Table 3 Variation of fatty acid content of P. tricornutum powder with different irradiation dose /（mg·g-1）

2.2.2 輻照劑量對兩種餌料微藻藻粉色素的影響球等鞭金藻藻粉經(jīng)過4 kGy 劑量輻照處理后，巖藻黃素和葉綠素含量顯著降低，降幅為10%～15%，總類胡蘿卜素含量未發(fā)生顯著變化；經(jīng)過7 kGy劑量輻照處理后，色素各組分含量整體未發(fā)生顯著變化。三角褐指藻藻粉經(jīng)過4和7 kGy兩種不同劑量輻照處理后，葉黃素、β-胡蘿卜素和葉綠素含量較輻照前顯著降低，降幅為10%～20%，總類胡蘿卜素含量未發(fā)生顯著變化，兩種輻照劑量之間結(jié)果無顯著差異（圖1）。

圖1 輻照劑量對兩種藻粉色素含量的影響Fig.1 Effect of irradiation dose on pigment content of two kinds of microalgae powder

2.2.3 輻照劑量對兩種餌料微藻藻粉粗蛋白的影響 球等鞭金藻藻粉在經(jīng)過4 和7 kGy 兩種不同劑量輻照處理后，粗蛋白含量與輻照前相比均未發(fā)生顯著變化（P>0.05）。三角褐指藻藻粉樣品在經(jīng)過4 kGy輻照處理后，粗蛋白含量與輻照前相比未發(fā)生顯著變化（P>0.05），在經(jīng)過7 kGy 劑量輻照后，粗蛋白含量顯著升高（P<0.05）（圖2）。

圖2 球等鞭金藻和三角褐指藻藻粉藻粉粗蛋白含量隨不同輻照劑量的變化Fig.2 Variation of crude protein content of I. galbana and P. tricornutum powder with different irradiation dose

上述結(jié)果表明，4 和7 kGy 劑量的輻照處理未顯著降低球等鞭金藻藻粉和三角褐指藻藻粉總脂肪酸、總類胡蘿卜素以及粗蛋白的含量，說明4 ～7 kGy 輻照劑量未破壞球等鞭金藻藻粉和三角褐指藻粉的主要營養(yǎng)成分。

2.3 輻照滅菌藻粉中微生物在保存期內(nèi)的變化

經(jīng)7 kGy輻照處理的球等鞭金藻藻粉，在4 ℃避光條件下儲存18個月內(nèi)，細(xì)菌總數(shù)、霉菌總數(shù)、大腸菌群及沙門氏菌與起始時均無顯著差異（P>0.05），數(shù)量均符合飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求（表4）。說明7 kGy 劑量的輻照處理能對球等鞭金藻藻粉進(jìn)行有效滅菌，且滅菌后藻粉的微生物指標(biāo)在適當(dāng)儲存條件下18 個月內(nèi)滿足飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求。

表4 經(jīng)7 kGy劑量輻照處理的球等鞭金藻藻粉微生物含量18個月內(nèi)的變化Table 4 Variation of microbial number of I. galbana powder irradiated by 7 kGy within 18 months

3 討論

3.1 兩種餌料微藻藻粉輻照滅菌的有效劑量

輻照滅菌技術(shù)已應(yīng)用于食用螺旋藻粉的殺菌處理?，F(xiàn)行《NY/T 2318-2013 食用藻類輻照殺菌技術(shù)規(guī)范》［30］（適用于螺旋藻）規(guī)定食用藻類輻照殺菌的最低有效劑量為4.0 kGy，最高耐受劑量為8.0 kGy。在螺旋藻粉中，4.0～6.0 kGy劑量輻照處理可以使其微生物指標(biāo)均達(dá)到國家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)［22］，殺菌的最低有效劑量為4.0 kGy，最高耐受劑量為8.0 kGy［20］，7 kGy 劑量輻照處理可以使總帶菌量迅速降低［21］。本研究中，球等鞭金藻藻粉和三角褐指藻藻粉兩種餌料微藻在經(jīng)過4和7 kGy兩種不同劑量輻照處理后，細(xì)菌總數(shù)和霉菌總數(shù)均顯著降低（P<0.05），大腸菌群均降低至檢測限以下，沙門氏菌未檢出，微生物指標(biāo)均達(dá)到飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求。本試驗結(jié)果還表明，4～7 kGy 輻照劑量可對球等鞭金藻藻粉和三角褐指藻藻粉進(jìn)行有效滅菌，與已報道的螺旋藻粉的滅菌劑量基本一致［20-22］。

3.2 輻照滅菌對藻粉產(chǎn)品儲存的影響

微生物是導(dǎo)致產(chǎn)品變質(zhì)的重要因素，輻照處理可以有效殺滅產(chǎn)品中的微生物，從而延長產(chǎn)品保質(zhì)期［19］。經(jīng)7 kGy 劑量輻照后的螺旋藻干粉在儲存溫度為9.5～21.3 ℃的條件下，微生物指標(biāo)4個月內(nèi)無顯著變化［21］。輻照后包裝完好的食用螺旋藻粉在常溫條件下的保質(zhì)期甚至可達(dá)2 年［20］。本研究中，球等鞭金藻藻粉經(jīng)7 kGy劑量輻照處理后，細(xì)菌總數(shù)、霉菌總數(shù)、大腸菌群及沙門氏菌均達(dá)到國家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，其在4 ℃避光條件下儲存18個月后，微生物指標(biāo)無顯著變化（P>0.05），說明輻照處理后藻粉可在較長時間內(nèi)保持衛(wèi)生質(zhì)量。

3.3 輻照滅菌對兩種餌料微藻藻粉營養(yǎng)價值的影響

PUFA、類胡蘿卜素和蛋白質(zhì)等賦予微藻豐富的營養(yǎng)功能和應(yīng)用價值。PUFA 能夠提高水產(chǎn)動物的存活率、抗氧化能力、抗應(yīng)激和抵御疾病的能力［31］。微藻富含PUFA，是DHA及EPA的重要來源，可作為魚粉和魚油的良好替代源，確保水產(chǎn)養(yǎng)殖的可持續(xù)性發(fā)展。球等鞭金藻富含DHA，占其總脂肪酸含量的9.68%～12.32%［32］，本研究發(fā)現(xiàn)，球等鞭金藻藻粉經(jīng)4和7 kGy輻照處理后，DHA、PUFA和總脂肪酸含量未顯著降低（P>0.05）。三角褐指藻富含EPA，含量可達(dá)到總脂肪酸的30%［33-34］，三角褐指藻藻粉經(jīng)4 和7 kGy 輻照處理后，EPA、PUFA和總脂肪酸含量未發(fā)生顯著降低（P>0.05）。螺旋藻干粉經(jīng)6 kGy 輻照處理后，亞油酸、γ-亞麻酸、α-亞麻酸等PUFA 的相對含量未發(fā)生顯著變化［35］。以上結(jié)果均表明，4～7 kGy 劑量輻照處理不會降低藻粉的PUFA含量，不影響藻粉脂肪酸的營養(yǎng)價值。

類胡蘿卜素是微藻重要的營養(yǎng)物質(zhì)，具有提高免疫力、抗氧化及清除自由基等功能［36］。對于螺旋藻粉，其胡蘿卜素含量隨輻照劑量加大而明顯降低［23，35］。本研究中，球等鞭金藻藻粉和三角褐指藻藻粉在經(jīng)過4 和7 kGy 兩種不同劑量輻照處理后，總類胡蘿卜素含量均未發(fā)生顯著降低（P>0.05）。出現(xiàn)差異的原因可能是球等鞭金藻和三角褐指藻與螺旋藻的色素成分及含量差異較大，且本研究中輻照劑量也較低，因此類胡蘿卜素相對穩(wěn)定。

微藻的蛋白質(zhì)含量一般在40%以上，在微藻干基物質(zhì)中占比最高［37］。在0～13.5 kGy輻照劑量范圍內(nèi)，螺旋藻粉粗蛋白含量未受到顯著影響［22-23］。在0～20 kGy輻照劑量范圍內(nèi)，南美白對蝦配合飼料蛋白質(zhì)含量也未受到顯著影響［38］。本研究中，球等鞭金藻藻粉和三角褐指藻藻粉在經(jīng)過4 和7 kGy 兩種不同劑量輻照處理后，粗蛋白含量均未顯著降低（P>0.05）。以上結(jié)果均表明，在輻照處理過程中，粗蛋白較為穩(wěn)定，可以耐受較高的輻照劑量。

本試驗結(jié)果表明，在4～7 kGy 輻照范圍內(nèi)，球等鞭金藻藻粉和三角褐指藻藻粉兩種餌料微藻主要營養(yǎng)成分均未被破壞，營養(yǎng)價值不受輻照滅菌影響，輻照滅菌工藝對于這兩種餌料微藻是可行的。水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用餌料微藻種類多樣，不同水產(chǎn)動物及不同育苗時期適用的餌料微藻不同，輻照處理對其他餌料微藻營養(yǎng)價值的影響仍有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本試驗探究了60Co-γ輻照滅菌對餌料微藻球等鞭金藻藻粉和三角褐指藻藻粉微生物和營養(yǎng)成分的影響，結(jié)果表明，輻照劑量為4～7 kGy 的60Co-γ 輻照能對兩種餌料微藻藻粉進(jìn)行有效滅菌，且不影響兩種餌料藻粉的營養(yǎng)價值。本研究為球等鞭金藻藻粉和三角褐指藻藻粉兩種水產(chǎn)餌料微藻在輻照滅菌工藝參數(shù)的選擇上提供了參考，為這兩種藻粉開發(fā)為水產(chǎn)飼料的加工工藝提供了依據(jù)。