鄭美玲,韋壹靈,朱秋蓮,梁 俊,黃 博,黎保序*

(1.廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所,廣西南寧 530001;2.廣西中醫(yī)藥大學(xué),廣西南寧 530200;3.玉林市農(nóng)產(chǎn)品和農(nóng)機(jī)安全檢測中心,廣西玉林 537516;4.廣西泰格瑞科技有限公司,廣西南寧 530007;5.廣西益譜檢測技術(shù)有限公司,廣西南寧 530007;6.廣西智標(biāo)云信息科技有限公司,廣西南寧 530007)

中藥肉桂為樟科植物肉桂(CinnamomumcassiaPresl)的干燥樹皮,國內(nèi)分布在福建、廣東、廣西、云南等地,主產(chǎn)于廣西、廣東、云南[1],而廣西是國內(nèi)肉桂藥材的原產(chǎn)地和最大的產(chǎn)區(qū),主要分布在桂平、平南、防城和岑溪等地[2]。肉桂可藥食兩用,具補(bǔ)火助陽、引火歸元、散寒止痛、溫通經(jīng)脈之功效,用于治療腰膝冷痛、虛陽上浮等[3-5],肉桂中化學(xué)成分復(fù)雜,藥效作用受組分間相互影響,單一成分難以合理評(píng)價(jià)肉桂的質(zhì)量[6-7]。因此對(duì)其不同產(chǎn)地藥材藥效成分含量評(píng)價(jià)是肉桂藥材急需解決及開展的研究之一。研究證明肉桂藥材的主要活性成分是揮發(fā)油,而揮發(fā)油中主要成分為桂皮醛和肉桂酸[8]。該研究利用HPLC測定廣西不同產(chǎn)地肉桂中桂皮醛、肉桂酸、肉桂醇、鄰甲氧基肉桂醛、香豆素、2-羥基肉桂醛等6種藥效成分的含量[9],可初步確定不同產(chǎn)地肉桂中6種藥效成分含量水平;同時(shí)參照2020年版《中華人民共和國藥典》一部肉桂藥材檢測項(xiàng)下要求,結(jié)合聚類分析對(duì)收集自廣西多個(gè)產(chǎn)地的43批次肉桂藥材進(jìn)行藥效成分評(píng)價(jià),按產(chǎn)地進(jìn)行分類[6],為廣西不同產(chǎn)地肉桂質(zhì)量評(píng)價(jià)及控制提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1儀器。Ultimat 3000型高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技公司);FS-100型粉碎機(jī)(鶴壁市英泰電子電器有限公司);FR2224CN型電子天平[奧豪斯儀器(常州)有限公司,精度0.01 g];AUW120D型分析天平(日本島津公司,精度0.01 mg);SF-TGL-16M型離心機(jī)(上海菲恰爾分析儀器有限公司);KQ5200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.1.2試劑。桂皮醛(CDAA-280568,純度99%)、香豆素(CDAA-280338,純度99%)、肉桂醇(CDAA-280569,純度99%)、肉桂酸(CDAA-280566,純度99%)標(biāo)準(zhǔn)樣品(上海安普實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司);2-羥基肉桂醛(Lot6593,純度≥98%)、鄰甲氧基肉桂醛(YT20071203,純度99%)標(biāo)準(zhǔn)樣品(Stanford Analytical Chemicals Inc);乙腈(色譜純,北京邁瑞達(dá)科技有限公司);甲醇(色譜純,北京邁瑞達(dá)科技有限公司)。

1.1.3肉桂樣品。從廣西平南、桂平、岑溪、藤縣、東興、防城等不同產(chǎn)區(qū)采集 43批次肉桂藥材,規(guī)格均為桂通,所有樣品無霉壞和蟲蛀。經(jīng)廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院肉桂所李軍集高級(jí)工程師鑒定為樟科植物肉桂(CinnamomumcassiaPresl)的干燥樹皮。樣品信息見表1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的制備。分別取桂皮醛、肉桂醇、肉桂酸、香豆素、鄰甲氧基肉桂醛、2-羥基肉桂醛對(duì)照品適量,精密稱定,分別置10 mL容量瓶中,加入70% 甲醇至刻度,搖勻。分別得7 413.0、2 000.0、5 625.0、1 112.0、1 635.0、1 156.0 μg/mL 的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

分別取桂皮醛、肉桂醇、肉桂酸、香豆素、鄰甲氧基肉桂醛、2-羥基肉桂醛對(duì)照品儲(chǔ)備液100、400、100、400、400、400 μL 置于同一25 mL容量瓶中,用70% 甲醇定容,得到濃度為32.000、17.792、26.160、18.496、29.652、22.500 μg/mL的肉桂醇、香豆素、鄰甲氧基肉桂醛、2-羥基肉桂醛、桂皮醛、肉桂酸混合對(duì)照品使用液。

1.2.2樣品溶液的制備。分別取廣西不同產(chǎn)地的肉桂樣品進(jìn)行粉碎,過三號(hào)篩,得肉桂粉末。精密稱定0.5 g肉桂粉末移入50 mL離心管,加入25 mL 70%甲醇,超聲30 min(功率350 W,頻率35 kHz),超聲過程適當(dāng)換水避免溫度過高。離心,取上清液至50 mL容量瓶中。精密加入10 mL 70%甲醇溶液至有殘?jiān)碾x心管內(nèi),同法超聲處理一次,離心,將上清液轉(zhuǎn)移至同一容量瓶中,70%甲醇定容,搖勻。0.22 μm有機(jī)濾膜過濾,待測。

1.2.3色譜條件。色譜條件參照2020版《中國藥典》和相關(guān)文獻(xiàn)[10]進(jìn)行調(diào)整。色譜柱為XTERRA? MS C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相為乙腈(A)-0.05%磷酸水(B)(洗脫梯度:0～1 min,25% A;1～15 min,25%→38% A;15～35 min,38%～45% A);波長265 nm;柱溫25 ℃;流速0.8 mL/min;進(jìn)樣量10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1線性關(guān)系的考察。分別精密吸取混合對(duì)照品使用液16.8、33.0、67.0、168.0、337.0 μL加入1 mL 70%甲醇中稀釋,得到5個(gè)不同濃度的混合對(duì)照品溶液,第6個(gè)濃度直接取1 mL置進(jìn)樣瓶中,一共得到6個(gè)濃度的混合對(duì)照品溶液。按色譜條件進(jìn)樣,以濃度為橫坐標(biāo)(X)、峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪圖,得到各成分回歸方程,結(jié)果表明(表2),各成分的線性關(guān)系良好(r≥0.999 3),可用于肉桂樣品中藥效成分的測定。

表2 6種成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.1.2精密度試驗(yàn)。分別精密稱取桂皮醛、肉桂醇、肉桂酸、香豆素、鄰甲氧基肉桂醛、2-羥基肉桂醛對(duì)照品,按“1.2.1”制備,按“1.2.3”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣,進(jìn)行色譜測定。從表3可以看出,各成分相對(duì)保留時(shí)間RSD在0.06%～ 0.19%,相對(duì)峰面積RSD在0.15%～ 3.90% ,表明儀器精密度良好。

表3 6種成分含量測定精密度

2.1.3重復(fù)性試驗(yàn)。分別精密稱取桂皮醛、肉桂醇、肉桂酸、香豆素、鄰甲氧基肉桂醛、2-羥基肉桂醛對(duì)照品,按“1.2.1”制備,按“1.2.3”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣,進(jìn)行色譜測定,記錄峰面積,按峰面積計(jì)算各成分含量。從表4可以看出,各成分含量RSD在0.63%～ 4.30%,表明該測定方法重復(fù)性良好。

表4 6種成分含量測定重復(fù)性

2.1.4穩(wěn)定性試驗(yàn)。分別精密稱取桂皮醛、肉桂醇、肉桂酸、香豆素、鄰甲氧基肉桂醛、2-羥基肉桂醛對(duì)照品,按“1.2.1”制備,按“1.2.3”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣,進(jìn)行色譜測定。分別于0、2、4、8、16、24 h測定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表5～6),各成分相對(duì)保留時(shí)間RSD在0.01% ～0.10%,相對(duì)峰面積RSD均0.09%～2.20%,表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表6 6種成分含量測定相對(duì)峰面積穩(wěn)定性

2.1.5加樣回收率試驗(yàn)。精密稱取已知6種成分含量肉桂對(duì)照樣品0.25 g,平行6份。每份分別加入桂皮醛儲(chǔ)備液(7 413.0 μg/mL)2.5 mL、肉桂醇儲(chǔ)備液(2 000.0 μg/mL)1.0 mL、香豆素儲(chǔ)備液(1 112.0 μg/mL)0.1 mL、肉桂酸儲(chǔ)備液(5 625.0 μg/mL)0.5 mL、鄰甲氧基肉桂醛儲(chǔ)備液(1 635.0 μg/mL)0.5 mL、2-羥基肉桂醛儲(chǔ)備液(1 115.6 μg/mL) 0.2 mL,按“1.2.1”制備,按“1.2.3”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣,進(jìn)行色譜測定,計(jì)算各成分的回收率及 RSD值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表7),各成分不同加樣量回收率在96.8%～103.2%,RSD在1.0%～2.0%,表明該方法回收率良好。

表7 6種成分加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.2 肉桂樣本藥效成分含量測定6種藥效成分標(biāo)準(zhǔn)樣品和不同產(chǎn)地批次肉桂樣品均按“1.2.2”制備供試液,按“1.2.3”色譜條件測定。 265 nm 波長下,確定6種藥效成分標(biāo)準(zhǔn)樣品6個(gè)共有峰,根據(jù)藥效成分色譜圖對(duì)不同肉桂樣品指認(rèn)出6個(gè)色譜峰,分別是2-羥基肉桂醛、香豆素、肉桂醇、肉桂酸、桂皮醛、鄰甲氧基肉桂醛(圖1)。

注:1為2-羥基肉桂醛;2為香豆素;3為肉桂醇;4為肉桂酸;5為桂皮醛;6為鄰甲氧基肉桂醛。Note:1 is 2-hydroxyl cinnamaldehyde;2 is coumarin;3 is styrone;4 is cinnamic acid;5 is cinnamaldehyde;6 is 2-methoxy cinnamaldehyde.

從表8可以看出,廣西不同產(chǎn)地肉桂藥材中6種藥效成分含量存在一定差異,其中桂皮醛在所測成分中含量占比最大,岑溪(RG-18～RG-24)和東興地區(qū)(RG-35～RG-38)肉桂樣品中桂皮醛含量較高,平均含量分別為48.448 3、45.118 1 mg/g,其他產(chǎn)區(qū)間桂皮醛平均含量差異較小;不同產(chǎn)區(qū)肉桂中鄰甲氧基肉桂醛和香豆素的含量相差較大,鄰甲氧基肉桂醛平均含量最高在桂平產(chǎn)區(qū)(RG-10～RG-17),為3.022 8 mg/g,平均含量最低產(chǎn)區(qū)在防城區(qū)(RG-39～RG-43),僅為0.380 6 mg/g。2-羥基肉桂醛含量很低,屬于微量、痕量成分,含量在 0.006 0～0.281 6 mg/g,產(chǎn)地間平均含量差異不大。但在進(jìn)行方法學(xué)考察時(shí),因2-羥基肉桂醛含量極低,導(dǎo)致2-羥基肉桂醛的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)相對(duì)峰面積RSD均較大。

表8 不同產(chǎn)地肉桂藥效成分含量測定結(jié)果

2.3 廣西不同產(chǎn)地肉桂圖譜相似度評(píng)價(jià)及聚類分析

2.3.1不同產(chǎn)區(qū)肉桂HPLC圖譜相似度評(píng)價(jià)。試驗(yàn)結(jié)果表明,廣西不同產(chǎn)地肉桂藥材中6種藥效成分含量存在一定差異,其中桂皮醛含量占比最大,利用“中藥色譜指紋圖譜計(jì)算機(jī)相似性評(píng)價(jià)系統(tǒng) 2012 年 A 版”軟件[11],對(duì)不同產(chǎn)區(qū)肉桂HPLC圖譜進(jìn)行疊加可以直觀看出各成分在含量上有一定差異,見圖2。

注:1為2-羥基肉桂醛;2為香豆素;3為肉桂醇;4為肉桂酸;5為桂皮醛;6為鄰甲氧基肉桂醛。Note:1 is 2-hydroxyl cinnamaldehyde;2 is coumarin;3 is styrone;4 is cinnamic acid;5 is cinnamaldehyde;6 is 2-methoxy cinnamaldehyde.

2.3.2不同產(chǎn)地肉桂圖譜相似度評(píng)價(jià)及聚類分析。利用不同產(chǎn)區(qū)肉桂中6種藥效成分的測定值對(duì)產(chǎn)區(qū)進(jìn)行聚類分析[12]。使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件,采用組間聚類方法[13],結(jié)果見圖3。根據(jù)聚類分析結(jié)果,43批肉桂藥材可以分為2大類,RG-18、RG-36、RG-22歸為 Ⅱ 類,其余批次歸為 Ⅰ 類,并未呈現(xiàn)出地域間的聚類效果,原因可能是各產(chǎn)地氣候、土壤等環(huán)境因素有相似之處,引起不同產(chǎn)地間桂皮醛等6種藥效成分含量比例類似導(dǎo)致。

圖3 不同批次肉桂藥效成分聚類分析Fig.3 Cluster analysis of medicinal components of cinnamon from different batches

3 討論

該試驗(yàn)中供試品制備方法提取的廣西不同產(chǎn)地的桂皮醛含量高于《中華人民共和國藥典》規(guī)定的1.5%,且方法學(xué)考察結(jié)果均佳,適合作為同時(shí)測定桂皮醛、肉桂酸、肉桂醇、香豆素、鄰甲氧基肉桂醛、2-羥基肉桂醛含量的供試品溶液制備方法。

該試驗(yàn)測定結(jié)果與2020版《中華人民共和國藥典》肉桂項(xiàng)下桂皮醛測定結(jié)果有不同之處,桂皮醛等6種藥效成分測定結(jié)果顯示岑溪地區(qū)肉桂中桂皮醛含量最高,其次為東興地區(qū),可能與提取方式和色譜條件有關(guān),因此在測定多種成分含量時(shí)應(yīng)注意考察提取方式和色譜條件[14],為測定肉桂成分提供便捷可行的測定方法。

肉桂中化學(xué)成分豐富,除桂皮醛成分外,其他成分含量較低,中藥發(fā)揮療效是多種成分共同作用的結(jié)果,因此肉桂質(zhì)量評(píng)價(jià)需要綜合多成分含量及成分間內(nèi)在聯(lián)系來評(píng)價(jià)。